Methodenartikel

Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken

DOI:

10.3791/57385

⸱

1 mei 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology, National Taiwan University, 2Biology Centre, Institute of Entomology, Czech Academy of Sciences, 3Faculty of Science, University of South Bohemia, 4Institute of Evolutionary Biology, CSIC-UPF

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript toont de uitputting van de genexpressie in de middendarm van de Duitse kakkerlak via orale inname van double-stranded RNA ingekapseld in liposomen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA-interferentie (RNAi) is algemeen toegepast voor het blootleggen van de biologische functies van talrijke genen, en als een pest control tool operationele door verstoring van essentiële genexpressie is overwogen. Hoewel verschillende methoden, zoals injectie, voeding en inweken, hebben gemeld voor de succesvolle levering van double-stranded RNA (dsRNA), is de efficiëntie van RNAi via mondelinge levering van dsRNA zeer variabel tussen verschillende groepen van insecten. De Duitse kakkerlak, Blattella germanica, is zeer gevoelig voor de injectie van dsRNA, zoals blijkt uit de vele studies die eerder zijn gepubliceerd. De huidige studie beschrijft een methode om aan te tonen dat de dsRNA ingekapseld met liposoom dragers voldoende is om de afbraak van dsRNA retard door middendarm SAP. Met name de doorlopende invoer van dsRNA ingekapseld door liposomen aanzienlijk vermindert de tubuline expressie in de middendarm, en leidde tot de dood van kakkerlakken. Kortom, zou de formulering en het gebruik van dsRNA lipoplexes, die tegen nucleasen dsRNA beschermen, een praktisch gebruik van RNAi voor insecten bestrijding van plagen in de toekomst.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAi is aangetoond als een effectieve methode om vechtpartij genexpressie via een mechanisme van een post-transcriptional silencing pathway geactiveerd door dsRNA moleculen in vele eukaryoten1. De afgelopen tien jaar van studie, RNAi uitgegroeid tot een nuttig instrument om te bestuderen van de functies van genen van ontwikkeling tot gedrag door uitputting van de expressie van specifieke genen via injectie en/of voeding van dsRNA in verschillende taxa van insecten2,3. Wegens de specificiteit en de robuustheid van de afbrekende werking, wordt de toepassing van RNAi momenteel beschouwd als een mogelijke strategie voor pest control beheer4,5. Echter, de efficiëntie van RNAi varieert sterk tussen insecten soorten, afhankelijk van de verschillende genen worden gericht en de leveringsmethoden. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat de instabiliteit van dsRNA, die is afgebroken door ribonucleasen, een cruciale factor in de beperkte effectiviteit van RNAi5,6 is. Bijvoorbeeld, is de lage RNAi gevoeligheid in de Manduca sexta uiteengezet door het feit dat de dsRNA gemengd met Hemolymfe snel aangetaste binnen 1 uur7was. Ook is de aanwezigheid van alkalische nucleasen in de middendarm, die efficiënt geconsumeerde dsRNA degraderen, sterk gecorreleerd met lage RNAi efficiëntie in verschillende insecten orders8,9,10.

