Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel

9.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57383

⸱

14 mei 2018

 ,  , 
1Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, Boston University School of Medicine, 2Department of Medicine, Section of Hematology and Oncology, Boston University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Live-cel imaging biedt een schat aan informatie op afzonderlijke cellen of hele populaties die onbereikbaar is door de vaste cel imaging alleen. Hier, worden live-cel imaging protocollen te beoordelen cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel beschreven.

Samenvatting

Live-cel imaging is een krachtige techniek die kan worden gebruikt om direct het visualiseren van biologische fenomenen in afzonderlijke cellen gedurende langere perioden van tijd. In het afgelopen decennium, hebben nieuwe en innovatieve technologieën aanzienlijk verbeterd de uitvoerbaarheid voor live-cel imaging. Cellen kunnen nu worden gehouden in focus en continu beeld over meerdere dagen terwijl onderhouden onder 37 °C en 5% CO2 cel cultuuromstandigheden. Bovendien kunnen meerdere velden van weergave waarin verschillende experimentele omstandigheden worden verworven gelijktijdig, waardoor hoge gegevensdoorvoer experimentele gegevens. Live-cel imaging biedt een aanzienlijk voordeel ten opzichte van vaste-cel imaging doordat voor de directe visualisatie en temporele kwantificatie van dynamische cellulaire gebeurtenissen. Live-cel imaging herkent ook variatie in het gedrag van afzonderlijke cellen die anders zouden hebben is gemist met behulp van bevolking gebaseerde testen. Hier beschrijven we live-cel imaging protocollen voor de beoordeling van de cel lot beslissingen naar aanleiding van de behandeling met de anti-mitotische drug paclitaxel. We tonen aan methoden om te visualiseren of mitotically cellen sterven rechtstreeks aan de mitose of slip terug in interfase gearresteerd. Ook beschrijven we hoe de fluorescerende ubiquitination gebaseerde celcyclus indicator (FUCCI) systeem kan worden gebruikt om te beoordelen van de Fractie van de interfase cellen geboren uit mitotische ontsporing die kunnen de celcyclus opnieuw in te voeren. Ten slotte, beschrijven we een live-cell, beeldvorming methode ter identificatie van de nucleaire envelop breuk gebeurtenissen.

Inleiding

Anti-mitotische drugs hebben al lange tijd gebruikt in de chemotherapeutische regimes van verschillende soorten van stevige tumors en tonen vaak grote werkzaamheid1,2,3. Mechanistically, deze drugs verstoren de normale mitotische progressie en bevordering van de mitotische arrestatie in snel prolifererende kankercellen. Lot van de cel in reactie op de mitotische arrestatie is echter zeer variabel: terwijl een deel van de cellen de dood van de cel rechtstreeks vanuit de mitose ondergaat, anderen afsluiten van mitose en terugkeer naar de interfase als tetraploïde cellen (een proces genoemd mitotische ontsporing)4, 5,6,7,8. Deze interfase cellen kunnen uitvoeren van apoptosis, permanente celcyclus arrestatie ondergaan, of zelfs opnieuw invoeren van de celcyclus4,5,6,7,8,9 ,10,11. Cellen die mitotische celdood te omzeilen door zich te glijden in de interfase, alleen tot Re-Enter de celcyclus na verwijdering van de drug, kunnen dus bijdragen aan de re-opkomst van kanker-cel populaties. Bovendien, terugvalpreventie cellen dat slip van mitose tetraploïde, en tetraploidy bekend is ter bevordering van chromosoom instabiliteit die tumor drijft12,13,14,15. Vaststelling van de factoren waarmee de cel lot in reactie op anti-mitotische drug behandelingen is daarom cruciaal te optimaliseren van huidige therapeutics.

In dit protocol beschrijven we methoden om rechtstreeks observeren en studie van het lot van cellen die langdurige mitotische arrestatie in reactie op de anti-mitotische drug paclitaxel ondergaan. Paclitaxel is een gevestigde therapeutisch in de kliniek en heeft bewezen zeer doeltreffend in vele soorten van tumoren, met inbegrip van die van de borst, eierstokken en longen16,17,18,19, 20. Paclitaxel, oftewel een plant alkaloïde afkomstig van de schors van de boom van de taxus, microtubuli stabiliseert en aldus verhindert hun dynamicity21,22. Terwijl demping van microtubulus dynamiek door paclitaxel heeft geen invloed op de celcyclus van G1 t/m G2, leidt de drug tot aanhoudende activatie van de spindel vergadering checkpoint tijdens de mitose door belemmeren Kinetochoor-microtubulus bijlage (herzien in diepte hier23,24)25. Dientengevolge, anafase begin voorkomen in cellen paclitaxel-behandeld en resultaten in een langdurige mitotische arrestatie.

Dit protocol zal eerst beschrijven benaderingen ter identificatie van de mitotische cellen in live-cel imaging experimenten. Mitose kan worden gevisualiseerd in aanhangend weefselkweek cellen als gevolg van twee merkbaar cel biologische veranderingen. Chromosomen worden eerst zeer gecondenseerd onmiddellijk voorafgaand aan de nucleaire envelop verdeling. Terwijl vaak aantoonbaar met standaard fase contrast microscopie, kan chromosoom condensatie worden duidelijker opgespoord met behulp van fluorescerende labels die label chromosomen (bijvoorbeeld fluorescently-geëtiketteerden Histon eiwitten). Tweede, mitotische cellen kunnen ook worden geïdentificeerd door de grote morfologische veranderingen die uit de cel afronding voortvloeien.

