Dit protocol beschrijft een gemakkelijke en handige methode om te etiketteren en visualiseren van levende chromosomen in mitotische cellen met behulp van Histone2B-GFP BacMam 2.0 label en een draaiende schijf confocale microscopie systeem.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Levende cel beeldvorming van chromosoom segregatie tijdens de mitose
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Chromosomen moeten worden betrouwbaar en uniform gescheiden in dochtercellen tijdens de mitotische celdeling. Trouw van chromosomale segregatie wordt beheerd door meerdere mechanismen waarin de spindel vergadering Checkpoint (SAC). De SAC is onderdeel van een complexe feedback-systeem dat verantwoordelijk is voor preventie van een cel vooruitgang door middel van mitose tenzij alle chromosomale kinetochoren hebben gehecht aan de spindel microtubuli. Chromosomale achterblijvende en abnormaal chromosoom segregatie is een indicator van disfunctionele celcyclus controle checkpoints en kan worden gebruikt voor het meten van de genomic stabiliteit van cellen te verdelen. Deregulering van de SAC kan resulteren in de omvorming van een normale cel tot een kwaadaardige cel door de accumulatie van fouten tijdens chromosomale segregatie. Uitvoering van de SAC en de vorming van de complexe kinetochoor zijn strak gereguleerd door interacties tussen kinases en fosfatase zoals eiwit fosfatase 2A (PP2A). Dit protocol beschrijft levende cel beeldvorming van achterblijvende chromosomen in muis embryonale fibroblasten geïsoleerd van muizen die had een knock-out van de regelgevende subeenheid van PP2A-B56γ. Deze methode overwint de tekortkomingen van andere celcyclus controle beeldvormingstechnieken zoals stroom cytometry of immunocytochemie waarmee slechts een momentopname van een cel cytokinese status, in plaats van een dynamische Spatio visualisatie van chromosomen tijdens de mitose.
Inleiding
In het volgende protocol beschrijven we een handige methode om te visualiseren de chromosomale segregatie en de mitotische vooruitgang tijdens de celcyclus in muis embryonale fibroblasten met behulp van Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 labeling en levende cel beeldvorming.
Celcyclus controle controlepunten controleren chromosoom segregatie en spelen een belangrijke rol bij de instandhouding van de genetische integriteit van de cel 1,2,3. Accumulatie van mis gescheiden chromosomen kan leiden tot aneuploïdie, dat is een kenmerk van de meest solide tumoren 4. Vandaar, detectie van achterblijvende chromosomen kan worden gebruikt als een methode om te studeren chromosomale instabiliteit.
Fluorescently label eiwitten kunnen worden gebruikt om te visualiseren live chromosoom segregatie en chromosomale achtergebleven maar de generatie van mCherry-gelabeld of H2B-GFP gelabeld eiwit vereist aanzienlijke kennis van gene levering en moleculaire biologie 5. Hier beschrijven we het gebruik van CellLight Histone2B-GFP BacMam 2.0 reagens, hierna genoemd CL-HB regent, omwille van de eenvoud. Dit reagens kan onmiddellijk worden gebruikt en dus elimineert bezorgdheid over vector kwaliteit en integriteit. Dit reagens hoeft bovendien niet het gebruik van potentieel schadelijke behandelingen of lipiden en kleurstof-laden chemicaliën. In tegenstelling tot conventionele fluorescerende labels, de CL-HB-regent vlekken onafhankelijk van de functie (dwz., membraanpotentiaal). De CL-HB-regent kan eenvoudig worden toegevoegd aan de cellen en eiwit expressie 's nachts ge¨ uncubeerd. De CL-HB-regent niet gerepliceerd in zoogdiercellen en kan worden gebruikt in de bioveiligheid niveau (BSL) 1 laboratorium-instellingen. Ook kan deze voorbijgaande transfectie worden gedetecteerd na overnachting incubatie gedurende maximaal 5 dagen, genoeg tijd om de meest dynamische cellulaire analyses uitvoeren.
Anderzijds kon chromosomale afwijkingen worden bestudeerd door verschillende technieken zoals stroom cytometry, immunohistochemistry of fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) 6. Stroom cytometry kan worden gebruikt om te studeren aneuploïdie, die kan worden gemeten op basis van DNA-inhoud en de fase van cellen in de celcyclus. Hoewel stroom cytometry kan worden gebruikt voor het meten van aneuploïdie, biedt geen informatie op chromosomale verkeerde segregatie. VIS en immunohistochemistry technieken gebruik fluorescente sondes te binden aan DNA of chromosomen. Hoewel deze technieken een momentopname van de status van een bevolking van cellen bieden, laat ze niet levende cel imaging waardoor ontbreekt elke informatie verkregen via Spatio visualisatie van cytokinese in specifieke cellen gevolgd over een periode van tijd.
Dit protocol werd gebruikt voor het bestuderen van de achterblijvende chromosomen of chromosomale verkeerde segregatie in nocodazole behandeld muis embryonale fibroblasten (MEFs) van PP2A-B56γ-muizen geïsoleerd. In aanvulling op bovenstaande toepassing biedt dit protocol een eenvoudige tool om te etiketteren en visualiseren van chromosomale segregatie in verschillende celtypen, die kan worden gebruikt voor het bestuderen van de celcyclus verordening of chromosomale instabiliteit in tumorcellen. Bovendien, kan het ook worden gebruikt om te studeren chromosomale instabiliteit veroorzaakt door diverse drug behandelingen of de effecten van gene knock out resulterend in chromosomale verkeerde segregatie te bestuderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten uitgevoerd in deze studies werden verricht overeenkomstig de protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij de Food and Drug Administration (FDA) onderzoeksfaciliteit.
