Methodenartikel

Adeno-associated Virus-gemedieerde transgenic expressie in genetisch gedefinieerde neuronen van het ruggenmerg

18K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57382

⸱

12 mei 2018

 ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, 2Institute of Pharmaceutical Sciences, Swiss Federal Institute (ETH) Zurich

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Intraspinal injectie van recombinase afhankelijk recombinante adeno-associated virus (rAAV) kan worden gebruikt om te manipuleren alle genetisch gelabelde celtype in het ruggenmerg. Hier beschrijven we hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg. Deze techniek maakt functionele ondervraging van het subtype gemanipuleerde neuron.

Samenvatting

Selectieve manipulatie van spinale neuronale subpopulaties is hoofdzakelijk bereikt door twee verschillende methoden: 1) Intersectional genetica, waarbij dubbele of driedubbele transgene muizen worden gegenereerd met het oog op een selectieve uitdrukking van een verslaggever of effector gen (bijvoorbeelduit de Rosa26 locus) in de gewenste spinale bevolking. 2) intraspinal injectie van Cre-afhankelijke recombinante adeno-associated virus (rAAV); Hier worden Cre-afhankelijke AAV vectoren codering voor de verslaggever of effector gen keuze ingespoten in het ruggenmerg van muizen uiting van Cre recombinase in de gewenste neuronale subpopulatie. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van Cre-afhankelijke rAAV vectoren en hoe transduce van neuronen in de dorsale Hoorn van het lumbale ruggenmerg segmenten L3-L5 met rAAVs. Als de lumbale spinale segmenten L3-L5 zijn geïnnerveerd door die perifere sensoriële neuronen die sensorische informatie van de hindlimbs zenden, kunnen spontane gedrag en reacties op zintuiglijke tests toegepast naar de stuk ipsilaterale aan de zijkant van de injectie worden geanalyseerd om de functie van de gemanipuleerde neuronen in de sensorische verwerking ondervragen. We bieden voorbeelden van hoe deze techniek kan worden gebruikt voor het analyseren van genetisch gedefinieerd deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen. De belangrijkste voordelen van virus-gemedieerde transgenic expressie in transgene muizen Cre in vergelijking met klassieke verslaggever transgenic muis-geïnduceerde expressie zijn de volgende: 1) verschillende Cre-afhankelijke rAAVs codering van verschillende verslaggever of effector eiwitten kunnen in een enkele Cre transgene lijn, dus het overwinnen van de noodzaak te creëren verschillende meerdere transgene muis lijnen geïnjecteerd. 2) intraspinal injectie beperkt manipulatie van Cre-uiten cellen op de injectieplaats en de tijd na de injectie. De belangrijkste nadelen zijn: 1) de genexpressie verslaggever van rAAVs is meer variabele. 2) chirurgie is vereist voor de transduce van het ruggenmerg neuronen van belang. Welke van de twee methoden meer geschikt is, hangt af van het neuron bevolking en onderzoek vraag worden aangepakt.

Inleiding

Het dorsale ruggenmerg is essentieel voor de uitwisseling van informatie tussen de periferie van het lichaam en de hersenen. Zintuiglijke prikkels zoals warmte, koude, aanraking, of schadelijke stimuli worden gedetecteerd door gespecialiseerde perifere neuronen, die deze informatie voor de neuronen van de dorsale Hoorn van het ruggenmerg. Hier, een complex netwerk van remmende en excitatory interneuronen moduleert en uiteindelijk de sensorische informatie relais via spinale projectie neuronen te supraspinal1,2sites. De berekeningen uitgevoerd door spinale inter- en projectie neuronen gate zintuiglijke informatie, dus bepalen welke informatie wordt onderdrukt of doorgegeven bij welke intensiteit. Wijzigingen in de integratie van sensorische stimuli, zoals een gewijzigd evenwicht tussen inhibitie en excitatie, kunnen leiden tot sensorische stoornissen zoals overgevoeligheid of allodynia (pijnlijke gewaarwordingen na normaal niet-pijnlijke stimulatie). Deze wijzigingen worden beschouwd als dat de onderliggende oorzaak van verschillende chronische pijn staat3,4. Spinale circuits zijn dus van groot belang zijn bij de verwerking van zintuiglijke en bijgevolg in de perceptie van een organisme milieu en zelf. Met de recente komst en combinatie van moleculaire, genetische, en chirurgische technieken waarmee de precieze manipulatie van genetisch geïdentificeerde spinale neuron subpopulaties, beginnen wetenschappers nu te begrijpen van de onderliggende spinale circuits verantwoordelijk voor de verwerking van de afzonderlijke zintuiglijke modaliteiten.