De mondelinge levering van dsRNA is bijzonder interessant voor de toepassing van RNAi in een strategie voor het toegangsbeheer van pest, maar een methode om de afbraak van dsRNA door de nucleasen in de middendarm retard heeft nog niet zijn ontwikkeld, die zou hebben het potentieel om effectieve RNAi via voeding. Echter, de apathie van RNAi mondelinge levering van dsRNA is gemeld door de grote hoeveelheid dsRNA, bijvoorbeeld 50 µg in Bombyx mori, voeding of continu voeding voor 8 dagen (in totaal 8 µg dsRNA) bij de locust-soorten. De Duitse kakkerlak, Blattella germinica, is zeer gevoelig voor RNAi door de injectie van dsRNA11,12,13,14, maar is niet ontvankelijk voor dsRNA via voeding. Onlangs, Lin et al. (2017) hebben aangetoond dat de dsRNA ingekapseld met liposoom luchtvaartmaatschappijen resulteert in succesvolle RNAi aan knockdown de α-tubuline genexpressie in de middendarm en trigger aanzienlijke sterfte van de Duitse kakkerlak15. Zoals de afbraak van dsRNA in de middendarm de beperkende factor voor mondelinge RNAi is, dienen de liposomen vervoerders als een voertuig te dsRNA behoeden voor degradatie, dat gemakkelijk toepassing op andere insecten met sterke nuclease activiteiten in de darm is. Van de nota, de reden voor de keuze van de specifieke transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) gebruikten we zoals liposoom vervoerder in het huidige protocol is dat het voor insect cel lijn transfectie is getest met minder toxiciteit, volgens de instructies van de fabrikant. Volgens de vergelijking van verschillende liposoom transfectie systemen in Gharavi et al. (2013) 16, de efficiëntie van transfecting Klein Mengend RNA (siRNA) is ongeveer hetzelfde tussen dit en andere commercieel beschikbare systemen die zijn gebruikt voor dsRNA levering systemen in andere insecten17,18 . Bovendien is onze voeding methode voorzichtig genoeg om de juiste hoeveelheid dsRNA wordt ingenomen door elke kakkerlak, en dat de resultaten zijn robuust en bevestigd. Kortom aantonen het huidige protocol en de resultaten dat met behulp van dsRNA lipoplexes dsRNA stabiliteit verbetert en de deur naar het ontwerp van de mondelinge uitspraak van de strategie van RNAi opent, die is een veelbelovende aanpak voor de bestrijding van plagen in de toekomst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. synthese en voorbereiding van dsRNA

  1. Het identificeren van de sites target dsRNA in de 3' niet-vertaalde regio van de doelgenen. De dsTub wordt gebruikt voor het richten van het α-tubuline (bad) gen (GenBank toetreding nummer: KX228233), en dsEGFP zoals een negatieve dsRNA-besturingselement wordt ontworpen van de opeenvolging van versterkte groene fluorescentie eiwit (EGFP; GenBank toetreding nummer: LC311024).
  2. Standaard PCR versterking om te synthetiseren de dsRNA sjablonen met gen-specifieke primers met de T7 promotor volgorde uitvoeren (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'). De PCR versterking voorwaarden en primer informatie gebruikt zijn die gemeld door Lin et al.. (2017) 12 (Zie Tabel van materialen).
  3. Doorgaan met dsRNA voorbereiding met behulp van een Transcriptie T7 Kit (Zie Tabel of Materials), volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Opbrengst van de hoge hoeveelheid dsRNA, Meng twee reacties in één buis (in totaal 40 µL) en Incubeer bij 37 ° C's nachts.
  4. Voeg 2 µL van DNase (Zie Tabel van materialen) in dsRNA monsters gedurende 15 minuten bij 37 ° C te verteren DNA sjablonen.
  5. Voeg 200 µL extractie reagens toe (Zie Tabel van materialen) en 40 µL chloroform en vortex.
  6. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verzamelen supernatant (150 µL) in een nieuwe microcentrifuge buis.
  7. Neerslag dsRNA door toevoeging van 150 µL isopropanol en incubatie gedurende 15 minuten op het ijs.
  8. Centrifugeer gedurende 15 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verwijderen van de bovendrijvende substantie.
  9. Voeg 200 µL van de 70%-ethanol te wassen dsRNA pellets. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.
  10. Verwijder de ethanol en herhaalt u de stappen van ethanol wassen.
  11. Verwijder de ethanol en droog dsRNA pellet door centrifugaal vacuüm concentrators voor 3 min en resuspendeer dsRNA met RNase-gratis water.
  12. Bepalen van de hoeveelheid van de gezuiverde dsRNA met behulp van een micro-volume UV-Vis spectrofotometer (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant en aan te passen aan de gewenste concentratie (bijv., 0,25 µg/µL voor bereiding van dsRNA lipoplexes).
  13. Bewaar de dsRNA monsters bij-20 ° C voor maximaal 3 maanden.

2. voorbereiding van dsRNA Lipoplexes

  1. Verdun 4 µL van het transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) door toevoeging van 4 µL van 5% glucose-oplossing. Verdun 4 µL van de dsRNA (1 µg) door toevoeging van 4 µL van 5% glucose-oplossing.
  2. Voeg de verdunde liposoom reagens oplossing onmiddellijk in de oplossing van verdunde dsRNA allemaal tegelijk. Vortex kort naar meng ze en incubeer gedurende 15 min bij 25 ° C.
    Opmerking: Meng geen de oplossingen in de omgekeerde volgorde.
  3. De dsRNA lipoplexes zijn klaar voor gebruik. Gebruik binnen 1 uur voor de voorbereiding en negeren na 1 uur.
    Opmerking: Volgens de aanwijzingen van de fabrikant moeten de lipoplexes zo spoedig mogelijk worden gebruikt.

