Synthese van Meerwandige koolstof nanobuisjes bewerkt met zilveren nanodeeltjes en evaluatie van hun antibacteriële activiteiten en cytotoxische eigenschappen

Samenvatting

In deze studie werden antimicrobiële nanomaterialen gesynthetiseerd door zure oxidatie van multiwalled koolstof nanotubes en de daaropvolgende reductieve afzetting van zilveren nanodeeltjes. Antimicrobiële activiteit en cytotoxiciteit tests werden uitgevoerd met de als-bereid nanomaterialen.

Samenvatting

In deze studie, werden Meerwandige koolstof nanobuisjes (MWCNTs) behandeld met een oplossing van de waterige zwavelzuur vormen een zuurstof gebaseerde functionele groep. Zilveren MWCNTs werden voorbereid door de reductieve afzetting van zilver uit een waterige oplossing van AgNO₃ op de geoxideerde MWCNTs. Gezien de unieke kleur van de CNTs, was het niet mogelijk ze toepassen op de minimale remmende concentratie of mitochondrial toxiciteit testen voor de evaluatie van de toxiciteit en antibacteriële eigenschappen, aangezien zij met de testen interfereren zou. De remming zone en bactericide minimumconcentratie voor de Ag-MWCNTs werden gemeten en Live/Dead en Trypan Blue vitrotests werden gebruikt voor het meten van de toxiciteit en antibacteriële eigenschappen zonder zich te mengen met de kleur van de CNTs.

Inleiding

Het uiteindelijke doel van deze studie is dat milieuvriendelijke antibacteriële nanomaterialen die de groei van bacteriën remmen kan die vorm biofilms. Deze antibacteriële nanomaterialen hebben het potentieel om de toxiciteit en antibiotica resistentie problemen gebruikte chemicaliën of antibiotica chemische samenstellingen te overwinnen. Een biofilm is een gehydrateerd extracellulaire polymere stof (EPS) die is samengesteld uit polysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden^1,2. Biofilms voorkomen het binnendringen van vreemde stoffen en bacteriën groeien krachtig^3,4. Biofilms veroorzaken geur en chronische infectieziekten^5,6. Methylobacterium spp., bijvoorbeeld groeit door vast te houden aan plaatsen waar altijd water aanwezig is of waar het is moeilijk om te garanderen dat bacteriële uitgeroeid op een continue basis, zoals air conditioner warmtewisselaars, doucheruimtes en medische hulpmiddelen. Deze soorten biofilms veroorzaken geur en chronische infectieziekten^5,6.

Typisch, chemicaliën of antibiotica chemische verbindingen worden gebruikt voor de remming van de groei van bacteriën die vormen van biofilms. De opkomst van antibiotica resistente bacteriën en bezorgdheid over in vivo veiligheid van chemische stoffen rijdt de noodzaak tot het ontwikkelen van nieuwe materialen om te voorkomen dat de vorming van biofilms en dat remt de groei van bacteriën.

In deze studie, worden antimicrobiële nanomaterialen gesynthetiseerd die vrij van antibioticaresistentie en toxiciteit zijn. Zilver is een bekende antimicrobiële stof, en recente ontwikkelingen in de nanowetenschap en nanotechnologie hebben geleid tot actief onderzoek naar de antimicrobiële werking van metalen nanodeeltjes^7,8. Recente studies hebben gemeld dat de kleine omvang en hoge oppervlakte-naar-volumeverhouding van de nanodeeltjes in verhoogde antibacteriële activiteit^{9,10,11 resulteren}.

De hier vermelde nanomaterialen combineren zilveren nanodeeltjes met toegenomen antimicrobiële eigenschappen en koolstof nanotubes met een hoge hoogte-breedteverhouding, waardoor de oppervlakte per eenheid volume. De bewerkte zilveren nanoparticle-koolstof nanobuis samengestelde vertoont aanzienlijke antimicrobiële eigenschappen en minimale toxiciteit voor menselijke en dierlijke cellen. De synthetische processen in eerdere studies gebruik gevaarlijke reductoren zoals NaBH₄formamide, dimethylformamide en hydrazine. Het proces is tijdrovend, ingewikkeld en gevaarlijk. Ethanol het synthetische proces gemeld hier gebruikt als een aanzienlijk minder gevaarlijke reducerende agent.