Intraspinal injectie van rAAV in wild-type of transgene muizen heeft bijgedragen aan de manipulatie, analyse en begrip van de functie van specifieke deelverzamelingen van ruggenmerg neuronen5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. deze techniek maakt het mogelijk de levering van marker eiwitten (zoals GFP / GFP fusion eiwitten), verslaggever eiwitten (zoals GCaMP) of effector eiwitten (zoals bacteriële toxines, channelrhodopsin of Farmacogenetische receptoren) in een ruimtelijk beperkte wijze ruggenmerg neuronen. Lokale injectie van Cre-afhankelijke rAAVs in transgene muizen uiting van Cre recombinase in een specifieke subset van ruggenmerg neuronen kan de specifieke analyse van de respectieve neuronale bevolking. We hebben gebruikt deze techniek te etiketteren, lasertherapie, remmen of spinale glycinergic neuronen die aantonen dat zij zijn een essentieel onderdeel van de spinal gate beheersing van pijn en jeuk van transmissie7activeren. In deze experimenten, intraspinal injectie van Cre-afhankelijke rAAV in GlyT2::Cre muizen ingeschakeld de selectieve manipulatie van glycinergic neuronen in de lumbale ruggemerg. Gelijktijdige manipulatie van supraspinal circuits waarin glycinergic neuronen cruciaal voor de overleving van het dier kan worden vermeden.

Terwijl een intraspinal injectie van rAAVs infectie aan de plaats van injectie beperkt, kan virale transductie optreden niet alleen in lokale neuronen, maar ook in neuronen die verbinding met de injectieplaats via axonale projecties maken. De laatste wordt vaak gebruikt om trace CNS gebieden leveren van neuronale informatie aan een bepaalde kern in de hersenen. De besmetting van axonale projecties, maar ook kan een storende factor wanneer een gedefinieerde populatie van neuronen zal worden bestudeerd op een bepaalde site. Om deze kwesties te behandelen, hebben we onlangs een uitgebreide analyse van AAV serotypen en expressie cassettes te identificeren serotypes en initiatiefnemers die kunnen worden gebruikt om te minimaliseren of maximaliseren retrograde transductie uitgevoerd. In het kader van dit specifieke onderzoek in spinale circuits geanalyseerd wij het vermogen van verschillende serotypes en initiatiefnemers om retrogradely transduce neuronen in de achterwortelganglia, bevatten (DRG), de rostraal ventromediale medulla (RVM) en de Somatosensorische cortex 12. de techniek beschreven in dit protocol kan daarom worden gebruikt voor het analyseren van ruggenmerg neuronen op de injectieplaats of analyseren van projectie neuronen die inbreng op de ingespoten site van het ruggenmerg. In het protocol beschreven hier, worden drie injecties van rAAV in de linker kant van het lumbale ruggemerg uitgevoerd zodat transductie van neuronen in de drie lumbale segmenten (L3-L5). De L3-L5 segmenten ontvangen de meerderheid van de sensorische input het stuk ipsilaterale om de injectieplaats. Wij laten zien dat functionele manipulatie van genetisch gelabelde neuronen in L3-L5 voldoende te roepen robuuste gedragsveranderingen, waardoor het functionele bewijs voor de functie van de circuit van dergelijke een genetisch gelabelde neuron-subtype.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Zwitserse kantonnale Veterinair Bureau (Zürich) en zijn overeenkomstig en naleving van alle relevante regelgevend en institutioneel richtsnoeren.

Opmerking: Alle materialen samen met respectievelijke fabrikanten en/of leveranciers worden weergegeven in de Tabel van materialen.

1. generatie van Cre-afhankelijke AAV vectoren

Opmerking: Een verscheidenheid van Cre-afhankelijke vectoren met verschillende initiatiefnemers kan worden gekocht (Zie Tabel van materialen) of, als de gewenste expressie constructie niet beschikbaar is, het kan worden gegenereerd door aanpassing van bestaande AAV constructies. Opmerking, de promotor en serotype kunnen een invloed hebben op de verspreiding van virale transductie (Zie 12). Het eerste deel van dit protocol beschrijft kort de generatie van twee verschillende Cre-afhankelijke AAV vectoren geschikt voor winst en verlies van functie experimenten, respectievelijk.

