RNA Pull-down te identificeren van RNA doelen van een lang niet-coderende RNA Procedure

Samenvatting

Deze RNA pull-down methode kunt identificeren van de RNA-doelstellingen van een lang niet-coderende RNA (lncRNA). Gebaseerd op de kruising van zelfgemaakte, ontworpen anti-zin DNA oligonucleotide sondes specifiek voor deze lncRNA in een passende vaste weefsel of cellijn, hierdoor efficiënt de opname van alle RNA doelen met de lncRNA.

Samenvatting

Lang niet-coderende RNA (lncRNA), die zijn reeksen van meer dan 200 nucleotiden zonder een gedefinieerde leesraam, behoren tot de regelgevende niet-coderende-RNA's familie. Hoewel hun biologische functies grotendeels onbekend blijven, het nummer van deze lncRNAs is gestaag toegenomen en nu geschat wordt dat dat mensen meer dan 10.000 dergelijke afschriften wellicht. Sommige van deze zijn bekend te worden betrokken bij belangrijke regelgevende trajecten van genexpressie die op het transcriptional niveau, maar ook op de verschillende stappen van RNA co- en post-transcriptional rijping plaatsvinden. In de laatste gevallen moeten de RNAs, die zijn gericht door de lncRNA worden geïdentificeerd. Dat is de reden waarom is het nuttig om het ontwikkelen van een methode waardoor de identificatie van RNAs verbonden direct of indirect met een lncRNA van belang.

Dit protocol, die werd geïnspireerd door de eerder gepubliceerde protocollen waardoor het isolement van een lncRNA samen met de bijbehorende chromatine-sequenties, werd aangepast aan het isolement van de bijbehorende RNAs toestaan. Wij vastbesloten dat twee stappen cruciaal voor de efficiëntie van dit protocol zijn. De eerste is het ontwerp van specifieke anti-zin DNA oligonucleotide sondes kunnen kruisen aan de lncRNA van belang. Te dien einde, de secundaire structuur van lncRNA werd voorspeld door bioinformatics en anti-zin oligonucleotide sondes zijn ontworpen met een sterke affiniteit voor regio's die een lage kans op interne basis koppeling weergeven. De tweede cruciale stap van de procedure is afhankelijk van de kleefpoeders voorwaarden van de weefsels of gekweekte cellen die voor het behoud van het netwerk tussen alle moleculaire partners. In combinatie met hoge doorvoersnelheid RNA sequencing, bieden dit RNA pull-down-protocol de hele RNA interactome voor een lncRNA van belang.

Inleiding

Het algemene doel van de hier beschreven methode is het identificeren van de moleculaire partners RNA van een lang noncoding RNA (lncRNA). LncRNA komen overeen met de reeksen van meer dan 200 nucleotiden zonder een gedefinieerde leesraam. Sommigen van hen hebben aangetoond te worden betrokken bij de expressie genregulatie, niet alleen op het transcriptional niveau, maar ook bij de verschillende stappen van RNA co- en post-transcriptional rijping. Moleculaire partners van de lncRNA zijn in de laatste gevallen RNAs die moeten worden vermeld. Een methode voor het inschakelen van de identificatie van RNAs verbonden direct of indirect met een lncRNA van belang zou zijn essentieel om te ontwikkelen.

Methoden, eerder gepubliceerd als chromatine isolatie door RNA zuivering (Tjilpen)^1,2 en vangen hybridisatie analyse van RNA doelen (grafiek)^3,4, stellen hoge gegevensdoorvoer ontdekking van RNA-afhankelijke eiwitten en genomische bandplaatsen voor een specifieke lncRNA. In deze twee methoden, de lncRNA van belang voor het eerst naar biotinyleerd aanvullende oligonucleotides was gekruist, en het complex was geïsoleerd met behulp van daar kralen. Het belangrijkste verschil tussen deze twee technieken is gerelateerd aan het ontwerp van sondes die gericht zijn op lncRNAs. Tjilpen, de strategie geïnspireerd door RNA vis, bestond uit het ontwerpen van een pool van korte complementaire DNA oligonucleotide sondes aan de tegel van de gehele lengte van de lncRNA. Daarentegen in de grafiek, de auteurs aangepast een RNase H toewijzing assay op lncRNAs sonde plaatsen beschikbaar voor hybridisatie.

