Methodenartikel

Een muismodel van intestinale gedeeltelijke obstructie

DOI:

10.3791/57381

⸱

5 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada, Reno School of Medicine, 2Department of Physiology, Wonkwang Digestive Disease Research Institute and Institute of Wonkwang Medical Science, School of Medicine, Wonkwang University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intestinale obstakels zijn een gedeeltelijke of volledige verstopping van de darm die leiden ernstige buikpijn, misselijkheid tot kan, braken, en het voorkomen van de passage van ontlasting. Deze procedure voor het maken van intestinale gedeeltelijke obsructions in muizen is betrouwbaar in het bestuderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de pathologische celgroei en dood in de darm.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intestinale obstakels, die belemmeren of blokkeren van de peristaltische beweging, kunnen worden veroorzaakt door abdominale verklevingen en meest gastro-intestinale (GI) ziekten met inbegrip van tumorous gezwellen. Echter, de mobiele remodelleren mechanismen betrokken bij, en veroorzaakt door, intestinale obstakels zijn slecht begrepen. Verschillende dierlijke modellen van intestinale obstakels zijn ontwikkeld, maar de muismodel is de meeste kosten/tijd effectief. Het muismodel maakt gebruik van de chirurgische inplanting van een intestinale gedeeltelijke obstructie (PO), die een hoog sterftecijfer heeft als het niet correct wordt uitgevoerd. Daarnaast muizen ontvangen PO chirurgie niet ontwikkelen hypertrofie als een passende blokkade is niet gebruikt of niet goed geplaatst. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor PO-operatie die betrouwbare en reproduceerbare intestinale belemmeringen met een zeer lage sterftecijfer produceert. Dit protocol maakt gebruik van een chirurgisch geplaatste silicone ring rond de ileum die gedeeltelijk beweging van de spijsvertering in de dunne darm blokken. De gedeeltelijke blokkade maakt de darm worden uitgezet als gevolg van de stilstand van spijsvertering beweging. De verwijding van de darm induceert vlotte spier hypertrofie aan de mondelinge kant van de ring die geleidelijk meer dan 2 weken ontwikkelt tot het dood veroorzaakt. De chirurgische PO muismodel biedt een in vivo model van hypertrofische intestinale weefsel nuttig voor de pathologische veranderingen van intestinale cellen, met inbegrip van de zachte spiercellen (SMC), interstitiële cellen van Cajal (ICC), PDGFRα+, studie en neuronale cellen tijdens de ontwikkeling van intestinale obstructie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Intestinale obstakels zijn een gedeeltelijke of volledige verstopping in de kleine of grote darm die verteerd voedsel, vloeistoffen en gas verhindert bewegen door de darmen1. Als gevolg van de obstructie induceert de blokkade de intestinale muren te worden verdikt, vernauwing van de lumen2. Intestinale obstructie kan optreden als gevolg van de buik of bekken chirurgische ingrepen waardoor abdominale hechting weefsel vorming of GI stoornissen zoals inflammatoire darmziekten (ziekte van Crohn), diverticulitis, hernia, volvulus, strictuur, intussusception, constipatie, fecale impactie, pseudo-obstructie, kanker en tumoren3,4,5. Intestinale obstakels in deze gevallen leiden vaak tot de hypertrofie van de tunica muscularis van de darm6.

PO van de lumen induceert intestinale distentie en verhoogt de laagdikte van de gladde spieren rond de obstructie in reactie op de noodzaak om functionele peristaltiek7,8,9,10, 11,12,13. Dierlijke modellen van intestinale PO zijn ontwikkeld om te bestuderen van de gladde spier hypertrofie in muizen7ratten10, cavia's11, honden12en13 katten, die consequent ontwikkelen soortgelijke hypertrofie binnen de intestinale spieren lagen.