  1. Farmacogenetische activering (winst van functie)
    1. Bestel pAAV.hSyn.flex.hM3D (Gq)-mCherry (Zie Tabel of Materials) voor ontwerper receptoren uitsluitend geactiveerd door "designer drugs" (DREADD)-gemedieerde activering.
    2. Na ontvangst van de bacteriële steek cultuur, streak uit bacteriën op LB platen (bacteriologische-grade agar opgelost in vloeistof Luria Bertani) aangevuld met de juiste antibioticum. Incubeer gedurende een nacht bij 37 ° C en een één kolonie te halen op de volgende dag.
      Opmerking: Plasmiden met AAV vector genoom kunnen unstable en recombinatie van het virale genoom, vooral binnen de virale omgekeerde terminal herhaalt (ITR), kan zich voordoen tijdens de versterking in E. coli. Wij stellen voor met behulp van recA-deficiënte /-onderdrukt dergelijke stammen als MDS42 of Stbl3 om te voorkomen dat binnen de plasmide die het genoom van AAV recombinatie.
    3. Versterken van de bacteriën na de instructies van de leverancier van de gekozen DNA-Maxi-Kit en hoge kwaliteit plasmide DNA met een commercieel beschikbare DNA-Maxi-Kit te bereiden (b.v., Zie Tabel van materialen). Uitvoeren van een kwaliteitscontrole van de plasmide DNA bereiding door te verifiëren van de integriteit en de identiteit van de plasmide DNA via beperking digest van een aliquoot deel van de plasmide DNA.
      Opmerking: Er zijn erkenning sites voor de beperking endonuclease SmaI binnen de ITRs. Een samenvatting van de SmaI in de kwaliteitscontrole om te controleren of de integriteit van de ITRs opnemen.
    4. Het DNA verzenden een virale vector kern faciliteit om het produceren van hoge kwaliteit rAAV.
      Opmerking: Hoge titer, virale preps van hoge kwaliteit zijn van cruciaal belang voor het vermijden van verstorende fenotypen veroorzaakt door verontreinigingen in de virale prep. Wij adviseren daarom hebbend van de rAAV van keuze geproduceerd in een gevestigde vector kern faciliteit, tenzij de AAV-productie goed ingeburgerd in het laboratorium is.
  2. Ablatie (verlies van functie)
    Opmerking: Bacteriële toxines of toxine-receptoren kunnen worden gebruikt om te bemiddelen cel ablatie of neuronale zwijgen. Wij hebben pAAV.EF1α.flex.DTA aan uitdrukkelijke difterie toxine fragment A (DTA) gegenereerd op een Cre-afhankelijke manier.
    1. Voor het genereren van een Cre-afhankelijke virale vector, kies een Cre-afhankelijke vector met een geschikt promotor (bijvoorbeeld, pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP). Versterken van de codering volgorde van keuze (bijvoorbeeldDTA) door de polymerase-kettingreactie met inleidingen die AscI en NheI of compatibel beperking endonuclease erkenning sites in hun overhangen opnemen (Zie Foster et al. 7)
    2. Beperking digests van de vector DNA met standaard moleculaire biologietechnieken, uitvoeren (pAAV.EF1α.FLEX.hChR2(H134R)-eYFP) en van de PCR-versterkte plaats (NheI-DTA-AscI) met de beperkingsendonucleases AscI en NheI. De gezuiverde fragmenten afbinden.
    3. Transformeren van de reactie van de afbinding in geschikte bacteriën, volgens het protocol gegeven door de leverancier van de bevoegde bacteriën van keuze en de bacteriën op LB platen plaat. Gebruik van recA-deficiënte /-onderdrukt stammen, zoals MDS42 of Stbl3, voor het klonen en verdere versterking van de plasmide DNA.
    4. Op de dag na de transformatie, kies klonen en enten ze in LB medium aangevuld met de juiste antibiotica overnachtingen bij 37 ° C. Op de volgende dag, pak u plasmide DNA uit gekweekte bacteriën. Controleer of succesvol klonen door beperking geklaard en het rangschikken van de uitgepakte plasmide DNA.
    5. Versterken van hoge kwaliteit, bacterieel plasmide DNA (zie stap 1.1.3). Versterkte DNA verzenden een virale vector kern faciliteit voor virus productie.