De remming zone en bactericide minimumconcentratie (MBC) voor de Ag-MWCNTs werden gemeten; Live/Dead en Trypan Blue vitrotests werden gebruikt voor het meten van de toxiciteit en antibacteriële eigenschappen. Minimale remmende concentratie (MIC) en mitochondriale toxiciteit (MTT) vitrotests werden niet uitgevoerd vanwege de ongebruikelijke kleur van de koolstof nanotubes die zou hebben bemoeid met de testen. Tot slot werd de minimumconcentratie om te voorkomen dat de groei van Methylobacterium spp. zonder zoogdiercellen vastgesteld.

Protocol

1. MWCNT-oxidatie

1. Maat 30-50 mg MWCNT in een flacon 50 mL. Voeg langzaam 8 mL van een H-₂dus₄: HNO₃ oplossing (90% beginconcentratie, 3:1 vol/vol) Pipetteer met 1 mL pipet tips.
   Let op: Dit preparaat moet plaatsvinden in een chemische zuurkast.
   1. Laat 30 min voor de exotherme reactie om te voltooien.
2. Bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing bij 60-80 ° C en 160 W voor 1 h tot MWCNT vestigt zich aan de onderkant van de flacon.
   Let op: Het waterniveau in de ultrasoonapparaat moet lager zijn dan de top van de flacon zodat water zal niet in de flacon worden binnengebracht.
3. Breng de oplossing over in een centrifugebuis.
   1. Voeg 30 mL gedestilleerd water met een micropipet, ontkleuring aan de MWCNT-COOH-oplossing.
      Let op: Een sterke exothermische reactie treedt op bij toevoeging van gedestilleerd water. Voeg gedistilleerd water langzaam en laat tijd voor koeling.
4. Centrifugeer de MWCNT-COOH-oplossing van 12.000 x g en kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   Let op: Wanneer een centrifuge, zorgen dat de centrifuge door het plaatsen van een buisje met hetzelfde gewicht tegenover het monsterbuisje evenwichtig blijft.
5. Verwijder de bovendrijvende vloeistof met een pipet en 1 mL pipet tip. Voeg 5 mL ethanol met een pipet en 1 mL pipet tip. Spoel de wanden van de flacon met extra afgepipetteerde ethanol. Centrifugeer de oplossing van 12.000 x g en kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
   1. Het bepalen van pH van supernatans met pH-papier. Herhaal wassen en centrifugeren totdat het supernatant pH neutraal is.
6. Verwijder alle supernatant. Voeg 1 mL gedestilleerd water te precipiteren en MWCNT-COOH gelijkmatig te verspreiden in de oplossing. Freeze-Dry oplossing bij-60 ° C onder vacuüm tot droog.

2. zilver Nanoparticle depositie op MWCNTs

1. 10 mg MWCNT-COOH plaats in een conische buis van 50 mL en Verdun met 30 mL gedestilleerd water. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing bij 60 ° C en 160 W gedurende 1 uur.
2. 6 mL 0,1 N AgNO₃ plaats in een conische buis van 50 mL en Verdun met 18 mL gedestilleerd water. Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing bij 60 ° C en 160 W gedurende 1 uur.
   Let op: Voeg AgNO₃ in verhouding tot de totale massa van MWCNTs, zodat de totale massa van Ag niet hoger is dan 20%.
3. Voeg de AgNO₃ oplossing ontkleuring aan de oplossing van de MWCNTs met een pipet en 1 mL pipet tip terwijl het mengsel bij 60 ° C en 160 W. doorgaan sonicating voor 1 h na het toevoegen van de AgNO₃sonicating.
4. Centrifugeer de oplossing van 12.000 x g en kamertemperatuur gedurende 15 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Centrifugeer de oplossing en verwijder het supernatant extra tweemaal.
5. Voeg 1 mL gedestilleerd water aan de Ag-MWCNTs-mengsel en het precipitaat op in de oplossing gelijkmatig te verspreiden. Voeg 5 mL ethanol en laat de reactie te gaan bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
6. Centrifugeer de oplossing van 12.000 x g en kamertemperatuur gedurende 15 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
7. Het bepalen van pH van supernatans met pH-papier. Herhaal wassen en centrifugeren totdat supernatant pH neutraal is.
8. Voeg 1 mL gedestilleerd water toe aan Ag-MWCNTs en gelijkmatig verspreiden in oplossing. Freeze-Dry de oplossing bij-70 ° C onder vacuüm gedurende 24 uur.