Dit protocol demonstreer dan het gebruik van live-cel imaging benaderingen voor het bijhouden van het lot van cellen ervaren langdurige mitotische arrestatie. Cellen gearresteerd in de mitose ondergaan een van drie verschillende lot. Ten eerste kunnen cellen celdood tijdens de mitose ondergaan. Dit fenomeen is gemakkelijk gevisualiseerd door de lichte microscopie, zoals stervende cellen worden waargenomen verschrompelen, bleb, en/of breuk. Ten tweede, cellen kunnen afsluiten van mitose en ga terug naar de interfase zonder chromosoom segregatie of cytokinese, een proces genoemd mitotische ontsporing. De decondensation van chromosomen en/of de afvlakking van de mitotische cel gemakkelijk identificeert dit proces. Cellen die van mitose ontaarden ook vaak weer onregelmatig, multi Gelobde kernen en vaak haven verschillende micronuclei5. Ten derde kunnen cellen gearresteerd in de mitose initiëren van anafase en ga door mitose na een lange onderbreking. Terwijl ongebruikelijk bij hogere concentraties van de drug, suggereert dit probleem dat de gearresteerde cellen de spindel vergadering controlepost kunnen hebben voldaan, of dat de spindel vergadering checkpoint is gedeeltelijk verzwakte of defect. Anafase begin kan worden gevisualiseerd door chromosoom segregatie en latere cytokinese met behulp van live-cel imaging.

Live-cel beeldvormende methoden voor het bijhouden van het lot van cellen die mitotische celdood te omzeilen door zich te ondergaan mitotische ontsporing zal ook worden beschreven. Cellen die u ondergaan mitotische ontsporing sterven in de daaropvolgende interfase, leiden tot een duurzaam G1 celcyclus arrestatie of de celcyclus om te starten van een nieuwe ronde van celdeling4opnieuw in te voeren. Een aanpak met behulp van de FUCCI (fluorescerende ubiquitination gebaseerde celcyclus indicator) systeem om te bepalen van de Fractie van cellen die opnieuw invoeren van de celcyclus na mitotische ontsporing zal worden beschreven. FUCCI zorgt voor de directe visualisatie van de G1/s overgang en kan worden gebruikt in combinatie met op lange termijn live-cel imaging zowel in vitro als in vivo26,27. Het FUCCI-systeem maakt gebruik van twee fluorescently geëtiketteerde proteïnen, afgeknotte vormen van hCdt1 (chromatine licenties en DNA-replicatie factor 1) en hGeminin, waarvan niveaus schommelen op basis van de positie van de celcyclus. hCdt1 (gesmolten aan een rode fluorescent proteïne) is aanwezig op een hoog niveau tijdens G1 fase waar het handelt om te licentie van DNA voor replicatie, maar is ubiquitinated door de ligase E3 ubiquitin SCFSkp2 en gedegradeerd tijdens S/G2/M fasen om te voorkomen dat opnieuw replicatie van DNA26. Daarentegen, hGeminin (gesmolten aan een groen fluorescent proteïne), is een inhibitor van hCdt1 waarvan piek niveaus tijdens S/G2/M, maar is van ubiquitinated door de E3 ubiquitin ligase APCCdh1 en afgebroken aan het einde van de mitose en hele G1 26. dus, FUCCI levert een eenvoudige fluorescentie uitlezing van de fase van de celcyclus, zoals cellen rode fluorescentie tijdens G1, en groen fluorescentie tijdens S/G2/M vertonen. Het FUCCI systeem is een belangrijke stap vooruit over andere benaderingen (zoals bromodeoxyuridine kleuring) te identificeren, proliferatieve cellen, omdat het vereist geen cel fixatie en voor eencellige imaging zonder de behoefte aan extra zorgt farmacologische behandelingen voor het synchroniseren van cel populaties. Hoewel niet besproken in dit protocol, zijn er extra live-cel sensoren ook ontwikkeld om te visualiseren celcyclus, met inbegrip van een helicase B sensor voor G128, DNA ligase-RFP29 en PCDNA-GFP30 sensoren voor de S-fase, en de recente FUCCI-4-sensor, die detecteert alle stadia van de celcyclus31.