2. signaaltransductie van spinale cellen

  1. Bereiding van Virus-oplossing
    Let op: Virussen besmettelijke reagentia zijn en moeten worden behandeld volgens de relevante richtlijnen. In de meeste gevallen kan rAAVs op bioveiligheidsniveau 1 (BSL1) worden beheerd.
    1. Op de dag van de injectie, een voorraad aliquoot deel van het gewenste gezuiverde virus op ijs ontdooien en bewaar deze op ijs totdat direct vóór de injectie. Vermijd herhaalde bevriezen-ontdooien-cycli, omdat dit de effectieve titer van het virus verminderen zal.
      Opmerking: Indien nodig, de ontdooide virus aliquoot kan worden bewaard bij 4 ° C tot 3 dagen.
    2. Verdun de virusdeeltjes in steriele 0.9% NaCl of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
      Opmerking: De juiste titer afhankelijk van de experimentele doelstellingen en moet experimenteel worden bepaald. Een goede totaal virale lading is om te beginnen met 3 x 109 genoom kopieën (3.33x1012 van GC/mL, 3 x 300 nL geïnjecteerd). Nemen overtollige en sommige verlies tijdens het laden van het capillair in account, ongeveer 2,5 µL van virus oplossing nodig zal zijn voor elke muis.
  2. Voorbereiding van micropipetten voor Intraspinal injecties
    1. "Pull" thin-muur glazen capillairen (buitendiameter 1 mm) op een trekker van de micropipet aan het maken van een ~5.5 mm lang, ondiep schacht. Gebruik een 3.0 mm kachel gloeidraad en instellingen van programma 00 met P(A) aangepast zoals in tabel 1.
      Opmerking: Trekken kan worden gedaan op voorhand. De haarvaten getrokken moeten worden opgeslagen in een gesloten container Modeling klei zodat er geen stof, die later de micropipet kon verstoppen. Autoclaaf van micropipetten is niet nodig.
    2. Clip de schacht van de getrokken capillair met een laminectomie Tang tot een lengte van ongeveer 4.5 tot en met 5 mm tot het maken van een opening met een binnendiameter van 25-35 μm tip. Met behulp van een microscoop met een schaal micrometer, meten de binnendiameter van verschillende micropipetten een gevoel voor hoe groot de opening moet worden, of -maatregel voor elke micropipet te krijgen.
      Opmerking: Een kleine tip kan leiden tot verstopping; een grotere tip kan weefselschade en moeilijkheden te doordringen van het ruggenmerg.
  3. Voorbereiding van chirurgische Setup en Tools
    1. Zorgen dat de apparatuur is schoon en klaar om te worden gebruikt. Het werkgebied door af te vegen met 70% ethanol desinfecteren en steriliseren van instrumenten door autoclaaf of hen te ontsmetten. Laat niet een ontsmettingsmiddel op de microliter spuit die schadelijk zou zijn voor de virale vector moet worden gebruikt.
  4. Narcose en voorbereiding van het dier voor chirurgie
    Opmerking: De totale duur van de operatie is 60-90 min.
    1. Kies 6 - tot 10 - weken oude muizen ter vergemakkelijking van de chirurgische ingreep.
      Opmerking: Als de proefopzet vereist, is de injectie van jongere of oudere dieren mogelijk. Elke stam en beide geslachten kunnen in beginsel worden gebruikt, maar dezelfde achtergrond stam (b.v., C57BL/6J) voor vergelijking van gedrag tussen verschillende transgene muis lijnen gebruiken. Als seks verschillen worden verwacht of om te worden onderzocht, het analyseren van mannetjes en vrouwtjes in aparte groepen.
    2. Anesthesie met behulp van ~ 5% Isofluraan induceren. Plaats het dier in het stereotaxic frame op een warmte-mat en onderhouden van verdoving bij 1-2,5% Isofluraan (luchtstroom tarief 900 mL/min). Controleren van de ademhalingsfrequentie gedurende de operatie.
    3. Toepassing smeermiddel oog zalf om te voorkomen dat het drogen van het hoornvlies tijdens de operatie.
    4. Scheren van het dier terug en verwijder haar zorgvuldig met natte weefsels. Desinfecteren van de geschoren huid met jodiumoplossing en laat de huid drogen.
    5. Pijnstillende behandeling geven (bijvoorbeeld, 0,1-0,2 mg/kg buprenorfine subcutaan).
  5. Blootstelling van de wervelkolom op het niveau van de lumbale ruggemerg
    Opmerking: Als gevolg van de differentiële ontwikkeling van het ruggenmerg en de wervelkolom, de respectieve niveaus niet zijn uitgelijnd, maar de lumbale ruggemerg segment L4 is op hetzelfde niveau als de thoracale wervel T13.
    1. Zoek de meest caudal rib paar door Palperende langs de wervelkolom. Met behulp van een scalpel, maken een longitudinale cut van 1,5 tot 2,5 cm in de huid vanaf slechts rostraal tot het meest caudal rib-paar.
    2. Til de huid met een tang en het loskoppelen van de onderliggende spier met een schaar. Tijdens de operatie, houden de blootgestelde weefsels vochtig met steriele 0.9% NaCl.
    3. Met behulp van fijne pincet en kleine schaar, maken van een incisie in de volgende, dunne membraanachtig laag rechts naast de middellijn en het afgesneden van de spinous processen. Het staat los van de onderliggende paraspinous spier, maar gekoppeld aan de spinous processen.
  6. Identificatie van de wervels op het niveau van de lumbale ruggemerg
    Opmerking: Zodra de wervelkolom wordt blootgesteld, de intertransverse ligamenten en de dorsale spinous processen zichtbaar moeten zijn. Verschillende anatomische bezienswaardigheden kunnen helpen bij het identificeren van de juiste wervel naar doel (figuur 1B).
    1. Trek de huid terug naar de staart om de iliacale crest bloot te stellen. Op hetzelfde niveau, het meest caudal paar zichtbaar intertransverse ligamenten sluit zich aan bij de L6 spinous proces. Tellen achteruit in een caudal naar rostraal richting te identificeren van de wervel van belang.
    2. Palperen langs de wervelkolom. Het meest caudal rib paar ligt net rostraal van de wervel T13 en het bekkenbeen hip niveau is op het niveau van de wervel L6.
    3. Zoek de plek waar de pees langs de kant van de wervelkolom witste en meest mediale is. De wervel T13 ligt net rostraal. De lumbale ruggemerg segment L4 ligt op deze wervel.