3. collectie van extracellulaire enzymen uit Hemolymfe en middendarm SAP

  1. Insect zoute buffer (10 x voorraad)
    1. Meng 900 mL dubbel gedestilleerd water met 109.3 g NaCl, 15.7 g KCl, 6.3 g CaCl2en 8.3 g MgCl2·6H2O.
    2. Breng pH op 6,8, en vul aan tot 1000 mL.
  2. Hemolymfe collectie
    1. Anesthetize de kakkerlakken op ijs totdat zij niet worden verplaatst gedurende 3 minuten.
    2. Houd de kakkerlak met twee vingers (duim en wijsvinger), en de ventrale zijde van de kakkerlak opdagen.
    3. Gebruik de ontleden schaar af te snijden uit het topje van een coxa van een achterpoot.
      Opmerking: Snijd de aangesloten kruising tussen coxa en trochanter. De besnijdenis van het andere deel van de coxa was minder efficiënt verzamelen Hemolymfe.
    4. Knijp de buik zachtjes met de middelste vinger, en verzamelen de Hemolymfe bloeden uit de incisie met een 10 µL micropipet.
    5. Zwembad de Hemolymfe uit verschillende kakkerlakken (5 personen) in een microcentrifuge buis.
      Opmerking: Houd de microcentrifuge buizen op ijs ter voorkoming van melanization. De gemiddelde omvang van Hemolymfe verkregen van een mannelijke kakkerlak is 2-3 µL.
    6. Spin down de Hemolymfe kort met een benchtop centrifuge voor 10 s.
    7. Breng gewenste hoeveelheid Hemolymfe (dat wil zeggen, 10 µL), en meng het met 50 µL van 1 x insect zoute buffer.
    8. Centrifugeer gedurende 10 min bij 1.000 x g bij 4 ° C te draaien naar beneden hemocytes. Het supernatant overbrengen in een schone microcentrifuge buis.
    9. De totale eiwitconcentratie met behulp van een micro-volume UV-Vis spectrofotometer door het meten van de A28015te kwantificeren.
    10. Aanpassen elk monster om dezelfde eiwitconcentratie (6 mg/µL van totale proteïne).
  3. Middendarm SAP collectie
    1. Anesthetize de kakkerlakken op ijs. Herstellen van de kakkerlakken ventrale zijde omhoog op de dissectie-plaat met koude 1 x insect zoute buffer met behulp van insect pins.
    2. Ontleden de buik met een fijne pincet. Verwijder de hele darm (met inbegrip van de voorste, mid, en hind darm) te een verse schotel met 1 x insect zoute buffer.
    3. De voorste en achterste darm te verwijderen en de middendarm snel overbrengen in een microcentrifuge-buis die 100 µL insect zoute buffer bevat.
    4. Zwembad de midguts van zes kakkerlakken in de dezelfde buis, en vortex voor 10 s.
    5. Centrifugeer gedurende 10 min bij 1.000 x g bij 4 ° C te draaien naar beneden de hemocytes en darmen weefsels. Het supernatant overbrengen in een schone microcentrifuge buis.
    6. De totale eiwitconcentratie met behulp van een micro-volume UV-Vis spectrofotometer door het meten van de A28015te kwantificeren.
    7. Aanpassen elk monster om dezelfde eiwitconcentratie (6 mg/µL van totale proteïne).