Een muismodel van intestinale PO is de meest kostenefficiënte manier voor het genereren en studeren intestinale obstakels in vivo. Dunne darm obstakels worden uitgevoerd bij muizen met behulp van een silicone ring operatief geplaatst rond de ileum. De PO-muizen bleek een vroege toename in het aantal cellen (hyperplasie), en een toename in spier laagdikte (hypertrofie) na PO chirurgie8,15. SMC zijn de primaire kunststof cellen die groeien binnen glad spierweefsel lagen in reactie op de hypertrofische voorwaarden14, maar andere cellen zoals ICC en PDGFRα+ cellen, die nauw verwant zijn aan SMC, ook opnieuw worden gevuld. Eerder hebben we gemeld dat de PO muizen de hypertrofie in de dunne darm, Ontwikkelen in welke SMC zijn dedifferentiated in PDGFRα+ -cellen die zeer proliferatieve7,15,16 zijn. Omgekeerd, ICC zijn gedegenereerd en binnen de hypertrophied vlotte spier-lagen verloren tijdens de ontwikkeling van intestinale obsruction7. Een ander groot voordeel van de PO-model is de capaciteit voor het opwekken van veranderingen in de darmen zenuwstelsel en teeltmateriaal neurogene motor patronen. De grote teeltmateriaal neurogene motor patroon in de kleine darm muis is de migreren motor complexe (MMC), die is neurogene en vereist geen ICC- of elektrische langzame golven17. De PO-model kan duidelijk inzicht verwerven in hoe MMC-consoles en darmen zenuwen zijn verbouwd door gedeeltelijke obstructie.

Hier stellen wij een lymfkliertest protocol voor intestinale PO chirurgie met behulp van een silicone ring. Muizen ontvangen PO chirurgie betrouwbaar produceren hypertrofie is in de tunica muscularis van de dunne darm. Binnen hypertrofische spier, zijn SMC, ICC, PDGFRα+en neuronale cellen drastisch verbouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol is goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken Comité (IACUC) op de Universiteit van Nevada-Reno (UNR) dier middelen en voldoet aan alle institutionele ethische richtsnoeren met betrekking tot het gebruik van dieren voor onderzoek.

1. dieren.

  1. Volwassen (4-6 weken oud) C57BL/6 muizen met een gewicht van tussen de 20-30 g. Huis de kolonie van laboratorium muizen in een gecentraliseerde dier faciliteit in UNR dier bronnen verkrijgen.

2. gedeeltelijke obstructie chirurgie

Opmerking: Chirurgische ingrepen worden uitgevoerd in een ruimte gewijd aan chirurgische ingrepen. Alle chirurgische instrumenten zijn gesteriliseerde met autoclaaf voorafgaand aan de operatie. Steriele chirurgische jassen en handschoenen moeten gedragen worden door al het personeel in de chirurgische kamer te allen tijde.