De hier voorgestelde ontwerp de anti-zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes gebruikt bioinformatics modellering van lncRNA secundaire structuur⁵ Schakel sondes met een sterke affiniteit voor regio's die weer een lage waarschijnlijkheid van interne procedure baseren in paren rangschikken. Deze procedure heeft het voordeel dat ze minder duur dan die gebaseerd op pools van tegels oligonucleotide sondes² en minder tijdrovend dan die gebaseerd op RNAse-H gevoeligheid⁴.

Want er een groeiend lichaam van bewijsmateriaal voor post-transcriptional genregulatie door lncRNAs^{6 is}, is het handig om een benadering toelatend de vang van de RNAs, die zijn het doelwit van een lncRNA te ontwikkelen. Bovendien, om het bruikbaar is voor de meeste toepassingen, is de aanpak geoptimaliseerd zowel in gekweekte cellen en weefsel extracten.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Europese Economische Gemeenschap voor de verzorging en het gebruik van proefdieren (86/609/EEG en 2010/63/UE) en onder een licentie verleend aan D. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, vergunning nr. 13-002).

1. sonde Design

1. Met behulp van de primaire opeenvolging van de lncRNA van belang, genereren de secundaire structuur op de 'RNAstructure Webserver'⁵.
   Opmerking: Op deze site, verschillende algoritmen kunnen worden gebruikt. De voorspelling van de drie hulpprogramma's die de beste resultaten geven voor de sonde ontwerpen zijn: "Fold" (laagste vrije energie structuur), "MaxExpect" (zeer waarschijnlijk basenparen) en "Probnot" (waarschijnlijk basenparen met inbegrip van pseudoknots). Deze drie analyses kunnen worden uitgevoerd en vergeleken. Andere webservers, zoals de Wenen RNA websuite⁷, kunnen ook worden gebruikt.
   1. Selecteer de regio's die een lage kans op interne basis koppeling weergeven en ontwerpen van anti-zin oligonucleotide sondes voor 25 honken schoon met een sterke affiniteit voor deze regio's.
      Opmerking: De GC-inhoud van deze sondes moeten bestaan tussen de 40 en 60%. Met behulp van een alignment search tool (Blast), zorg ervoor dat de geselecteerde anti-zin oligonucleotide sondes nucleotidesequenties in andere RNA uitgedrukt in het gekozen cel-systeem niet herkent.
2. Ook het ontwerp van een niet-specifieke DNA oligonucleotide sonde van 25 bases waarin noch affiniteit voor de lncRNA van belang noch voor andere RNA-sequenties in het genoom van belang.
3. Bestel de sondes met biotine aan de 3'-eind.
   Opmerking: Teneinde de sterische hinder, moet de afstand tussen oligonucleotide en biotine worden verhoogd met een spacer triethyleneglycerol. Voor een optimaal resultaat, en om te kunnen beoordelen van het specifieke karakter van de resultaten van de pull-down, het is aanbevolen om ontwerp 3 verschillende anti-zin oligonucleotide sondes waarna experimenteel vergelijken hun efficiëntie.

2. dwarsbinding

1. Gekweekte cel dwarsbinding
   1. Sommatolactotroph hypofyse cellen van de cultuur de GH4C1 in Ham van F10 medium aangevuld met 15% paard serum en 2% foetaal kalfsserum. De cellen groeien tot de samenvloeiing in 78,5 cm² cultuur platen. Dit correspondeert met ongeveer 1 x 10⁷ cellen.
   2. Het kweekmedium cel verwijderen uit een plaat confluente GH4C1 78,5 cm² cultuur, dan spoelen met 1 x de gemiddelde hoeveelheid fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)
   3. Herstellen van de cellen met een 1% paraformaldehyde-oplossing in PBS (10 mL voor een 78,5 cm² gerechten); deze oplossing moet vers worden bereid uit een paraformaldehyde-stockoplossing van 4%. Cross-link onder roeren gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
      Let op: Paraformaldehyde (PFA) is giftig en moet met voorzichtigheid worden behandeld.
   4. De actie paraformaldehyde doven door het toevoegen van 1/10 volume van glycine 1,25 M (1 mL per 10 mL van oplossing paraformaldehyde); agitate 5 min op RT.
   5. Gooi de media door aspiratie en spoel twee keer (5 min) met 1 X de Mediuminhoud van PBS.
   6. Toevoegen van een volume van PBS overeenkomt met 1/10de van de omvang van de media, verzamelen cellen met een cel schraper, en dan overdracht aan een centrifugebuis.
   7. Draaien op 510 g bij 4 ° C gedurende 5 min.
   8. Verwijder zoveel supernatant mogelijk.
   9. Opslaan van pellets voor onbepaalde tijd indien nodig bij-80 ° C.
2. Weefsel dwarsbinding
   1. Zet 5 mg van vers verkregen muis slijmachtige klier weefsel in een oplossing van 1% paraformaldehyde verdund in PBS (ongeveer 10 x het volume van het weefsel), doorroeren voor 10 min op RT.
   2. De actie paraformaldehyde doven door het toevoegen van een 1.25M glycine oplossing (1 mL per 10 mL paraformaldehyde oplossing) en doorroeren 5 min op RT.
   3. Negeren van de media door aspiratie en spoel tweemaal met PBS (ongeveer 10 x het volume van het weefsel). Verwijder zoveel supernatant mogelijk.
   4. Opslaan van de kruiselings gekoppelde weefsel voor onbepaalde tijd bij-80 ° C.