  7. Fixatie van de wervelkolom en de blootstelling van de lumbale ruggemerg
    1. Plaats het dier op een kussen opgerold tissues aan het te verheffen tot de spinale klemmen van het stereotaxic frame.
    2. Vaststellen van de wervel doel om te voorkomen dat de bewegingen van de wervelkolom als gevolg van ademhaling. Voor dit doel, uitlijnen van de klemmen grenzend aan de target-wervel, één klem in positie vast en houdt de wervelkolom met een Adson Tang terwijl de vaststelling van de tweede klem.
      Opmerking: De kolom moet loodrecht op het vlak van de injectie en stevig zodat het niet op druk van bovenaf verschuift. Indien nodig, kan een tweede paar van klemmen worden bevestigd aan de wervelkolom. In dit geval is het handig om de twee paren van klemmen aan de twee wervels grenzend aan de wervel doel vast te stellen.
    3. Verwijder de paraspinous spier boven de wervels van belang. Met behulp van een scalpel, maken een parallelle insnijding net mediale aan de pezen die parallel aan de wervelkolom, evenals loodrechte insnijdingen rostraal en caudal de doel-wervel. Wees voorzichtig niet te snijden te diep. Scheur/knippen weg de spier met behulp van rongeurs. Het gebruik van pincet zo nodig te verwijderen weefsel resterende op de wervel of boven de dura in de lat. ruimte.
    4. In de lat. ruimte moet het dorsale bloedvat zichtbaar markering van de middellijn van het ruggenmerg. Voor unilaterale injecties, door een partiële laminectomie uit te voeren door het boren van een gat in het midden van de kant van de doelgroep van de wervel. Gebruik een fijne tandheelkunde boren apparatuur met een 0.5 mm sferische cutter en boor vooral zorgvuldig bij het naderen van het ruggenmerg. Verwijder eventuele resterende botfragmenten met een schuine naald van 26G bloot van het ruggenmerg.
    5. Met behulp van een schuine naald van 26G, perforate de dura in het geboorde gat, inzonderheid de lat. ruimte rostraal en caudal naar de doel-wervel, alle ongeveer 200 µm lateral aan de dorsale bloedvat. Cerebrospinale vloeistof moet worden ontsnappen in de gaten en het ruggenmerg moet worden iets bolling uit.
  8. Voorbereiding van de injectiespuit
    Opmerking: De injectiespuit moet bereid onmiddellijk vóór het begin van de injectie te verminderen het risico van stofdeeltjes die verstopping van de micropipet.
    1. Het monteren van de glazen viscometerbuizen op een microliter spuit met behulp van de verwisselbare naald Knelkoppeling kit. Zet de moer stevig vast om te zorgen voor een strakke en veilige pasvorm vast.
    2. Vul de spuit microliter met steriel gedistilleerd water en beginnen te drukken het uit met de zuiger.
      Opmerking: Als er teveel weerstand zodat het water niet gemakkelijk uit de tip komt, de micropipet is waarschijnlijk geblokkeerd en moet worden uitgewisseld.
    3. Monteer de spuit op een micromanipulator aangesloten op een elektronisch gestuurde microinjector. Wees voorzichtig niet aan te raken om het even wat met de micropipet.
    4. Met behulp van de microinjector, opstellen van ongeveer 1 µL van lucht naar het maken van een zeepbel tussen het water en het virus.
    5. Plaats een droplet 2.5 µL van virus oplossing op een stuk van paraffine film, zorgvuldig verplaatst u het uiteinde van de micropipet in de druppel met behulp van het stereotaxic frame en het opstellen. Vervolgens zorgvuldig pers afzien tot een beetje virus oplossing naar voren komt op het puntje.
    6. De spuit intrekken en, met behulp van een pen, markeren de micropipet met een schaal en Let op het niveau van de oplossing van het virus; Dit vergemakkelijkt het toezicht of de infusie vordert geprogrammeerd.
  9. Intraspinal injecties
    1. Beweegt het puntje van de micropipet boven één van de gaatjes in de dura en vervolgens naar beneden tot een kleine deuk in de dura is genoteerd. Te richten op de injectie aan de spinale dorsale hoorn, omlaag 500 µm in opeenvolgende stappen van 100 µm (snelheid 1 mm/s) en vervolgens 200 µm omhoog te voorzien van mechanische stabilisatie van het weefsel.
      Opmerking: De uiteindelijke diepte van het uiteinde is 300 µm in dit geval, maar kan worden aangepast afhankelijk van het doelgebied.
      1. Als het weefsel resistent tegen penetratie is, kan de micropipet worden vangen op de dura. In dit geval intrekken en enigszins naar het gat te bedekken of de naald opnieuw met de dura goed perforate voordat de penetratie-poging herhaald.
    2. De pomp om een injectie doelvolume van 300 Program nL met een snelheid van de injectie van 50 nL/min en druk op de startknop om te beginnen de infusie.
    3. Nadat de injectie is voltooid, controleert u de schaal om te zien of het virus niveau is gedaald en de micropipet, laat staan voor een extra 3 min om de druk te equilibreer langzaam ingetrokken de spuit.
    4. Herhaal stap 2.9.1.-2.9.3. voor de andere twee injectie sites.
  10. Hechten en herstel
    1. De spinale klemmen en het kussen onder de muis verwijderen.
    2. Sluit de wond in lagen met onderbroken hechtingen zette, wordt de huid en de lagen van de oppervlakkige weefsel met absorbeerbare draadjes met niet-absorbeerbare draadjes. Breng jodium ontsmettingsmiddel op de sutured wond.
    3. Beëindigen van de narcose en het dier te verlaten op de mat van de warmte tot het herstelt voordat hij het terugkeerde naar haar kooi.
  11. Postoperatieve zorg
    1. De monitor van de gezondheid van het dier op de dag van de operatie, de volgende dag en dan elke 2-3 dagen. Zorgen dat het dier heeft een normale gang, een gezond uiterlijk (gewicht, ogen, bont en gedrag), en dat de wondgenezing.
    2. Pijnstillende behandeling blijven (bijvoorbeeld0,1-0,2 mg/kg buprenorfine subcutaan) zo nodig, drie maal per dag.