  1. Voorbereiding voor de chirurgische muis
    1. Controleer de verdoving uitvoeringssysteem om ervoor te zorgen de levering van zuurstof en Isofluraan is voldoende voor de procedure. Inschakelen van de zuurstof van de levering. Zet het gas debietmeter en aanpassen aan 500-1000 mL/min. plaats het dier in de zaal van de inductie en de bovenkant verzegelen.
    2. Zet de vaporizer Isofluraan tot 5%, en het dier volgen totdat het wordt ligfiets. De verdoving uitvoeringssysteem overschakelen naar de neus.
    3. Leegmaken van de kamer van de inductie van eventuele resterende gas met zuurstof, dan de inductie kamer lijn uitzetten terwijl de lijn van de neus open.
    4. Verwijderen van het dier uit de zaal en zorgvuldig plaats ophthalmic zalf op de ogen van het dier.
    5. Plaats de neus op een voorverwarmde warme pad wanneer gas blijft stromen.
    6. Wijzig de stroom van zuurstof in 100-200 mL/min, met 2-3% Isofluraan. Als het dier begint te bewegen, gentlyrestrain het dier met de neus op tot volledig verdoofd opnieuw.
    7. Toezicht op de ademhaling en de reactie op de stimulatie tijdens de procedure en het percentage van Isofluraan (2-5%) naar wens aanpassen. Dierlijke afstomping niveau wordt gecontroleerd door het gebrek aan teen snuifje reflex voordat operatie wordt uitgevoerd.
    8. Injecteren intraperitoneally geneeskunde van de pijn (buprenorfine, 1 µg/g lichaamsgewicht) vanaf de plaats van de incisie.
    9. Haar verwijdering lotion van toepassing op de buik met behulp van een schone katoenen doekje. Laat de lotion zitten gedurende 3-5 minuten op de muis, vervolgens het haar met behulp van gaas en katoenen wissers verwijderen. Herhaal deze stap totdat alle haren heeft verwijderd uit de buik van de muis.
    10. Reinig de huid met 70% ethanol met behulp van gaas en katoenen wissers. Toepassing van swabsticks of Povidon-jodium oplossing om de buik schoon te maken.
  2. Gedeeltelijke obstructie chirurgie
    1. Drape de chirurgische site met behulp van 25 x 50 cm steriel papier met een 2.5 x 2.5 cm opening in het midden voor het gebied van chirurgie. Beveilig de gordijn aan het dier door het plaatsen van steriele strips op de grenzen van de openings- en huid.
    2. Maak een ~3.0 buik incisie cm overlangs met een scalpel No. 15 blade, ervoor te zorgen dat alleen de huid wordt ingesneden en het vermijden van snijden in de musculoperitoneal laag op dit moment.
    3. Met behulp van Tang en chirurgische scharen, zorgvuldig scheiden de huid van de musculoperitoneal laag zonder een insnijding aan de musculoperitoneal laag. Nadat de lagen zijn voldoende gescheiden (ongeveer 1 cm x 4 cm), identificeren de linea alba op de musculoperitoneal laag en gesneden ~ 2 cm langs de linea alba de intraperitoneaal holte met behulp van micro-Tang en schaar bloot te stellen.
    4. Zorgvuldig opsporen en identificeren van de blindedarm. Langzaam en voorzichtig verwijderen de blindedarm uit de intraperitoneaal holte met een micro-Tang, waardoor de proximale dikke darm en ileum met de blindedarm buiten op de steriele draperen. Onmiddellijk Bevochtig de intestinale weefsel met een steriele zoutoplossing 0,9% doorweekt gaas en houden van blootgestelde weefsel bevochtigd te allen tijde terwijl ze buiten de buikholte.
    5. Opsporen en identificeren het mesenterium tussen de ileum en de proximale dikke darm. Maak een incisie (~ 1 cm) parallel aan, en net onder, de ileum, in het mesenterium en Vermijd snijden therapieën.
    6. Neem een gesteriliseerde met autoclaaf silicone ring (6 mm in de lengte, 4 mm buiten diameter, 3.5 mm inwendige diameter). Overlangs snijden om te openen de slang en het openen van de ring met een micro-Tang.
    7. Steek het ene uiteinde van de geopende ring via de incisie in de mesenterium weefsel. De ring terugkomen met een voltooide ring vorm door het ene uiteinde in contact met andere, daarmee in het ileum omgeven door de ring.
    8. Zorgen dat de siliconen ring volledig de ileum omringt, sluit de ring met hechtdraad en zorgvuldig plaats de darmen terug in de intraperitoneaal holte.
  3. Chirurgie sluiting
    1. Uitvoeren van een eenvoudige continu hechtdraad op de laag van de musculoperitoneal langs de linea alba te sluiten de musculoperitoneal wond met een absorbeerbare hechtdraad. Na voltooiing van de hechtdraad elke bloeden met steriele zoutoplossing 0,9% schoon geweekt gaas.
    2. Uitvoeren als u wilt volledig sluiten de wond, met een aparte nylon Sutuur (geologie), een eenvoudige continu hechtdraad op de huid.
    3. Nadat beide hechtingen zijn afgerond, reinig de wond met nieuwe swabstick of Povidon-Jood.
    4. Intraperitoneally injecteren antibiotica (gentamicine, 150 μl per muis op basis van 20-30 g lichaamsgewicht).
    5. Na de voltooiing van de procedure, uitschakelen van de vaporizer Isofluraan en laten het dier te ademen alleen stroomt start zuurstof tot het verkrijgen van bewustzijn.
    6. Zodra het dier wakker is, plaatst u het dier tot een aparte herstel met thermische ondersteuning tot volledig hersteld.

3. na operatie observatie.