3. cel of weefsel Lysis

1. Bereiden de Lysis Buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.0, van 10 mM EDTA, 1% SDS aangevuld met 200 U/mL van een oplossing van de Inhibitor van de omwenteling RNAse en een cocktail van proteasen remmer 5 µL/mL).
2. Voor het verkrijgen van lysed monsters zonder voorafgaande ontdooien, resuspendeer de cel pellets of kruislings gekoppelde weefsels met deze buffer (ongeveer 1 mL per 100 mg cel pellet of weefsel). Een cel pellet 1 x 10⁷ cellen verkregen aanleiding geven tot een lysed monster ongeveer 20 mg eiwit bevat.
   Opmerking: Afhankelijk van het weefsel gebruikt, een stap van de verstoring van de mechanische moet worden toegevoegd. In dit geval is het belangrijk te voorkomen dat de verwarming van de monsters tijdens deze extra stap.

4. ultrasoonapparaat

1. Optimalisatie van de ultrasoonapparaat voorwaarden
   1. Program het ultrasoonapparaat met 30 s ON reeks 2 tot en met 5 en 30 s af.
   2. Voer tests om te optimaliseren ultrasoonapparaat voorwaarden op verdunde lysed monsters (verdunningsfactor ½ of ¼ overeenkomt met ongeveer 10 of 5 mg van eiwitten). Plaats verdund lysed monsters in het waterbad van 4 ° C en beginnen met het ultrasoonapparaat serie.
   3. Zuiveren RNAs met een RNA zuivering kit of met een RNA isolatie reagens wordt gebruikt (bijvoorbeeldTrizol).
   4. Laden van de totaliteit van gezuiverde RNA op een 1% agarose gelelektroforese in TBE buffer, check de lengte van de fragmenten van RNA. Deze lengte moet variëren tussen 200 en 800 bp.
      Opmerking: Afhankelijk van de grootte van RNA fragment, de anti-zin oligonucleotide sondes efficiëntie kan variëren. Het is dan raadzaam om de efficiëntie van de sondes onder verschillende omstandigheden van ultrasoonapparaat te controleren.
2. Ultrasoonapparaat van de lysed monsters
   1. Plaats lysed monsters overeenkomt met 20 mg van eiwitten (verkregen na stap 3.2) in de 4 ° C water bad en beginnen met het ultrasoonapparaat serie zoals in stap 4.1 geoptimaliseerd.
   2. Onmiddellijk na ultrasoonapparaat, Centrifugeer gedurende 5 min bij 12.000 g bij 4 ° C. Overdracht supernatant in nieuwe centrifuge buizen.
      Opmerking: Teneinde homogeniteit te waarborgen, repliceren supernatant kunnen worden gebundeld en herverdeeld op deze stap.