3. zone van inhibitie-Test

1. Meng 18.12 g R2A agar en gedestilleerd water in een maatkolf van 1 liter. Het mengsel in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten steriliseren.
2. Laat gel afkoelen bij kamertemperatuur. Breng 10 mL van de gel in petrischalen vóór verharding te bereiden het solide medium.
3. Plaats 100 µL van bacteriën op het solide medium. Verspreiding van de bacteriën op de vaste drager met behulp van een spreider.
   Let op: Deze procedure moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast verlicht met een alcohol-lamp.
4. Incubeer de gerechten bij 30 ° C gedurende 48 uur.
5. Mix-3.12 g R2A bouillon met gedestilleerd water in een maatkolf van 1 liter. Het mengsel in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 minuten steriliseren.
6. De volwassen kolonies overbrengen in een vloeibaar medium met behulp van een lus en naald en bebroed in een broedmachine op 180 rpm en 30 ° C.
7. Opnemen van de OD (extinctie) waarde door UV-spectrofotometrie op 600 nm op uurbasis voor het meten van de groei van bacteriën.
   Opmerking: R2A agar werd gebruikt in deze test, in plaats van de standaard Mueller-Hinton agar, omdat R2A de voorkeur agar voor groei van Methylobacterium spp. is
8. Plaats 10 mL bereid R2A agar in een petrischaal te bereiden een bodem agar.
   1. Meng 3,12 g R2A Bouillon en 8 g agar met 1 L gedestilleerd water. Het mengsel in een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 15 min. plaats 10 mL van deze gel op de bodem agar te steriliseren.
9. Laden 50 µL van Ag-MWCNTs oplossing op steriel papier schijf met een micropipet.
   1. Droog en steriliseren Ag-MWCNTs monster in een vacuuemcel onder UV-licht voor 30 min.
10. Plaats Ag-MWCNTs monster op agar.
11. Incubeer de agarplaat bij 30 ° C gedurende 48 uur.
12. Maatregel zone van remming¹².
    Opmerking: Instructies voor software die wordt gebruikt in de verwijzingen zijn opgenomen.

4. antibacteriële Test

1. Herhaal stap 3.1 tot en met 3.7 te bereiden bacteriecultuur.
2. Inoculeer op maximale OD, 100 µL van bacteriën in 3 mL verse vloeistof met een pipet en 100-µL micro pipette uiteinde.
3. Bereiden van vijf 50 µL monsters van het control-oplossing in de conische buisjes 15 mL. Voeg het volgende toe aan elke buis: 1) methanol; 2) COOH-1000 µg Mn/mL MWCNT; 3) MWCNTs-50 µg Mo/mL Ag; 4) MWMWCNTs-40 µg/mL Ag; 5) MWCNTs-30 µg/mL Ag.
4. Incubeer bij 180 rpm en 30 ° C, totdat het besturingselement maximaal actief, zoals bepaald door UV-spectrofotometrie, zoals hierboven beschreven is.
5. Meten van de OD-waarde van elk monster en bereken de concentratie MIC. De OD-waarde is direct gerelateerd aan het aantal bacteriële cellen in het monster Bouillon.
6. Verspreid de gekweekte bacteriën op een solide medium met een strooier.
7. Incubeer de schotel bij 30 ° C gedurende 48 uur.
8. Graaf bacteriële kolonies en de maatregel CFU waarden om te bepalen van de antibacteriële activiteit¹².
   Opmerking: Instructies voor software die wordt gebruikt in de verwijzingen zijn opgenomen.