Tot slot zal een live-cel beeldvorming methode detecteren nucleaire envelop breuk worden beschreven. Recente studies is gebleken dat de nucleaire enveloppen van kankercellen zijn instabiel en gevoelig voor barsten, waardoor de inhoud van de nucleoplasm en het cytoplasma aan intermix. Dit verschijnsel, nucleaire breuk, genoemd kan bevorderen DNA-beschadiging en stimulatie van de ingeboren immune reactie32,33,34,35,,36,,37, 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44. terwijl de onderliggende oorzaken van nucleaire breuk onvolledig gekarakteriseerd blijven, het is bekend dat de vervormingen in nucleaire structuur met een verhoogde incidentie van nucleaire breuk42correleren. Een bekende effect van paclitaxel behandeling is de generatie van opvallend abnormale nucleaire structuren na mitose; als zodanig worden een methode met behulp van live-cel imaging te kwantificeren van nucleaire breuk beschreven, terwijl het ook onderzoeken als paclitaxel behandeling de frequentie van nucleaire breuk gebeurtenissen verhoogt. Nucleaire breuk kan worden gedetecteerd door de waargenomen lekkage van een nucleaire-gerichte fluorescent proteïne in het cytoplasma (b.v. een tandem-dimeer herhaling van RFP gesmolten in een nucleaire localisatie signaal, TDRFP-NLS). Deze lekkage is duidelijk zichtbaar met het blote oog, waarmee eenvoudige kwantificatie van breuk gebeurtenissen.

Dit protocol vereist een widefield epifluorescence Microscoop die is uitgerust met een gecodeerde podium en autofocus software. De gecodeerde fase zorgt voor nauwkeurige automatische beweging naar gedefinieerde X-en Y-coördinaten, terwijl autofocus software cellen in focus voor de duur van de beeldvorming handhaaft. Bovendien, dit protocol vereist dat apparatuur om cellen bij 37 ° C met 5% CO2 bevochtigde sfeer. Dit kan worden bereikt door de gehele Microscoop binnen een temperatuur en sfeer gecontroleerd behuizing, of met behulp van fase-top apparaten dat lokaal onderhoudt temperatuur en milieu. Het doel van de fase contrast gebruikt in dit protocol is een plan fluor 10 x met een numerieke diafragma van 0.30. 20 X doelstellingen zijn echter ook voldoende beide afgeronde mitotische en afgevlakte interfase cellen in een enkele brandvlak worden geïdentificeerd. Het uitvoeren van fase-contrast kunnen imaging (zoals beschreven in deze methode), de cover glas of kunststof. Als differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie wordt gebruikt, is het noodzakelijk een glasdeel gebruiken om te voorkomen dat depolarisatie van licht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is gericht op de opdrachtregel de niet-getransformeerd en inplanten stabiele retinale gepigmenteerde epitheliale (RPE-1) cel voor live-cel imaging experimenten. Dit protocol kan echter worden aangepast aan elke aanhangend cellijn, zo lang als cel cultuuromstandigheden zo nodig worden aangepast. Alle procedures moeten voldoen aan de institutionele bioveiligheid en ethische richtlijnen en verordeningen.

1. voorbereiding van de cellen van levende cellen Imaging

  1. Gebruik vers ontdooid en vroege passage RPE-1 cellen uiten van menselijke Histon die h2b gesmolten aan een fluorescente proteïne (bijvoorbeeld H2B-GFP) of het systeem van de FUCCI (een gedetailleerd protocol over hoe te genereren van uiting van de FUCCI cellen kan worden gevonden in verwijzing45) om te beoordelen mitotische cel lot.
    1. Voor het meten van de frequentie van nucleaire breuk, RPE-1 cellen uiten H2B-GFP zowel een tandem-dimeer van rode fluorescerende eiwit gesmolten in een enkele nucleaire localisatie signaal (TDRFP-NLS) te gebruiken.
      Opmerking: Constructies van drie groen fluorescente proteïnen gesmolten parallel aan een enkele nucleaire localisatie-signaal (GFP3- NLS) zijn ook gebruikt om aan te tonen van de breuk (zoals in verwijzing42).
    2. Handhaven van cellen op 10 cm weefselkweek platen in de passende groeimedium. RPE-1 cellen worden bijgehouden in fenol rood-vrij, van Dulbecco bewerkt Eagle Medium/nutriënt mengsel F-12 (DMEM:F12) aangevuld met 100 IU/mL penicilline, 10% foetale runderserum (FBS) en 100 μg/mL streptomycine.
  2. Gecombineerd medium uit de cellen, wassen van de weefselkweek schotel met 10 mL steriele, kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) resterende medium verwijderen en vervolgens de PBS gecombineerd.
    1. Voeg toe 2 mL 0,25% trypsine met ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) aan de cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten of totdat de meerderheid van de cellen hebben losgemaakt van de plaat.
      Opmerking: Houd de cellen niet in trypsine langer dan nodig.
  3. Voeg 10 mL van volledige medium voor het verzamelen van de trypsinized cellen met een 10 mL serologische stripette en afzien in een conische tube van 15 mL.
    1. Pellet de cellen door centrifugeren bij 180 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  4. De bovendrijvende substantie, voorzichtig niet te verstoren de pellet, gecombineerd en vervolgens resuspendeer grondig de pellet in 10 mL verse voedingsbodem zachtjes op en neer waarbij het medium in de serologische stripette.
  5. Gebruik een hemocytometer of geautomatiseerde cel tellen machine wilt tellen cellen46.
    1. Verdun cellen in een nieuwe conische buis tot 30.000 cellen/mL van volledige medium.
    2. Plaat 30.000 RPE-1 cellen (volume 1 mL) per putje van een 12-well glazen bodem (#1.5 dikte) imaging schotel te bereiken van de vereiste cellulaire dichtheid de volgende dag (30 – 50% heuvels).
      Opmerking: Altijd behandelen de plaat met handschoenen en wees voorzichtig niet aan te raken de glazen-bodem.
  6. Cellen om te groeien in een 37 ° C weefselkweek incubator totdat ze volledig hechten en op de glassbottom imaging plaat plat toestaan. Hoewel cellen in minder dan 4 uur koppelen kunnen, is het aanbevolen dat de cellen niet zijn behandeld met medicijnen en beeld tot de volgende dag.
  7. Voeg paclitaxel (ontbonden in dimethylsulfoxide (DMSO)) om de gewenste eindconcentratie in volledige medium en meng grondig.
    1. Volledige medium met een gelijk volume van DMSO alleen te gebruiken als besturingselement voor te bereiden.
    2. Warm het medium met drugs of DMSO tot 37 ° C alvorens toe te voegen aan de cellen. Dit zal het verhinderen van focal drift als gevolg van een plotselinge temperatuurveranderingen.
    3. Voeg 1 mL medium met of DMSO alleen aan individuele putjes van de 12-well imaging schotel als paclitaxel.