5. RNA Pull-down

1. Dag 1 – kruising stap
   1. 2 delen van hybridisatie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, SDS 1%, 15% Formamide toegevoegd gebruik) toevoegen aan het supernatant verzameld na de ultrasoonapparaat stap. Vortex.
   2. Breng 20 µL van elk monster in een centrifugebuis (input monsters) en opgeslagen bij-20 ° C.
   3. 100 pmol van biotinyleerd oligonucleotide sondes (specifieke of niet-specifiek; Zie tabel 1) toevoegen aan elk monster. Incubeer van 4 tot en met 6 h onder matig roeren op een buis rotator op RT.
   4. Voeg toe 50 µL van magnetische daar kralen aangevuld met 200 U/mL van een oplossing van de Inhibitor van de omwenteling RNAse en een cocktail van proteasen remmer 5 µL/mL.
   5. Na een nacht bebroeden onder gematigde agitatie op de buis rotator op RT.
2. Dag 2 – RNA isolatie stap
   1. Magnetische ondersteuning aanwenden om te scheiden van de parels van cel lysate, verwijder het supernatant en wassen van de kralen met 900 µL van was buffer (SDS 0,5%, SSC 2 x). Herhaal 5 keer afgewisseld met 5 min agitatie op de rotator op RT.
   2. Na de laatste wassen, decanteren in een laatste keer en voeg 95 µL van Proteinease K buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.0, van 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5% SDS) en 5 µL van proteïnase-K (20 mg/mL) aan de monsters.
   3. Op het ijs, Ontdooi de input monsters (20 μL) en voeg 75 µL van Proteinease K buffer en 5 µL van proteïnase-K (20 mg/mL).
   4. Incubeer alle monsters met proteïnase K voor 45 min bij 50 ° C dan 10 min bij 95 ° C.
   5. Chill de steekproef op het ijs gedurende 3 minuten vóór het scheiden van de parels van de RNAs met de magnetische steun. Behouden van het supernatant en negeren van de kralen.
   6. Zuiveren RNAs met een RNA zuivering kit, met inbegrip van een DNA spijsvertering stap. Winkel RNAs bij-80 ° C.
   7. Uitvoeren van omgekeerde transcriptie qPCR (RT-qPCR) met behulp van een RT kit gevolgd door qPCR met behulp van specifieke primers (tabel 1).
   8. Construeer twee DNA-bibliotheken die overeenkomt met de twee zwembaden van RNA verkregen met elk van de specifieke Neat1 sondes (tabel 1). Rangschikken op een volgende-generatie sequencing-systeem uitvoeren

Resultaten

Verschillende recente studies hebben aangetoond dat de lncRNAs een essentiële rol in bijna elke belangrijke biologisch proces spelen en dat deze rol wordt bereikt door het besturingselement voor de expressie van genen die zich zowel op de transcriptionele en de post-transcriptional niveau in dit laatste geval tonen dat RNAs kunnen het doelwit worden van lncRNAs⁶.

De lncRNA nucleaire verrijkt overvloedige transcript 1 (Neat1) is betrokken bij verschillende neuropathologies als Frontotemporale dementie, Amyotrofische laterale sclerose, of epilepsie^8,9,10, en is ook misregulated in verschillende kankers^11,12.

Deze lncRNA is ook bekend om de structurele component van specifieke nucleaire organen, de paraspeckles, en te worden betrokken bij post-transcriptional circadiane regulering van gen expressie¹³. Paraspeckles die zijn gevonden in elke celkern en worden gevormd rond niet alleen Neat1, die nodig voor hun vorming, maar ook rond de verschillende RNA-bindende eiwitten (RBP)^{14 is}, inderdaad bekend is dat ze kunnen behouden van RNA doelen binnen de nucleus¹⁵ . De vorming van paraspeckles wordt bereikt door de vereniging van de verschillende onderdelen. Deze formatie werd aangetoond dat een circadiane ritmisch patroon rijden een ritmische nucleaire eigendomsvoorbehoud RNA doelen¹³weergeven. De nucleaire retentie van RNA doelstellingen door paraspeckles kan optreden door middel van binding aan RBP of rechtstreeks via RNA/RNA vereniging, maar de omvang van de RNAs doelwit van paraspeckles moest worden bepaald. Identificeren van het RNA gericht direct of niet indirect door Neat1, een RNA pull-down protocol werd ontworpen waarmee de isolatie en de identificatie van alle Neat1 RNA doelen in gekweekte cellen zo goed zoals in weefselmonsters (Zie Figuur 1 voor een grafische presentatie van de techniek).

Het protocol was ook succesvol toegepast op de identificatie van RNA doelen van een andere lncRNA metastase verbonden Lung adenocarcinoom Transcript 1 (Malat1). Malat1 is een zeer geconserveerde en uitgesproken lncRNA gevonden in nucleaire spikkels samen met verschillende RNA splicing factoren. Malat1 is bekend worden betrokken bij de regulering van de splicing van verschillende ontluikende pre-mRNA^16,17.