5. levensvatbaarheid Assay

1. Na het verwijderen van de cellen van de cultuur van incubator, zuiging van het medium en spoel driemaal met een dropwise wassen van 5 mL PBS.
2. Voeg 1 mL trypsine-EDTA in PBS naar de gewassen cel en zuig na 1 min.
   1. Tik op de plaat geplakt cellen verwijderen.
3. Voeg 5 mL DMEM (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium) en verwijder vervolgens de cellen. Centrifugeer de monsters bij 200 x g gedurende 3 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie.
   1. Voeg vervolgens 1 mL DPBS en meng.
   2. Cellen tellen in 10 µL van de oplossing met een geautomatiseerde machine voor het tellen van de cel.
      Opmerking: Instructies voor cel-tellen machine gebruikt zijn opgenomen in het referenties¹³.
4. Plaats 1 × 10⁵ van AML12 cellen per putje in een zes-well plaat met DMEM oplossing. Het medium bevat 10% (v/v) foetale runderserum en 1% steriele antibioticum.
5. Incubeer plaat voor 8-12 h bij 37 ° C in een omgeving met 5% CO₂/95% lucht.
6. Zuig het supernatant uit putten met een aspirator.
   1. Elk monster bestaat uit controle, NMS-DMSO (dimethylsulfoxide) en 30-40 µg/mL Ag-MWCNT tot 1 mL van de DMEM toevoegen.
   2. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO₂/95% lucht omgeving voor 8 h.
7. Verwijder supernatant en wassen monsters met 5 mL PBS.
8. Voeg 1 mL bereid leven/dood kit (20 µL van 2 mM EthD-1 met 5 µL van 4 mM calceïne AM in DMSO in 10 mL PBS) ontkleuring naar de cel.
9. Incubeer bij room temperature voor 30-45 min of 37 ° C gedurende 10 minuten maatregel fluorescentie met standaard fluorescentie microscopie op 100 X of 300 X.

6. Trypan Blue Assay

1. Voorbereiding van monsters volgens stappen 5.1 via 5.6.2 hierboven.
2. Verwijder de bovendrijvende vloeistof.
3. Wassen van de plaat met 1 mL van de 1 x DPBS en decanteren.
4. Voeg 1 mL trypsine plaat en incubeer gedurende 3 minuten om los van de cellen van de cultuur te maken. Cel kweekmedium gebruik te wassen plaat en verzamelen van cellen. Plaats verzameld cellen in een buis 15 mL.
5. Centrifugeer buis bij 200 x g- en 4 ° C gedurende 3 minuten.
6. Vloeistof wordt weggeworpen. Voeg 1 mL verse medium tot cel pellet en opnieuw verspreiden van de cellen.
7. Voeg 10 µL van trypan blauw met 10 µL van verspreide cellen en cellen tellen met een geautomatiseerde machine voor het tellen van de cel.
   Opmerking: Instructies voor cel-tellen machine gebruikt zijn opgenomen in de verwijzingen.

Resultaten

Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beelden bevestigen de vorming van Ag-MWCNTs (figuur 1A en 1B). Hun succesvolle synthese werd bevestigd door de verandering in oppervlakte lading. De grootte van de deeltjes van de Ag afgezet op de MWCNTs werd berekend (Figuur 1 c). De gemiddelde deeltjesgrootte was ongeveer 3.83 nm. Het XRD patroon van de als-gesynthetiseerd Ag-MWCNTs wordt weergegeven in

Discussie

Wij rapporteren hier een eenvoudige methode voor de bereiding van MWCNTs met gedeponeerde Ag nanodeeltjes. Deze zilver-bevattende nanomateriaal toont aanzienlijke antibacteriële activiteit en minimale potentieel voor ongecontroleerde absorptie van zilveren nanodeeltjes in het lichaam. We aantonen dat 30 µg/mL gesynthetiseerde Ag-MWCNTs is een effectieve niveau van antibacteriële activiteit tegen Methylobacterium spp. met te verwaarlozen cytotoxiciteit te lever zoogdiercellen. Hoewel extra verbeteringen en beoord...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.1 N zilvernitraat	SIGMA-ALDRICH	1090811000
Koolstof nanobuisjes, meerwandig	Tokyo Chemical Industry Co., LTD	308068-56-6
R2A agar	MBcell	MB-R1129
R2A bouillon	MBcell	MB-R2230
Methylobacterium spp.	KCTC	12618	van Korea Collection for Type Cultures Daejeon Korea 12618, Daejon, Korea
LIVE/DEAD Cel beeldvormingsset	ThermoFisher SCIENTIFIC	R37601
AML12			van Chungnam University, Dajeon, Korea
menselijke PBMC	ATCC	PCS-800-011
TEM	JEOL	JEM-2100F
XRD	Rigaku	D/MAX 2500	Cu K fotonbron (40kV, 100mA)
JuLI Br	NanoEnTek	JULI-BRSC