2. het opzetten van de Microscoop voor Live-cel Imaging

  1. Reinig glas-onderin de imaging schotel met optische cleaner te verwijderen van vingerafdrukken en de eventuele stof die met imaging interfereren kan. Gebruik voldoende optische reiniger te bevochtigen het hele glasoppervlak.
  2. Zet de glazen-bodem schotel op het podium van de Microscoop in de beeldvorming schotel adapter, verwijder de plastic kap van de schotel en dekking van de schotel met een glas-bedekte kamer. Zorg ervoor dat de zaal heeft een klep om een gestage stroom van lucht bestaande uit 5% CO2.
    Opmerking: Als u wilt humidify de 5% CO2, het gas is stroomde door buizen ingevoegd in een steriel water bad behuizing. Dit zorgt voor het gas te worden geëquilibreerd aan 95% luchtvochtigheid.
  3. Geïnitieerde/kalibreren de gecodeerde podium met het beheersen van de Microscoop softwareprogramma. Dit zal zorgen voor nauwkeurige X-en Y-coördinaten en voorkomen van focal drift.
  4. Focus op de cellen met behulp van fase-contrast optiek en uitvoeren van Kohler verlichting (in detail beschreven in verwijzing47) om te concentreren het licht en bieden optimaal contrast.
  5. Acquisitie software gebruiken voor het bepalen van de optimale belichtingstijden voor wit licht en alle fluorescerende kanalen wordt gebruikt (posities geven 75% pixel verzadiging op de camera zijn ideaal, mits deze hoeveelheid licht is niet giftig voor de cellen).
    1. Acquisitie software kunt selecteren verschillende, niet-overlappende gebieden van uitzicht vanaf elk putje voor imaging. Selecteer imaging regio's waar de cellen goed aan de glazen-bodem hebben gehouden en zijn tussen 50% en 70% heuvels. Vermijd gebieden van geklonterd cellen, omdat dit latere analyse moeilijk zal maken.
      Opmerking: Het is belangrijk om niet-overlappende gezichtsveld van elk putje om te voorkomen dat tweemaal dezelfde cellen bijhouden. Als cellen zeer sporenvormende, wellicht te verwerven van de verschillende afbeeldingen straalt uit vanaf een centraal punt en steek die ze weer bij elkaar zodat een groot gezichtsveld.
  6. Activeren van de Microscoop autofocusing functie om ervoor te zorgen dat alle punten in focus voor de duur van het experiment worden bijgehouden.
  7. Om te beoordelen mitotische cel lot, stel de beeldbewerkingssoftware te verzamelen beelden van elke geselecteerde gezichtsveld elke 10 min voor aan 96 h. Unperturbed mitose duurt 20-40 min, en dus 10 min. intervallen zorgt voor genoeg bemonstering om te identificeren wanneer cellen verdelen. Als u wilt identificeren nucleaire verwerven breuk, die is een voorbijgaande evenement, beelden elke 5 min.
    Opmerking: Zorg ervoor dat de computer rijden de afbeelding acquisitie software automatisch bijwerken, screensavers en energiebesparing modi uitgeschakeld, omdat deze vaak met Beeldacquisitie over lange experimenten interfereren kunnen.
  8. De imaging experiment starten. Periodiek bevestigen dat Beeldacquisitie soepel in de loop van de video draait.