Specifieke (SO) en niet-specifieke oligonucleotide (NSO) sondes werden gegenereerd met behulp van de sonde design strategie beschreven hier. Deze strategie berust op de selectie van regio's die weer een lage waarschijnlijkheid van interne base paren zoals voorspeld door de secundaire structuur van de lncRNA en het ontwerp van specifieke sondes met een sterke affiniteit voor deze regio's. Als een representatief resultaat van deze voorspellingen van bioinformatica, een beeld van de voorspelde secundaire structuur van een opeenvolging van Neat1 (nucleotiden 1.480 tot 2.000) samen met de positie van twee ontworpen zodat sondes worden gegeven in Figuur 2.

De ontworpen sondes werden omgeleid naar rat Neat1 of Malat1 voor GH4C1 gekweekte cellen en muis Neat1 voor hypofyse weefsel extracten (tabel 1). De relatieve verrijking in Neat1 of Malat1 werd berekend voor niet-specifieke en specifieke sondes ten opzichte van de invoer monsters. Figuur 3 toont de efficiëntie van de specifieke sondes naar pull-down in de rat GH4C1 hypofyse cellijn (figuur 3A) Neat1 en in muis hypofyse weefsel extracten (figuur 3B). Bij gebruik van de sonde ontwerp-protocol voor het genereren van specifieke oligonucleotide (dus) sondes gericht aan Malat1, verwijderd een efficiënte sonde werd verkregen, terwijl andere niet efficiënt genoeg was en was (figuur 4A).

Na een RNA pull-down procedure gevolgd door RT-qPCR experimenten, sommige RNAs beoordeeld met specifieke primers (tabel 1) bleken te worden gekoppeld aan Neat1 of Malat1 in de extracten van de GH4C1. De RNAs gekoppeld Neat1 in cel extracten van de GH4C1 werden ook getoond te worden geassocieerd met Neat1 in de extracten van de hypofyse weefsel. Inderdaad, na Neat1 RNA pull-down, Malat1 bleek te worden gericht op de Neat1, zowel in de lijn van de cel GH4C1 hypofyse muis weefsel extracten (figuur 5A). Samengebouwd, werd Neat1 aanzienlijk verrijkt na Malat1 RNA pull-down uitgevoerd met een specifieke sonde in GH4C1 cellen (figuur 4B). Door te wijzen op de nauwe relatie tussen de twee lncRNAs, deze resultaten stroken met de mogelijke verband met coregulering rol van Neat1 en Malat1, voorgesteld door Malat1 knock-out muizen die variaties in Neat1 RNA expressie^18, weergeven ¹⁹. de transcripties van de twee belangrijkste hypofyse hormonen, groeihormoon (Gh) (figuur 5B) en prolactine (Prl) (figuur 5C) werden aanzienlijk verrijkt na Neat1 RNA pull-down met specifieke sondes in zowel de GH4C1 cellen en de hypofyse extracten, hetgeen wijst op een mogelijke regulering van de twee hormonen door Neat1. Bij het vergelijken van de twee specifieke sondes gebruikt, is het bleek dat hun efficiëntie afhankelijk van het RNA doelwit beschouwd (figuur 5B en figuur 5C variëren kan). Deze resultaten wijzen op de noodzaak van het ontwerpen van verschillende specifieke sondes om te selecteren die niet alleen de beste efficiëntie in de verrijking van de lncRNA van de pull-down, maar ook de beste efficiëntie in de verrijking van de RNA-doelstellingen weer te geven.