3. gedrags en morfologische Analyses

  1. Gedragsanalyse
    Opmerking: Toestaan dat dieren voor de respectieve Setup voor ten minste 30 minuten vóór aanvang van de metingen om hen aan te passen aan de nieuwe experimentele omgeving te laten.
    1. von Frey testen
      1. Plaats van dieren afzonderlijk in afzonderlijke compartimenten van ongeveer 10 cm x 10 cm op een metalen raster vloer.
      2. Het stimuleren van de plantaire oppervlak van de hindpaw ipsilaterale om de injectieplaats met een dynamische von Frey gloeidraad. Opmerking de kracht waartegen het dier zich zijn poot uit de stimulus terugtrekt.
      3. Herhaal dit vijf keer en berekening van de drempel van de gemiddelde terugtrekking uit de zes metingen voor elk dier.
    2. PIN Prick Test
      1. Plaats van dieren in afzonderlijke compartimenten van ongeveer 10 cm x 10 cm op een metalen raster vloer.
      2. Stimuleren de plantaire oppervlak van de hindpaw ipsilaterale om de injectieplaats met een afgestompte 26-G naald zonder penetratie van de huid. Scoren gedrag als nul (geen reactie) of een (reactie).
      3. Herhaal 9 keer met tussenpozen van 3 minuten tussen stimulaties en berekenen percentage reactie van de 10 metingen voor elk dier.
    3. Injectie van DREADD-ligand clozapine-N-oxide (CNO)
      1. Ontbinden CNO in dimethylsulfoxide (DMSO) maken van een stamoplossing van 0,2 mg/µL, die kan worden opgeslagen op kamertemperatuur.
      2. Op de dag van het experiment, Verdun stockoplossing in steriele 0.9% NaCl naar 0,2 µg/µL en injecteren 10 µL/g lichaamsgewicht intraperitoneally. Injecteren van controledieren met voertuig (0,2% DMSO in 0,9% NaCl).
        Opmerking: Volgens ervaring, piek effecten op gedrag kunnen worden verwacht 1-3 h na injectie, en effecten moeten volledig verdwijnen na 24 h. In het geval van activering van de glycinergic neuronen, waargenomen gedrag minder pijn en jeuk reacties omvatten. Gedrag opgeroepen door DREADD-gemedieerde activering van de neuronen zal afhangen van de gerichte subset van ruggenmerg neuronen.
    4. Injectie van Pruritogens voor het opwekken van de jeuk
      1. Los pruritogens in 0.9% NaCl oplossingen van 8 mg/mL (chloroquine) of 10 mg/mL (histamine). 2 uur na toediening van de CNO, injecteren 10 µL van pruritogen of voertuig oplossing subcutaan de plantaire oppervlak van de hindpaw ipsilaterale om de spinale injectieplaats. U kunt ook injecteren intradermaal de pruritogen in het kalf, dat één dag vóór om aversieve gedrag veroorzaakt door het scheren zelf heeft zijn geschoren.
    5. Video-opnamen om spontane Nocifensive of Pruritogen-geïnduceerde jeuk gedrag te analyseren
      1. Plaats dieren individueel in transparante compartimenten (ongeveer 10 cm diameter) met een beetje van beddengoed uit hun respectieve huis-kooi op de grond.
      2. Videoband de dieren gedurende 5 minuten aan record spontane en gedurende 30 minuten om te registreren pruritogen-geïnduceerde gedrag. Het analyseren van de video's offline in bakken van 5 min.
    6. Pijn Versus jeuk gedrag
      1. Observeren en noteer spier, likken en bijten gedrag.
        Opmerking: Spier en likken van de betrokken site worden beschouwd als reacties op pijn, overwegende dat bijten wordt geassocieerd met jeuk.
      2. Analyseren van video's op een normale snelheid, meten van de tijd dat de muis likken of bijten van de betrokken site of meten in slow-motion voor een nauwkeuriger onderscheid tussen likken en bijten reflexen. U kunt ook het aantal likken/bijten/spier bouts.
  2. Morfologische analyse
    1. Morfologische analyses van één tot drie weken na de injectie van het virus of aan het einde van een gedrags experiment uitvoeren.
      Opmerking: Wij hebben gedetecteerd eGFP expressie zo spoedig 48 h na de injectie, maar vond ook dat de expressie aanzienlijk binnen de volgende dagen en zelfs weken verhoogt. Voor cellen met sterke verslaggever expressie, een week na incubatie (vanaf intraspinal injectie tot perfusie) kan volstaan. Voor cellen met zwakke transgenic expressie, virussen met zwakke initiatiefnemers of zwakkere fluorophores, een langere expressie mogelijk moet zorgen detecteerbare niveaus.
    2. Weefsel fixatie
      1. Perfuse elk transcardially van de muis, eerst met 20 ml ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) oplossing (NaCl 125 mM, NaHCO3 25 mM, NaH2PO4 1.25 mM, D-glucose 20 mM, KCl 2.5 mM en CaCl2 2 mM MgSO4 1 mM), dan met 100 mL van 4% ijskoude paraformaldehyde (in 0.1 M natriumfosfaat buffer, pH 7.4).
        Let op: Paraformaldehyde is giftig en moet met zorg worden behandeld.
      2. Onmiddellijk ontleden de lumbale ruggemerg, en na het monteren van het weefsel voor 2 h met 4% paraformaldehyde op ijs. Kort wassen de post vaste weefsel met 0,1 M fosfaatbuffer sodium (pH 7.4) en het vervolgens uit te broeden in een 25% sacharoseoplossing (in 0.1 M natriumfosfaat buffer, pH 7.4) 's nachts bij 4 ° C.
      3. Snijd het cryoprotected weefsel op 30 μm op een cryostaat en bevestig de secties op Microscoop dia's.
    3. Immunofluorescentie kleuring
      1. Na korte wast in PBS, toepassing 300 μL van het blokkeren van de oplossing (10% normale ezel serum in 0,3% Triton-PBS) op de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