3. video analyse om te identificeren cel lot in reactie op Paclitaxel

  1. Bevestigen dat verbeelde cellen gezond in de loop van de beeldvorming experiment zijn. Cellen met DMSO behandeld moeten levensvatbare en actief delende.
    Opmerking: Als cellen vertonen tekenen van stress, niet de video te kwantificeren en in plaats daarvan richten op het optimaliseren van imaging voorwaarden48. Tekenen van stress imaging omvatten blebbing/sterven cellen, cellen die niet aan hechten/verspreiding op de plaat en cellen die aantonen dat een lage mitotische index en/of langdurige mitose. Mogelijke bronnen van stress zijn schommelingen in temperatuur of CO2 niveaus binnen de imaging kamer of fototoxiciteit48.
  2. Wanneer imaging een gehele gezichtsveld met een 10 X en 20 X doelstelling, kunnen honderden van afzonderlijke cellen aanwezig zijn. Daarom, om te helpen met kwantificatie, verdeel het gezichtsveld in kleinere kwadranten met behulp van beschikbare softwaretools. Score van cellen binnen elk kwadrant afzonderlijk (zoals beschreven in stappen 3.3.1–3.6.2).
  3. Bij het analyseren van de video, bijhouden van elke cel in een samengevoegde weergave met fase contrast en/of fluorescerende beelden. Software-analysefuncties gebruiken om de samengevoegde weergave te maken.
    1. Vanaf het begin van de video, een cel één interfase identificeren en bijhouden van de voortgang door middel van de cyclus van de cel met behulp van fase optica. Als u wilt bijhouden een eencellige, observeren de cel van frame naar frame met het blote oog. Interfase cellen als gevolg van hun afgevlakte morfologie (zoals beoordeeld door fase contrast) en hun gebrek aan DNA condensatie worden geïdentificeerd (zoals beoordeeld door H2B-GFP) (figuur 1A).
  4. Cellen die worden ingevoerd door mitose door observatie van cel afronding (met behulp van fase-contrast optiek) opsporen en/of chromosoom condensatie (met behulp van H2B-GFP) (figuur 1A-C). Zowel cel-afronding en chromosoom-condensatie zijn gemakkelijk met het blote oog gevisualiseerd.
    1. Aantekeningen toevoegen aan de tijd wanneer de cellen mitose invoert. Blijven bijhouden van de cel totdat haar lot (anafase zoals in stap 3.5, de dood van de cel van mitose zoals in stap 3.6.1 of mitotische ontsporing zoals in stap 3.6.2) wordt bereikt.
  5. Cellen moeten efficiënt hun chromosomen uitlijnen en voer anafase binnen 1 uur (Figuur 1 d). Visualiseer anafase door fase-contrast optiek als de cel begint te knijpen in tweeën of door visualisatie van poleward voortbewegende chromosomen aangeduid met H2B-GFP (figuur 1A). Aantekeningen toevoegen aan de tijd wanneer de cel anafase ondergaat.
  6. Cellen met paclitaxel behandeld blijven daarentegen, afgeronde met verkorte chromosomen voor enkele uren (h 3-40) (figuur 1B-D).
    1. Mitotically-gearresteerd cellen die ondergaan celdood worden geïdentificeerd.
      Opmerking: Cellen die tijdens de mitose sterven worden gevisualiseerd door fase contrast microscopie, zoals cellen zal bleb, krimpen, en/of scheuren (figuur 1B). Als imaging H2B-GFP, zal ook de chromosomen fragment tijdens celdood.
    2. Mitotically-gearresteerd cellen die cel ontsporing ondergaan worden geïdentificeerd.
      Opmerking: Cellen die u ondergaan mitotische ontsporing worden waargenomen door fase contrast microscopie, als ze weer uit in interfase afvlakken en decondense chromosomen zonder te ondergaan anafase (Figuur 1 c). Cellen die u ondergaan mitotische ontsporing aanleiding geven tot grote tetraploïde cellen die zijn vaak multinucleaire (Figuur 1 c).
  7. Blijven bijhouden van cellen van het oorspronkelijke gezichtsveld. Zodra een hele gezichtsveld wordt bijgehouden, verplaatsen naar een aparte gezichtsveld verworven uit hetzelfde goed en blijven bijhouden van cellen.

4. video analyse om te identificeren cel lot na mitotische ontsporing

  1. Lot van de cel na mitotische ontsporing (zoals beschreven in stap 3.6.2) beoordelen RPE-1 cuvetten uiting van het FUCCI-systeem. Naast fase contrast beeldvorming, is het noodzakelijk om zowel rode fluorescentie (indicatief van G1 fase) en groene fluorescentie (indicatief voor S/G2/M) beelden te verwerven).
    1. Het bijhouden van FUCCI RPE-1 cellen zoals beschreven in stap 3.3 via 3.7.
      1. Cellen alternatieve uitdrukking van de rode en groene fluorescerende eiwitten op de juiste wijze uit de analyse van de live-imaging celgegevens te bevestigen dat het FUCCI-systeem naar behoren functioneert, valideren van dat besturingselement. Cellen moeten overgang van volledig nucleaire rode fluorescentie vertonen om te exposeren volledig nucleaire groene fluorescentie tijdens de interfase als cellen vooruitgang van G-1 tot S-fase. Cellen moeten blijven tentoonstellen groene fluorescentie in de voltooiing van de mitose. Onmiddellijk na de mitose, moeten cellen opnieuw volledig rode fluorescentie tijdens de interfase vertonen.
        Opmerking: Hoewel methoden bestaan om te kwantificeren RFP zowel GFP fluorescentie intensiteiten van het systeem van de FUCCI in afzonderlijke cellen met behulp van fluorescerende sporen49, dit is vaak niet nodig als de kleurverandering van de fluorescentie robuust en zichtbaar met het blote oog is.
  2. Cellen gearresteerd in de mitose met fase contrast microscopie opsporen en volgen ze totdat ze ondergaan mitotische ontsporing, zoals omschreven in 3.4 en 3.6.2. Cellen die slip uit mitose en terug in interfase veranderen zal van het tentoonstellen van groene fluorescentie tijdens de mitose aan rode fluorescentie in G1 fase (figuur 2A- C).
    1. Bijhouden van deze cellen met fase contrast en epifluorescerende imaging gleed met het blote oog te beoordelen hun lot van de cel (figuur 2D).
      1. Identificeren van cellen die de celcyclus opnieuw in te voeren. Deze cellen zijn herkenbaar aan de rood-met-groen verandering in fluorescentie expressie met behulp van het FUCCI-systeem dat G1/s overgang (figuur 2A geeft).
      2. Cellen die ondergaan G1 celcyclus arrestatie opsporen. Deze cellen worden geïdentificeerd door expressie van rode fluorescentie die langer aanhoudt > 24 h (figuur 2B).
      3. Cellen die in interfase sterven opsporen. Deze cellen worden geïdentificeerd door cel breuk/blebbing/krimpen met fase contrast imaging (figuur 2C).