  1. Na de voltooiing van de operatie, verplaats de dieren naar een incubator in een recovery room waar temperatuur en vochtigheid wordt geregeld. Controleren de dieren postoperatief elke 15 min voor het eerste uur vervolgens elke 30 minuten voor het tweede uur terwijl de dieren in de incubator zijn.
  2. Zodra de voorgeschreven observatie voltooid is, de dieren naar hun eigen individuele kooi en controleren ze dagelijks voor klinische indicaties van pijn18, en om ervoor te zorgen dat de chirurgische wond goed is genezing zonder enig teken van complicaties ( dehiscentie) aanwezig.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gedeeltelijke obstructie (PO) was het chirurgisch geïnduceerd in één maand oude muizen door het plaatsen van een silicone ring rond de ileum dichtbij de ileocecal sluitspier. Deze ring is gemaakt van een gedeeltelijke stagnatie in het ileum. Schijnvertoning operaties (dus) ook werden uitgevoerd zonder een ring op leeftijd/geslacht gematched muizen en deze muizen heeft geen symptomen vertonen vergelijkbaar zijn met die gevonden in PO muizen. Muizen snel hersteld van PO-operatie binnen een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We toonden aan dat muizen ontvangen van de intestinale chirurgie van de PO, consequent en reproducibly ontwikkelen intestinale vlotte spier hypertrofie, die menselijke intestinale obstructie bootst. Intestinale obstructie chirurgie hebben ontwikkeld voor verschillende dieren waaronder muizen7ratten10, cavia's11,12 en katten hond13. De muismodel van intestinale obstructie heeft tijd, kosten, grootte en f...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedank Benjamin J Weigler, D.V.M., Ph.D. en Walt Mandeville, D.V.M. (dier middelen & Campus bijwonen van dierenarts, University of Nevada, Reno) voor hun uitstekende dierlijke diensten verstrekt aan de muizen, evenals hun raadsman op chirurgische ingrepen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chirurgisch schermMedische en veterinaire benodigdhedenSMS4040”X100 yards
Onderlaken, econ, pro plusMedische en veterinaire benodigdhedenMSC28122417x24”
Iris schaarBraintree scientific, IncSC-i-130
Iris schaarVantageV95-304
Dumont elektronische & juweliers pincettenDumont98-180-3
Gevlochten resorbeerbare hechtdraadCovidien polysorbSL-5687G5-0, polyglactin
Nylon niet-resorbeerbare mono filamentAD surgicalS-N618R136-0, nylon
Chirurgisch mesjeDynarexNo.15
NaaldhouderJacobson microvascular36-1342TC8.5 inch
ScalpelgreepFlinn scientificAB1049
Microchirurgische schaarWPI503305
Petrolatum oftalmische zalfPuralube VET3.5 g
Fluriso (isofluraan)VetoneV1 502017250 ml
Steri-strip versterkte huidsluiting3MR1547
Chirurgische handschoenenMedlineMSG2270
Oorlus mondkapjeThe safety zoneRS700
Avant gaas non-woven sponzenCaringPRM25444
Chirurgische bekerAdmiral  craft OYC-2725-A422.5 oz
WattenstaafjeChloraPrep2601032% w/v Chlorhexidine  Gluconate (CHG) en 70% v/v Isopropyl Alcohol (IPA)
Wattenstaafje met katoenPuritan806-WC
BuprenorfineZoo pharmBZ80693171 mg/ml
Gentamicine sulfaatVetoneG-6336-04100 mg/ml
Snel werkende gelcrème verwijderaarVeet8111002
SpuitAHSAH01T25161 ml met naald
Siliconen ringVWR60985-7206 mm lengte, 4 mm buitendiameter, 3.5 mm binnendiameter
C57BL/6 muizenThe Jackson Laboratory4-6 weken oud