      2. Incubeer de dia's met 300 μL van de respectieve combinaties van primaire antilichamen in het blokkeren van de oplossing (Zie Tabel van materialen) over nacht bij 4 ° C. Wassen van de secties 3 keer voor 5 min in PBS.
      3. Laat de dia's met de respectieve combinaties van secundaire antilichamen in blokkerende oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Wassen van de secties 3 keer voor 5 min in PBS.
      4. Kort spoelen van de dia's in ddH2O en monteren van de coverslips met behulp van fluorescerende montage medium.
      5. Fluorescerende beelden met behulp van een confocal microscoop voorzien van een 20 x en een 40 x doelstelling te verwerven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te illustreren de niveaus van de expressie die kunnen worden verkregen door het intraspinal injectie van rAAV codering van een marker-eiwit, we eerst geïnjecteerd AAV1. CAG.eGFP in de lumbale ruggemerg van wild-type muizen. Drie injecties verdeeld ongeveer 1 mm uit elkaar geproduceerd een bijna continue infectie van lumbale spinale segmenten L3 L5 (figuur 1A-C). Injectie van het virus op een diepte van 300 µm van het spinale oppervlak leid...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Intraspinal injectie van AAVs kan worden een krachtige techniek in een laboratorium van het onderzoek, waardoor de analyse van spinale cellen met een hoge temporele en ruimtelijke oplossing. Dit protocol maakt de transductie van de drie belangrijkste spinale segmenten wordt geïnnerveerd door de sensorische neuronen uitbreiding van hun perifere axonen naar de stuk. Transducing drie segmenten produceert robuuste en reproduceerbare gedrags-gegevens. Ook kunnen testen van een grotere sensorische ruimte dan mogelijk na een en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Hanns Ulrich Zeilhofer voor royaal ondersteunen dit werk. Hendrik Wildner werd gesteund door de Stichting Olga Mayenfisch. Wij danken Carmen Birchmeier voor het antilichaam Lmx1b.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-PullerZeitzNA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentratorWeinmannNA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary VaporizerMidmarkNA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100Migros717614700000
Electric shaverPhilipsBT9290
surgical microscope (OPMI pico)ZeissNA
Small animal stereotaxic apparatusKopfNA
Neurostar StereoDrive (optional)NeurostarNA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptorHarvard Apparatus72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomiteHarvard Apparatus70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringeHamilton7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mmHamilton55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40OsadaOS-40
spherical cutter, 0.5mmBusch12001005B
electronic von Frey anesthesiometerIITC23905
flexible von Frey hairsIITC#7
LSM710 Pascal confocal microscopeZeissNA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objectiveZeissNA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objectiveZeissNA
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cmFine Science Tools10004-13
Extra Fine Bonn ScissorsFine Science Tools14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cmFine Science Tools11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cupFine Science Tools16121-14
Dumont #2 laminectomy forcepsFine Science Tools11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp lengthFine Science Tools12002-12
Fine forceps #5Fine Science Tools11254-20
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameterWorld Precision InstrumentsTW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml)B. Braun(9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needleB. Braun4665457
Sterile scalpel bladesB. BraunBB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbableB. BraunC1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbableB. BraunC0932191
Sterile PBS or saline (0.9%)NA
Ethanol, 70% (disinfectant)NA
Iodine solution (e.g. Braunol)B. Braun18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane)Provet2222
AldasorberProvet333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic)IndiviorGTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos)Pharma medicaGTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from)IVF Hartmann1628100
Facial tissues (e.g. from)Uehlinger AG2015.10018
Superfrost plus microscope slidesThermoScientificJ1800AMNZ
NameCompanyCatalog NumberComments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre)The Jackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom)The Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:007914
NameCompanyCatalog NumberComments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP)Penn Vector CoreAV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP)Penn Vector CoreAV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)		Penn Vector CoreAV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA)Penn Vector CoreCustom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi))Penn Vector CoreCustom production
NameCompanyCatalog NumberComments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(G