5. video analyse vast te stellen frequentie van nucleaire envelop breuk

  1. RPE-1 cellen uiten H2B-GFP en TDRFP-NLS gebruiken om te beoordelen van de nucleaire envelop breuk. Naast fase contrast imaging, zowel groene fluorescentie (FITC) afbeeldingen als rode fluorescentie (TRITC) aan te schaffen. Verwerven beelden elke 5 min om breuk visualiseren.
    Opmerking: Het is cruciaal voor het genereren van cellijnen waarin is de TDRFP-NLS efficiënt ingevoerd in de kern met minimale cytoplasmatische fluorescentie.
  2. De cellen van de afbeelding zoals beschreven in stap 3.3 via 3.4. Het TDRFP-NLS fluorescentie signaal en H2B-GFP moet mede lokaliseren tijdens de interfase. Bij mitose (als gevisualiseerde door cel afronding met behulp van fase optica en/of chromosoom condensatie door H2B-GFP), de nucleaire envelop zal breken en de TDRFP-NLS signaal zal cytoplasmatische (figuur 3A). Na de mitose, de nucleaire envelop zal hervormen in de cellen van de dochter en het signaal van de TDRFP-NLS nucleaire zal worden.
  3. Bijhouden dochtercellen gedurende de daaropvolgende interfase door live-cel imaging. Nucleaire breuk gebeurtenissen identificeren door het observeren van een voorbijgaande uitbarsting van nucleaire-gelokaliseerde TDRFP-NLS in het omliggende cytoplasma. Binnen enkele minuten de nucleaire envelop zal worden hersteld en de TDRFP-NLS zal worden relocalized aan de kern (figuur 3A).
    Opmerking: Vaak, de nucleaire DNA, zoals gevisualiseerd door H2B-GFP, zal blijken uitsteken buiten de breuk-site als een klein bleb.
  4. Score van de Fractie van de kernen die een breuk evenement tijdens de interfase ondergaan. Score van deze fractie, het aantal cellen die u ondergaan een breuk gebeurtenis over het totale aantal cellen tellen bijgehouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, werden RPE-1 cellen uiten H2B-GFP behandeld met een anti-mitotische of voertuig controle (DMSO) en geanalyseerd door live-cel imaging. Analyse kwam naar voren dat 100% van de mitotische RPE-1 cellen anafase gemiddeld 22 min gestart na het invoeren van de mitose (figuur 1A, 1 D). Daarentegen tentoongesteld RPE-1 cellen behandeld met paclitaxel een diepgaande mitotische arrestatie duurt en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het meest kritieke aspect voor lange termijn live-cel imaging is het waarborgen van de gezondheid van de cellen wordt beeld. Het is essentieel dat de cellen worden blootgesteld aan minimale vreemde milieustressoren, zoals ondermaatse omstandigheden ten aanzien van temperatuur, vochtigheid en/of CO2 niveaus. Het is ook belangrijk om te beperken photodamage van fluorescerende excitatie verlichting, zoals imaging stress is bekend dat het invloed op cel gedrag50. Beperking van photodamage k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