4. dsRNA afbraak Assay

  1. Vers bereiden 4 µL van de naakte dsRNA of dsRNA lipoplexes (1 µg).
  2. Meng dsRNA oplossingen met 10 µL van insecten zoute buffer (control), geëxtraheerd enzymen uit Hemolymfe of middendarm SAP.
  3. Voeg 2 µL EGTA (20 mM) of RNase-gratis water te scheiden van monsters als besturingselementen voor remming van het enzym activiteiten.
  4. Incubeer gedurende 1 uur of langer (6, 12 of 24 uur) bij 25 ° C.
  5. Voeg 200 µL extractie reagens en 40 µL chloroform, vervolgens vortex.
  6. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verzamelen supernatant (150 µL) in een nieuwe microcentrifuge buis.
  7. Neerslag dsRNA door toevoeging van 150 µL isopropanol en incubatie gedurende 15 minuten op het ijs.
  8. Centrifugeer gedurende 15 min bij 13.000 x g bij 4 ° C, dan verwijderen van de bovendrijvende substantie.
  9. Voeg 200 µL van de 70%-ethanol te wassen dsRNA pellets. Centrifugeer gedurende 10 min bij 13.000 x g bij 4 ° C.
  10. Verwijder de ethanol en herhaalt u de stappen van ethanol wassen.
  11. Verwijder de ethanol en droog dsRNA pellet door centrifugaal vacuüm concentrators voor 3 min. resuspendeer dsRNA met 10 µL RNase-gratis water.
  12. Controleer de integriteit van behandelde dsRNA via Elektroforese van het gel op een 1,5% agarose gel.

5. orale toediening van dsRNA

  1. Handhaven van kakkerlakken op een ad-libitum -dieet van droog voedsel (dog chow). Ontnemen watervoorziening vanuit de kakkerlakken één dag vóór dsRNA inslikken experimenten.
  2. Houd een kakkerlak door grijpen zijn vleugels met de flexibele Tang (Figuur 1, stap 5).
    Opmerking: Pak niet de lichaamsdelen van kakkerlakken.
  3. Voorbereiden op de dsRNA lipoplexes, evenals de naakte dsRNA, voeding, zoals beschreven in sectie 2.
    Opmerking: De lipoplexes dsRNA moet vers worden bereid vóór de voedering.
  4. 4 µL van dsRNA lipoplexes of naakte dsRNA feed (250 ng) met een micropipet.
  5. Langzaam Pipetteer de druppel van de dsRNA oplossing dicht bij de monddelen van kakkerlakken, en laat de kakkerlakken inslikken de druppel volledig.
  6. De inname experimenten twee keer per dag (1 h na lichten op en 1 uur voordat de lichten uit) voor 8 dagen of 16 dagen continu uitvoeren.
    Opmerking: Alle kakkerlakken verworven water alleen via handmatige invoer met dsRNA oplossing of besturingselement reagentia (bijvoorbeeld, nuclease gratis water, glucose oplossing en liposoom reagens) tijdens de inname experimenten.
  7. Flessen water geven met de kakkerlakken na 16 dagen van inname van dsRNA experimenten.

6. Knockdown beoordelen

  1. Gekozen tijde punten (2, 9 en 17 dagen na dsRNA inslikken assay), het verzamelen van de dsEGFP - en dsTub-testgroep insecten en ontleden de gekozen weefsels (bijvoorbeeld, middendarm).
  2. Het uitvoeren van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR). De qRT-PCR versterking voorwaarden en primer informatie zoals gerapporteerd door Lin et al.. (2017) 12.
  3. Beoordelen van de controle en de insecten dsRNA-behandelde dagelijks controleren van sterfte en verwijderen van de kakkerlakken die niet meer bewegen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een vereenvoudigde regeling van het protocol voor de mondelinge levering van dsRNA wordt gepresenteerd in Figuur 1, waar de belangrijkste stappen voor de voorbereiding van dsRNA lipoplexes worden getoond.