Referenties

  1. Goulding, M., Bourane, S., Garcia-Campmany, L., Dalet, A., Koch, S. Inhibition downunder: an update from the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 26, 161-166 (2014).
  2. Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci. 11 (12), 823-836 (2010).
  3. Sandkuhler, J. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiol Rev. 89 (2), 707-758 (2009).
  4. Zeilhofer, H. U., Wildner, H., Yevenes, G. E. Fast synaptic inhibition in spinal sensory processing and pain control. Physiol Rev. 92 (1), 193-235 (2012).
  5. Azim, E., Jiang, J., Alstermark, B., Jessell, T. M. Skilled reaching relies on a V2a propriospinal internal copy circuit. Nature. 508 (7496), 357-363 (2014).
  6. Cui, L., et al. Identification of Early RET+ Deep Dorsal Spinal Cord Interneurons in Gating Pain. Neuron. 91 (6), 1413(2016).
  7. Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
  8. Francois, A., et al. A Brainstem-Spinal Cord Inhibitory Circuit for Mechanical Pain Modulation by GABA and Enkephalins. Neuron. 93 (4), 822-839 (2017).
  9. Peirs, C., et al. Dorsal Horn Circuits for Persistent Mechanical Pain. Neuron. 87 (4), 797-812 (2015).
  10. Petitjean, H., et al. Dorsal Horn Parvalbumin Neurons Are Gate-Keepers of Touch-Evoked Pain after Nerve Injury. Cell Rep. 13 (6), 1246-1257 (2015).
  11. Zhang, Y., et al. Identifying local and descending inputs for primary sensory neurons. J Clin Invest. 125 (10), 3782-3794 (2015).
  12. Haenraets, K., et al. Spinal nociceptive circuit analysis with recombinant adeno-associated viruses: the impact of serotypes and promoters. J Neurochem. , (2017).
  13. Abraira, V. E., et al. The Cellular and Synaptic Architecture of the Mechanosensory Dorsal Horn. Cell. 168 (1-2), 295-310 (2017).
  14. Wildner, H., et al. Genome-wide expression analysis of Ptf1a- and Ascl1-deficient mice reveals new markers for distinct dorsal horn interneuron populations contributing to nociceptive reflex plasticity. J Neurosci. 33 (17), 7299-7307 (2013).
  15. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), e50313(2013).
  16. Kohro, Y., et al. A new minimally-invasive method for microinjection into the mouse spinal dorsal horn. Sci Rep. 5, 14306(2015).
  17. Bourane, S., et al. Gate control of mechanical itch by a subpopulation of spinal cord interneurons. Science. 350 (6260), 550-554 (2015).
  18. Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
  19. Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
  20. Gutierrez-Mecinas, M., et al. Preprotachykinin A is expressed by a distinct population of excitatory neurons in the mouse superficial spinal dorsal horn including cells that respond to noxious and pruritic stimuli. Pain. 158 (3), 440-456 (2017).
  21. Awatramani, R., Soriano, P., Rodriguez, C., Mai, J. J., Dymecki, S. M. Cryptic boundaries in roof plate and choroid plexus identified by intersectional gene activation. Nat Genet. 35 (1), 70-75 (2003).
  22. Kim, J. C., et al. Linking genetically defined neurons to behavior through a broadly applicable silencing allele. Neuron. 63 (3), 305-315 (2009).
  23. Kim, J. C., Dymecki, S. M. Genetic fate-mapping approaches: new means to explore the embryonic origins of the cochlear nucleus. Methods Mol Biol. 493, 65-85 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cre afhankelijke vectorenintraspinale injectiedorsale hoornGlyT2 Cre muizenstereotactische chirurgievirale transductieneuronale subpopulatiessensorische verwerking

Gerelateerde artikelen