AFB, MAV en NJG bedank Ryan Quinton voor opmerkingen over de manuscript en Adrian Salische voor de TDRFP-NLS-construct. AFB en MAV worden gefinancierd door de NIGMS biomoleculaire farmacologie opleiding Grant 5T32GM008541. NJG is een lid van de Shamim en Ashraf Dahod Breast Cancer Research Laboratories en wordt ondersteund door de NIH subsidies GM117150 en CA-154531, de Karin Grunebaum Foundation, het Smith familie Awards programma, het programma van de geleerden Searle en het melanoom-onderzoek Alliance.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
fenolvrij, DMEM:F12 mediaHycloneSH3027202
10% foetaal runderserum (FBS)Gibco10438026
100 IE/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine.Gibco15070063
PBSGibco10010049
0,25% Trypsin/EDTAGemini50-753-3104
12-well glazen bodem beeldvormingsschaalCellvisP12-1.5H-N
PaclitaxelTSZ ChemRS036
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)SigmaNC0215085
OmgevingskamerIn Vivo Scientific
5% CO2AirgasZ03NI7432000201
15 mL conische buizenFisherbrand05-539-12
10 cm polystyreen weefselkweekplatenFalcon08772E
10 mL wegwerp serologische pipettenFisherbrand4488
5804R 15 amp centrifugeEppendorf97007-370
1000 microliters pipetteGilsonPipetman Classic
20 microliters pipetteGilsonPipetman Classic
p1000 pipette tipsSharpp1126
p20 pipette tipsSharpP1121
RPE-1 CellenATCCCRL-4000
Incubator Galaxy 170SEppendorfCO17011005
Pipette BoyIntegra156401
HemacytometerFisher Scientific0267110
Nikon Ti-E-PFS Geïnverteerde Microscoop voor Live Cel BeeldvormingMicro Video Instruments, Inc.MEA53100
Prior X-Y Stage Systeem en Witte Licht LED VerlichterMicro Video Instruments, Inc.500-H117P1N4
Prior Proscan 3 Controller XYZ met EncodersMicro Video Instruments, Inc.500-H31XYZE
Andor Digital CameraMicro Video Instruments, Inc.D10NLC
Nikon NIS Elements AR SoftwareMicro Video Instruments, Inc.MQS31000
SOLA LED Verlichter voor FluorescerendeMicro Video Instruments, Inc.SOLA-E
InVivo Omgevingskamer met CO2 Flow ControlMicro Video Instruments, Inc.Ti-IVS-100
Ti-ND6-PFS Perfect Focus Gemotoriseerde NeusstukMicro Video Instruments, Inc.MEP59391
Ti-C Systeem Condenser TurretMicro Video Instruments, Inc.MEL51000
Ti-C LWD LWD Lens Unit voor Systeem Condenser TurretMicro Video Instruments, Inc.MEL56200
Te-C LWD Ph1 ModuleMicro Video Instruments, Inc.MEH41100
CFI Plan Fluor DLL 10X Objectief na 0,3 wd 16mmMicro Video Instruments, Inc.MRH10101
CFI Super Plan Fluor ELWD 20xc ADM ObjectiefMicro Video Instruments, Inc.MRH48230