De RNA pull-down methode kan ook worden gevolgd door RNA high-throughput sequentiebepaling te verkrijgen van de uitgebreide lijst met RNA doelen van een lncRNA van belang¹³. Een analyse van de RNA-seq op GH4C1 hypofyse cellen na Neat1 RNA pull-down met behulp van de twee specifieke sondes die hierboven beschreven werd uitgevoerd. Opgemerkt moet worden dat een negatieve controle met behulp van een NSO kan ook onderhevig zijn aan RNA-seq analyse, als het niveau van RNA hersteld nadat de RNA pull-down met NSO voldoende is om de bouw van bibliotheken. Dit was niet het geval in eerdere ervaring¹³. Bibliotheken die zijn gegenereerd na het gebruik van specifieke sondes zijn geanalyseerd met behulp van Tophat/Manchetknopen pijpleiding²⁰ en alleen chat-kopieën met de waarden van fragment per kilobase per miljoen van toegewezen luidt (FPKM) hoger dan 1 in aanmerking werden genomen. De lijsten verkregen met de twee specifieke sondes gericht aan Neat1 (tabel 1) werden gekruist om te beoordelen van het specifieke karakter van de resultaten. 4,268 genen werden gevonden die zijn gekoppeld aan paraspeckles, die 28 procent van de geuite afschriften in GH4C1 cellen¹³vertegenwoordigd. Overeen met resultaten die zijn verkregen met behulp van qPCR analyse (Figuur 5A-C), de transcripties van Gh, Prl en Malat1 bleken te zijn gekoppeld aan Neat1. Daarom is de RNA pull-down methode gebleken een efficiënt hulpmiddel om het verkennen van de interactie tussen lncRNAs en de bijbehorende doelen van RNA.

Figuur 1: grafische weergave van het RNA pull-down procedure. Op de eerste dag, waren cellen of weefsels kruiselings gekoppelde met paraformaldehyde lysed en sonicated vóór de kruising stap die werd uitgevoerd door het toevoegen van biotinyleerd specifieke sondes. Magnetische daar kralen werden vervolgens toegevoegd aan specifiek materiaal gescheiden van de rest van de cel lysate. Op de tweede dag, waren de kralen geïsoleerd door een magneet en meerdere keren gewassen. De stap van een de-crosslinking toegestaan herstel van RNAs die werden gezuiverd en gebruikt voor RT-qPCR of RNA-seq analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: secundaire structuur van een Neat1-reeks (nucleotide 1.480 tot 2.000) zoals voorspeld door bioinformatics resource (de RNAstructure-webserver; laagste vrije energie structuur). De structuur is gekleurd volgens de mate van waarschijnlijkheid van base-paring. De twee oligonucleotides sondes (SO1 en SO2) in het rood zijn geplaatst langs de Neat1 RNA-structuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: qPCR validatie van Neat1 verrijking versus input. qPCR valideren van de verrijking van de Neat1 tegenover ingang na Neat1 RNA pull-down door twee verschillende specifieke sondes (SO1-rn en SO2-rn voor GH4C1 cellen en SO1-mm en SO2-mm voor de hypofyse weefsel) in vergelijking met een niet-specifieke (NSO-rn voor GH4C1 cellen en NSO-mm voor hypofyse weefsel) extracten in GH4C1 rat cellen (A) en in muis hypofyse weefsel (B). Resultaten zijn gemiddelde ± SEM verkregen in 3 tot 10 experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: qPCR validatie van Malat1 en Neat1 verrijking versus input na Malat1 RNA pull-down. qPCR validatie van Malat1 (A) en Neat1 (B) verrijking versus input na Malat1 RNA pull-down door twee verschillende specifieke sondes (SO3-rn en SO4-rn) in vergelijking met een niet-specifieke een (NSO-rn) in GH4C1 rat cellen. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM verkregen in 3 experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5: qPCR validatie van Malat1, Gh, verrijking van de Prl versus input nadat Neat1 RNA pull-down. qPCR validatie van Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) verrijking versus input na Neat1 RNA pull-down met behulp van verschillende specifieke sondes in vergelijking met een niet-specifieke GH4C1 rat cellen en muis hypofyse weefsel extracten. Resultaten zijn gemiddelde ± SEM verkregen in experimenten van 3 tot en met 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

SONDE NAMEN	Sequenties
NSO-Rn	TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT
SO1-Rn	CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC
SO2-Rn	GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC
SO3-Rn	AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA
SO4-Rn	AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC
NSO-mm	GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC
SO1-mm	GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC
SO2-mm	CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA
qPCR PRIMERS:
Rattus norvegicus
Neat1	AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT
	TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC
Malat1	GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT
	TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA
Gh1	CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA
	GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT
Parti réformateur libéral	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA
Mus musculus
Neat1	TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA
	CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT
Gh1	CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA
	TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC
Parti réformateur libéral	TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT
	AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA

Tabel 1: Opeenvolgingen van DNA oligonucleotide sondes en qPCR primers

Discussie

Lang noncoding RNAs (lncRNAs) door hun aantal en de diversiteit vertegenwoordigen een groot gebied van onderzoek en de meeste van hun functies zijn nog steeds om ontdekt te worden. Veel van deze lncRNAs hebben een nucleaire localisatie en onder hen, sommige zijn betrokken bij de regelgevende trajecten van de genexpressie door middel van de mechanismen van transcriptionele of posttranscriptional. Een van de huidige uitdagingen op dit gebied is te begrijpen de relevantie van die lncRNAs in post-transcriptional verwerking van RNAs. Voor dit doel moeten RNAs gericht door lncRNAs worden geïdentificeerd. Geïnspireerd door eerdere studies gericht op de vereniging van lncRNAs met chromatine, ontwikkelden we een procedure waarmee de identificatie van de RNAs, die is gekoppeld aan een lncRNA. Het succes van dit protocol, met de naam RNA pull-down, is voornamelijk afhankelijk van twee cruciale stappen, namelijk het ontwerp van anti-zin DNA oligonucleotide sondes die moet specifiek en uitsluitend te vermengen met de lncRNA van belang, en de voorwaarden van weefsel of fixatie van de cel dat hebben voor het behoud van de integriteit van het netwerk tussen alle moleculaire partners.

Eerder gepubliceerd protocollen geboden procedures voor het isoleren van een lncRNA samen met de bijbehorende chromatine sequenties (Tjilpen^1,2, grafiek^3,4). In deze protocollen werkten verschillende strategieën te ontwerpen die de anti-zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes. In de procedure van de Tjilpen gebruikt de auteurs een pool van DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes omvat de gehele lengte van de lncRNA van belang na uitsluiting van alle redundante en niet-drugspecifieke sondes^1,2. In het protocol van de grafiek, de auteurs geïdentificeerd van de regio's van de lncRNA, die meer toegankelijk zijn voor hybridisatie en ontworpen vangen oligonucleotides, die gericht zijn op deze gebieden. Deze gebieden werden geselecteerd op basis van hun gevoeligheid RNase-H. Inderdaad, met behulp van de eigenschap van RNAse-H te hydrolyseren RNAs op sites van RNA-DNA-bindende, de oligonucleotides die aan toegankelijke sites in de lncRNA te vermengen produceren van RNA-DNA hybriden en leiden tot enzymatische splitsing van de lncRNA. De auteurs drie van deze kandidaat-capture oligonucleotides geselecteerd en gebruikt ze in een cocktail^3,-⁴.

De procedure die we gewend ontwerp de anti-zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes was dicht bij die in het DIAGRAM-protocol gebruikt, maar de kruising-beschikbare regio's van de gewenste lncRNA niet werden geselecteerd op basis van hun RNAse-H gevoeligheid, maar volgens hun lage waarschijnlijkheid van interne base paren zoals bepaald door bioinformatics modellering van de secundaire structuur van de lncRNA. Het moet opgemerkt worden dat verschillende secondaire structuren zal worden voorspeld met behulp van verschillende algoritmes, en sondes worden geselecteerd die aan beschikbaar sequenties van de lncRNA in het grootste aantal secondaire structuren voorspeld te vermengen. Dezelfde resultaten werden verkregen met een cocktail van drie ontworpen, specifieke sondes of één sonde individueel. Dit leidde tot het gebruik van twee afzonderlijke, specifieke sondes en de afweging van de positieve resultaten als die welke voor deze twee sondes gelden. Ten slotte, het is daarom raadzaam aan het begin van de ontwikkeling van de methode, voor een optimaal resultaat en om te kunnen beoordelen van het specifieke karakter van de resultaten van de pull-down, ontwerpen van 3 verschillende anti-zin oligonucleotide sondes en vervolgens om te vergelijken experimenteel hun efficiëntie, vooral omdat de efficiëntie van de sonde mag worden gewijzigd door cel lysate voorbereiding. Niettemin, de procedure van de sonde ontwerp op basis van bioinformatica modellering van lncRNA secundaire structuur die we gebruikten minder duur dan die gebaseerd op pools van tegels oligonucleotide sondes²bleef, en dit was minder tijdrovend dan de methode op basis op RNAse-H gevoeligheid⁴.