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Millat, B., Guillon, F. Physiopathology and principles of intensive care in intestinal obstructions. Rev Prat. 43, 667-672 (1993).
  2. Tonelli, P. New developments in Crohn's disease: solution of doctrinal mysteries and reinstatement as a surgically treatable disease. 1. The process is not a form of enteritis but lymphedema contaminated by intestinal contents. Chir Ital. 52, 109-121 (2000).
  3. Limsrivilai, J. Meta-analytic Bayesian model for differentiating intestinal tuberculosis from Crohn's disease. Am J Gastroenterol. 112, 415-427 (2017).
  4. Dvorak, D., Adamova, Z., Bar, T., Slovacek, R. Internal hernia as a cause of small bowel obstruction. Rozhl Chir. 96, 34-36 (2017).
  5. Massani, M., Capovilla, G., Ruffolo, C., Bassi, N. Gastrointestinal stromal tumour (GIST) presenting as a strangulated inguinal hernia with small bowel obstruction. BMJ Case Rep. , (2007).
  6. Chen, J., Chen, H., Sanders, M., Perrino, B. A. Regulation of SRF/CArG-dependent gene transcription during chronic partial obstruction of murine small intestine. Neurogastroenterol Motil. 20, 829-842 (2008).
  7. Chang, I. Y., et al. Loss of interstitial cells of Cajal and development of electrical dysfunction in murine small bowel obstruction. J Physiol. 536 (Pt 2), 555-568 (2001).
  8. Liu, D. H., et al. Voltage dependent potassium channel remodeling in murine intestinal smooth muscle hypertrophy induced by partial obstruction. PLoS One. 9 (2), e86109(2014).
  9. Guo, X., et al. Down-regulation of hydrogen sulfide biosynthesis accompanies murine interstitial cells of Cajal dysfunction in partial ileal obstruction. PLoS One. 7, e48249(2012).
  10. Yang, J., Zhao, J., Chen, P., Nakaguchi, T., Grundy, D., Gregersen, H. Interdependency between mechanical parameters and afferent nerve discharge in hypertrophic intestine of rats. Am J Physiol-Gastr L. 310, G376-G386 (2016).
  11. Zhao, J., Liao, D., Yang, J., Gregersen, H. Biomechanical remodeling of obstructed guinea pig jejunum. J Biomech. 43, 1322-1329 (2010).
  12. Bowen, E. J., et al. Duodenal Brunner's glade adenoma causing chronic small intestinal obstruction in a dog. J Small Anim Pract. 53, 136-139 (2012).
  13. Bettini, G., et al. Hypertrophy of intestinal smooth muscle in cats. Res Vet Sci. 75, 43-53 (2003).
  14. Macdonald, J. A. Smooth muscle phenotypic plasticity in mechanical obstruction of the small intestine. J Neurogastroenterol Motil. 20, 737-740 (2008).
  15. Ha, S. E., et al. Transcriptome analysis of PDGFRα+ Cells identifies T-types Ca2+ channel CACNA1G as a new pathological marker for PDGFRα+ cell hyperplasia. PLoS One. 12, e0182265(2017).
  16. Park, C., et al. Serum response factor is essential for prenatal gastrointestinal smooth muscle development and maintenance of differentiated phenotype. J Neurogastroenterol Motil. 21, 589-602 (2015).
  17. Spencer, N. J., Sanders, K. M., Smith, T. K. Migrating motor complexes do not require electrical slow waves in the mouse small intestine. J Physiol. 553, 881-893 (2003).
  18. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, 447-449 (2010).
  19. Terez, S. D., Notari, L., Sun, R., Zhao, A. Mechanisms of smooth muscle responses to inflammation. Neurogastroenterol Motil. 24, 802-811 (2012).
  20. Chen, W., et al. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn's fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. J Crohns Colitis. 11, 92-104 (2017).
  21. Huizinga, J. D., Chen, J. H. Interstitial Cells of Cajal: Update on Basic and Clinical Science. Curr Gastroenterol Rep. 16, 363(2014).
  22. Jirkof, P., Touvieille, A., Cinelli, P., Arras, M. Buprenorphine for pain relief in mice: repeated injections vs sustained-release depot formulation. Lab Animal. 49, 177-187 (2015).
  23. Spencer, N. J., Dinning, P. J., Brookes, S. J., Costa, M. Insights into the mechanisms underlying colonic motor patterns. J Physiol. 594, 4099-4116 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Implantatie van siliconenringhypertrofie van gladde spiercelleninterstiti le cellen van CajalPDGFR alfa cellenanalyse van gastro intestinaal weefselprotocol voor chirurgische procedurein vivo modelcellulaire remodellering

Gerelateerde artikelen