Referenties

  1. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1101-1112 (2015).
  2. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death Dis. 3, e411(2012).
  3. Jackson, J. R., Patrick, D. R., Dar, M. M., Huang, P. S. Targeted anti-mitotic therapies: can we improve on tubulin agents? Nat Rev Cancer. 7 (2), 107-117 (2007).
  4. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? J Cell Sci. 122 (Pt 15), 2579-2585 (2009).
  5. Rieder, C. L., Maiato, H. Stuck in division or passing through: what happens when cells cannot satisfy the spindle assembly checkpoint. Dev Cell. 7 (5), 637-651 (2004).
  6. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14 (2), 111-122 (2008).
  7. Huang, H. C., Mitchison, T. J., Shi, J. Stochastic competition between mechanistically independent slippage and death pathways determines cell fate during mitotic arrest. PLoS One. 5 (12), e15724(2010).
  8. Shi, J., Orth, J. D., Mitchison, T. Cell type variation in responses to antimitotic drugs that target microtubules and kinesin-5. Cancer Res. 68 (9), 3269-3276 (2008).
  9. Ganem, N. J., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131 (3), 437-440 (2007).
  10. Ganem, N. J., Storchova, Z., Pellman, D. Tetraploidy, aneuploidy and cancer. Curr Opin Genet Dev. 17 (2), 157-162 (2007).
  11. Ganem, N. J., Pellman, D. Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage. J Cell Biol. 199 (6), 871-881 (2012).
  12. Sotillo, R., Schvartzman, J. M., Socci, N. D., Benezra, R. Mad2-induced chromosome instability leads to lung tumour relapse after oncogene withdrawal. Nature. 464 (7287), 436-440 (2010).
  13. Sotillo, R., et al. Mad2 overexpression promotes aneuploidy and tumorigenesis in mice. Cancer Cell. 11 (1), 9-23 (2007).
  14. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
  15. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4 (8), e6564(2009).
  16. McGuire, W. P., et al. Cyclophosphamide and Cisplatin Compared with Paclitaxel and Cisplatin in Patients with Stage III and Stage IV Ovarian Cancer. New England Journal of Medicine. 334 (1), 1-6 (1996).
  17. McGuire, W. P., et al. Taxol: a unique antineoplastic agent with significant activity in advanced ovarian epithelial neoplasms. Ann Intern Med. 111 (4), 273-279 (1989).
  18. Ettinger, D. S. Taxol in the treatment of lung cancer. J Natl Cancer Inst Monogr. (15), 177-179 (1993).
  19. Weaver, B. A. How Taxol/paclitaxel kills cancer cells. Mol Biol Cell. 25 (18), 2677-2681 (2014).
  20. Jordan, M. A., Wilson, L. Microtubules as a target for anticancer drugs. Nat Rev Cancer. 4 (4), 253-265 (2004).
  21. Wall, M. E., Wani, M. C. Camptothecin and Taxol: Discovery to Clinic-Thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture. Cancer Research. 55 (4), 753-760 (1995).
  22. Schiff, P. B., Horwitz, S. B. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (3), 1561-1565 (1980).
  23. Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22 (22), R966-R980 (2012).
  24. Musacchio, A. The Molecular Biology of Spindle Assembly Checkpoint Signaling Dynamics. Curr Biol. 25 (20), R1002-R1018 (2015).
  25. Uetake, Y., et al. Cell cycle progression and de novo centriole assembly after centrosomal removal in untransformed human cells. J Cell Biol. 176 (2), 173-182 (2007).
  26. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
  27. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
  28. Gu, J., et al. Cell cycle-dependent regulation of a human DNA helicase that localizes in DNA damage foci. Mol Biol Cell. 15 (7), 3320-3332 (2004).
  29. Easwaran, H. P., Leonhardt, H., Cardoso, M. C. Cell cycle markers for live cell analyses. Cell Cycle. 4 (3), 453-455 (2005).
  30. Hahn, A. T., Jones, J. T., Meyer, T. Quantitative analysis of cell cycle phase durations and PC12 differentiation using fluorescent biosensors. Cell Cycle. 8 (7), 1044-1052 (2009).
  31. Bajar, B. T., et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases. Nat Methods. 13 (12), 993-996 (2016).
  32. Gekara, N. O. DNA damage-induced immune response: Micronuclei provide key platform. J Cell Biol. 216 (10), 2999-3001 (2017).
  33. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  34. Crasta, K., et al. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482 (7383), 53-58 (2012).
  35. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J., Hetzer, M. W. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154 (1), 47-60 (2013).
  36. Maciejowski, J., Li, Y., Bosco, N., Campbell, P. J., de Lange, T. Chromothripsis and Kataegis Induced by Telomere Crisis. Cell. 163 (7), 1641-1654 (2015).
  37. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522 (7555), 179-184 (2015).
  38. Denais, C. M., et al. Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration. Science. 352 (6283), 353-358 (2016).
  39. Raab, M., et al. ESCRT III repairs nuclear envelope ruptures during cell migration to limit DNA damage and cell death. Science. 352 (6283), 359-362 (2016).
  40. Bernhard, W., Granboulan, N. THE FINE STRUCTURE OF THE CANCER CELL NUCLEUS. Exp Cell Res. 24 (Suppl 9), 19-53 (1963).
  41. de Noronha, C. M., et al. Dynamic disruptions in nuclear envelope architecture and integrity induced by HIV-1 Vpr. Science. 294 (5544), 1105-1108 (2001).
  42. Vargas, J. D., Hatch, E. M., Anderson, D. J., Hetzer, M. W. Transient nuclear envelope rupturing during interphase in human cancer cells. Nucleus. 3 (1), 88-100 (2012).
  43. Sieprath, T., Darwiche, R., De Vos, W. H. Lamins as mediators of oxidative stress. Biochem Biophys Res Commun. 421 (4), 635-639 (2012).
  44. Mitchison, T. J., Pineda, J., Shi, J., Florian, S. Is inflammatory micronucleation the key to a successful anti-mitotic cancer drug? Open Biol. 7 (11), (2017).
  45. Shenk, E. M., Ganem, N. J. Generation and Purification of Tetraploid Cells. Methods Mol Biol. 1413, 393-401 (2016).
  46. Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines. J Vis Exp. (115), (2016).
  47. Salmon, E. D., Canman, J. C. Proper alignment and adjustment of the light microscope. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 4 Unit 4 1 (2001).
  48. Cole, R. Live-cell imaging. Cell Adh Migr. 8 (5), 452-459 (2014).
  49. Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J Vis Exp. (111), (2016).
  50. Douthwright, S., Sluder, G. Live Cell Imaging: Assessing the Phototoxicity of 488 and 546 nm Light and Methods to Alleviate it. J Cell Physiol. 232 (9), 2461-2468 (2017).
  51. Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotechnol. 34 (7), 703-706 (2016).
  52. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  53. Jones, T. R., et al. Scoring diverse cellular morphologies in image-based screens with iterative feedback and machine learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (6), 1826-1831 (2009).
  54. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nat Cell Biol. 5 (3), 255-260 (2003).
  55. Bekker-Jensen, S., Lukas, C., Melander, F., Bartek, J., Lukas, J. Dynamic assembly and sustained retention of 53BP1 at the sites of DNA damage are controlled by Mdc1/NFBD1. J Cell Biol. 170 (2), 201-211 (2005).
  56. Loewer, A., Batchelor, E., Gaglia, G., Lahav, G. Basal dynamics of p53 reveal transcriptionally attenuated pulses in cycling cells. Cell. 142 (1), 89-100 (2010).
  57. Lekshmi, A., et al. A quantitative real-time approach for discriminating apoptosis and necrosis. Cell Death Discovery. 3, 16101(2017).
  58. Jullien, D., Vagnarelli, P., Earnshaw, W. C., Adachi, Y. Kinetochore localisation of the DNA damage response component 53BP1 during mitosis. J Cell Sci. 115 (Pt 1), 71-79 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

PaclitaxelbehandelingBeoordeling van het CellotMitotische SlippageRuptuur van de KernenvelopFUCCI-systeemH2B-GFP-labelingFasecontrastmicroscopieLangetermijnbeeldvormingAnalyse van Enkele Cellen
Op lange termijn Live-cel Imaging om te beoordelen van cel lot in reactie op Paclitaxel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.