Om te onderzoeken van de bescherming van liposoom vervoerders op dsRNA afbraak in de middendarm sap van B. germanica, een ex vivo bepaling, waar dsTub lipoplexes werden geïncubeer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol biedt een methode voor doeltreffend RNAi via mondelinge levering van dsRNA lipoplexes, waarbij bescherming tegen ribonuclease vertering in de middendarm sap van de Duitse kakkerlak. Zoals blijkt uit andere onderzoeken bij verschillende insecten diersoorten, is het slechte RNAi effect via mondelinge levering van dsRNA meestal verantwoord door de afbraak van dsRNA8,9,10. Dit protocol produceert liposomen die als besch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door subsidies uit Taiwan (Ministerie van wetenschap en technologie, de meest 100-2923-B-002-002-MY3 en 106-2313-B-002-011-MY3 naar H.J.L.), Tsjechië (verlenen Agentschap van Zuid-Bohemen Universiteit, GAJU verlenen 065/2017/P Y.H.L), en Spanje ( Spaanse ministerie van economische zaken en concurrentievermogen, verleent CGL2012-36251 en CGL2015-64727-P X.B., en de Catalaanse regering, toekennen 2014 SGR 619 X.B.); het kreeg ook financiële steun uit het Europees Fonds voor de economische en regionaleontwikkeling (EFRO fondsen te X.B.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagentSignaGenSL100499voor lipoplexes voorbereiding
Blend Taq plusTOYOBO BTQ-201voor PCR
Fast SYBR Green Master MixABI 4385612voor qPCR
FirstChoice RLM-RACE KitInvitrogenAM1700voor 3' UTR identificatie 
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAMB13345voor dsRNA synthese
TURBO DNaseInvitrogenAM2239verwijder DNA template van dsRNA
TRIzolInvitrogen15596018voor dsRNA of totale RNA extractie
RQ1 RNase-Free DnasePromegaM6101verwijder DNA template van totale RNA 
chloorvorm Sigma-AldrichC2432voor dsRNA of totale RNA extractie
2-PropanolSigma-AldrichI9516voor dsRNA of totale RNA extractie
ethanolSigma-Aldrich24102voor dsRNA of totale RNA extractie
Diethyl pyrocarbonaat, DEPCSigma-AldrichD5758voor RNase vrije water voorbereiding
glucose oplossingSigma-AldrichG3285voor lipoplexes voorbereiding
Natriumchloride, NaClSigma-AldrichS7653insect saline buffer formule
Kaliumchloride, KClSigma-AldrichP9333insect saline buffer formule
Calciumchloride, CaCl2Sigma-AldrichC1016insect saline buffer formule
Magnesiumchloride hexahydraat, MgCl2.6H2OSigma-AldrichM2670insect saline buffer formule
EGTA Sigma-AldrichE3889enzymremmer 
dissectie schaarF.S.T.kakkerlak dissectie
fijne pincetF.S.T.kakkerlak dissectie
flexibele pincetF.S.T.kakkerlak vasthouden 
pipetmanRAININP10monstervoorbereiding
microcentrifuge buisjeAxygenMCT175C, PCR02Cmonstervoorbereiding
pipettip Axygenmonstervoorbereiding
vortexterDigisystemvm1000monstervoorbereiding
Minispin centrifugeThe Gruffin GroupGMC 206voor vloeibare spin down 
CentrifugeALCPK121Rmonstervoorbereiding
pH meter JENCO6071voor pH aanpassing
micro-volume spectrofotometerQuawellQ3000nucleïnezuur kwantitatief
PCR Thermische cyclerABI 2720voor sjabloon PCR of  dsRNA synthese incubatie 
kwantitatieve real-time PCRABI StepOne plusgenexpressie kwantitatief
Centrifugale vacuüm concentratorseppendorf5301voor dsRNA of totale RNA extractie
Multipette eppendorfxstreamvoor real-time PCR monster laden 
Agarose Iamresco0710voor nucleïnezuur elektroforese
tub gen specifiek voorwaartse preimertri-I biotechGGG ACA AGC CGG AGT GCA GA
tub gen specifiek omgekeerde preimertri-I biotechTCC TGC TCC TGT CTC GCT GA
dsTub template voorwaartse primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG 
dsTub template omgekeerde primertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG 
dsEGFP template voorwaartse preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG
dsEGFP template omgekeerde preimertri-I biotechTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC
tub qPCR voorwaartse primertri-I biotechGGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC
tub qPCR omgekeerde preimertri-I biotechCCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC
ef1 qPCR voorwaartse primertri-I biotechCGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A
ef1 qPCR omgekeerde preimertri-I biotechCCT GCA GAG GAA GAC GAA G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
  2. Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
  3. Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J. Chapter Five - Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. Jeon, K. W. 312, Academic Press. 139-167 (2014).
  4. San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
  5. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
  6. Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
  8. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
  9. Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
  10. Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
  11. Huang, J. -H., Belles, X., Lee, H. -J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114(2012).
  12. Lin, Y. -H., Lee, C. -M., Huang, J. -H., Lee, H. -J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
  13. Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769(2014).
  14. Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
  15. Lin, Y. -H., Huang, J. -H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
  16. Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
  17. Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
  18. Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
  19. Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
  20. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4(2017).
  21. Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
  22. Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
  23. Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
  24. Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Duitse kakkerlakmidendarmvochttubuline expressiehemolymfe verzamelingenzymremmingcontinue voeding

Gerelateerde artikelen