Een negatieve controle moet ook worden uitgevoerd met behulp van als negatief vastleggen oligonucleotide ofwel de zin DNA biotinyleerd oligonucleotide sondes of vervormd oligonucleotide sondes of oligonucleotides gericht tegen een ongerelateerde RNA. Vanwege het bestaan van natuurlijke antisense afschriften lncRNAs evenwel gebruik van zin oligonucleotide sondes soms ontoereikend. Ongeacht de oligonucleotide sonde geselecteerd voor de negatieve controle, is het noodzakelijk om te controleren door de explosie die het niet te met een bekende RNA vermengen doet en houd in gedachten dat deze oligonucleotide om een nog niet-geannoteerde lncRNA vermengen kunt.

De cel lysates gebruikt in deze RNA pull-down experimenten werden verkregen uit 10⁶ tot 10⁷ cellen bij het werken met gekweekte cellen en van 1 tot 10 mg bij het werken met weefsel. De voorbereiding van cel lysates dient te worden aangepast volgens het type van het weefsels of cellen gebruikt met twee belangrijke stappen die moeten worden geoptimaliseerd: namelijk de cross-linking stap waarmee de vorming van covalente bindingen tussen de lncRNA en haar moleculaire partners, en de ultrasoonapparaat stap waardoor de viscositeit door Shredder chromatine.

Het doel van de cross-linking stap is om ervoor te zorgen dat alle RNA doelen gesloten voor de lncRNA blijven door de vorming van een netwerk tussen alle moleculaire partners inducerende. Een paraformaldehyde behandeling stap die covalente bindingen tussen de lncRNA en haar partners vormen zullen kan het netwerk worden genetwerkt. In het protocol van de grafiek, werd gesuggereerd als over het geheel genomen lysate werken met nucleaire lncRNA, voor het uitvoeren van een eerste behandeling met paraformaldehyde cel en een tweede behandeling op de geïsoleerde stikstofbase breuk^3,4. We hebben vastgesteld dat deze aanvullende stap de efficiëntie van de sondes, waarschijnlijk daalde door het verminderen van de toegankelijkheid van de lncRNA in de cellen. Vandaar, de mate van filigraan door paraformaldehyde moet worden aangepast rekening houdend met de cel of weefseltype gebruikt, de lokalisatie van de lncRNA van belang, en de efficiëntie van de ontworpen sondes.

Terwijl het lysing van cellen, het chromatine is uitgebracht in de lysate en verhoogt de viscositeit; het is dan nodig is om het versnipperen van de chromatine met het ultrasoonapparaat te verhogen van de doorstroming van de monsters en vandaar het vergemakkelijken van de toegankelijkheid van de oligonucleotide sondes aan de lncRNA van belang. Ultrasoonapparaat zal echter ook verscheuren de RNAs uitgepakt met de lncRNA van belang. Het is dan belangrijk om het ultrasoonapparaat tijd op een zodanige wijze dat terwijl het efficiënt de viscositeit van de lysate vermindert, het ook mogelijk maakt dat de accumulatie van RNA fragmenten met een lengte te minimaliseren bestaat tussen 200-800 bp. Merk op dat de ultrasoonapparaat tijd zullen zeer afhankelijk van zowel de hoeveelheid en het soort weefsel of gekweekte cellen die worden gebruikt.

Tot slot, kunt de hier beschreven procedure in 2-3 dagen het vangen van de RNA-doelstellingen van een gewenste lncRNA. In combinatie met RT-qPCR, zal deze methoden toestaan op zoek naar een specifieke vereniging en de regulering van een mRNA door de gewenste lncRNA als een kandidaat-aanpak. Voor de aanpak van een genoom-brede, kunnen RNA pull-down experimenten worden geanalyseerd door hoge gegevensdoorvoer RNA-sequentiebepaling waardoor het ophalen van alle RNAs gekoppeld aan de gewenste lncRNA. Ongeacht de analytische strategie gekozen, moet de RNA pull-down procedure bieden nieuwe belangrijke kennis op RNA verordening door lncRNAs.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetische streptavidinkralen
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026
Gel elektroforese apparaat	Advance	Mupid-One	Gel elektroforese apparaat
Proteinase K	Sigma	P2308
RNA XS zuiveringskit	Macherey-Nagel	740902	RNA zuiveringskit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse remmer
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	RNA zuivering
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf buisrotator
RNA naar DNA	Thermo-Fisher	4387405	Omgekeerde transcriptie kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagens
Applied 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	qPCR apparaat
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit	Illumina	20020594	DNA bibliotheek constructie kit
Illumina NextSeq 500	Illumina	SY-415-1002	NGS systeem