1. isolatie en de cultuur van muis embryonale fibroblasten (MEFs)
- Isoleren van muis embryonale fibroblasten (MEFs) van een PP2A-B56γ-mouse stam en wild type nestgenoten standaardprotocol 7,met8,9.
- ExpandMEFs voor 3 gangen, bevriezen en op te slaan totdat die nodig zijn voor experimenten 8.
2. kweken Mefs in 2-Well Chambered Cover glas voor Live Imaging
- Bereiden van 500 mL MEF groei media Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM/F12) met 10% met foetale boviene Serum (FBS), 1 X penicilline/streptomycine antibiotica, L-Glutamine (200 mM) en 1 X van niet-essentiële aminozuren (NEAA) in een fles van 500 mL media.
- Ontdooien flesjes van bevroren MEFs van wild type en PP2A-B56γ-muizen bij passage 3 in voorverwarmde waterbad bij 37 ° C.
- Overdracht MEFs 15 mL buizen ontdooid en voeg langzaam dropwise 20 mL DMEM/F12 media aan de 15 mL buisjes met behulp van een precisiepipet 10 mL.
- Overdracht van MEFs samen met DMEM/F12 groei media T75 maatkolven van 20 mL en vouw ze totdat de cellen 70% heuvels zijn. Confluentie is geschat aan de hand van een omgekeerde Microscoop op 4 x of 10 x vergroting.
- Aspirate het groeimedium met behulp van een glas weiland Pipetteer gekoppeld aan een vacuümsysteem in de kap, voeg 3 mL van 0,25% trypsine/EDTA en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 min. Voeg 3 mL DMEM/F12 groeimedium om te stoppen met de reactie.
- Centrifugeer de cellen bij lage snelheid (300 x g) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL DMEM/F12 groeimedium vooraf bij 37 ° C in een waterbad verwarmd.
- Cellen met behulp van de methode trypan blauwe uitsluiting of andere gewenste cel tellen methode 8opsommen
- Zaad ongeveer 20.000 MEFs per putje in een 2-well chambered cover glas. Voeg 200 µL per putje DMEM/F12 groeimedium, en de cellen koppelen door ze 's nachts incuberen bij 37 ° C en 5% CO2toestaan.
3. synchronisatie
- MEFs synchroniseren in G0/G1-fase door cellen in DMEM/F12 groei media met 0,1% aan het broeden FBS voor 24u, een maximum aantal cellen ophalen in G0/G1-fase.
Opmerking: Hoewel serum honger werd gebruikt als een methode van voorkeur, verschillende andere methoden kunnen worden gebruikt afhankelijk van de mitotische fase waartegen cellen nodig zijn om te worden gearresteerd 10.
4. labeling
- Bereiden van 1,5 mg/mL stockoplossing van nocodazole in DMSO. Nocodazole arresteert cellen op G2/M fase door remming van de microtubuli vorming 10.
- Drie dagen na de synchronisatie, 200 µL van groeimedium (met 10% FCS), 200 ng/mL nocodazole en CL-HB regent (Histone 2B-GFP BacMam 2.0) toevoegen.
- Bereken de CL-HB regent deeltjes Per cel (PPC) worden toegevoegd aan de cellen als volgt:
Indien het aantal cellen het geschatte totale aantal cellen op het moment van labeling is, PPC is het aantal deeltjes Per cel, en 1 × 10-8 is het aantal deeltjes per mL reagens. Bijvoorbeeld, op etiket 20.000 cellen met een PPC van 30
Opmerking: CL-HB regent werkt goed met de meeste celtypes tussen 10 en 50 PPC. Echter werkte 30 PPC het beste voor deze studie. - MEFs Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
Opmerking: Voor de huidige experiment, visualisatie van chromosomen in mitotische cellen ontsnappen van de spindel vergadering controlepost 18u opgetreden na arrestatie van de celcyclus met nocodazole.
5. visualisatie van achterblijvende chromosomen
- Visualiseren van muis embryonale fibroblasten (MEFs) met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop systeem voorzien van een milieu-kamer en een olie-immersie, 63 x objectief.
- Excitatie golflengte van 488 nm en emissie golflengte van 450 nm voor GFP kanaal Beeldacquisitie gebruiken.
- Gebruik van een draaiende schijf confocal microscoop systeem met de mogelijkheid van gemotoriseerde scannen stadia, Z-Piezo inserts, fase-top incubatie en directe fluorescentie herstel na foto bleken voor deze techniek.
- Één dag voor imaging, draai het milieu kamer power ON en de hele kamer bij 37 ° C's nachts opwarmen.
- Schakel inschakelen voor de Microscoop stand, camera, draaiende schijfeenheid, illuminator, argon laser, computer en gemotoriseerde fase.
- Laat het systeem warm voor 3 min; Allereerst dat de laser argon contactsleutel inschakelen. Schakel de tuimelschakelaar voor argon laser vanuit "stand-by" op "laser run".
- Start de data acquisitie en verwerking software.
- De CO2 -controller voor de bovenste fase-incubator initiëren en de concentratie van CO2 vastgesteld op 5%. Dit moet gebeuren vóór aanvang van de beeldvorming.
- Verwijder het chambered cover glas uit de incubator en plaats in het werkgebied voor visualisatie. Visualiseer cellen via een olie onderdompeling 63 x objectief (NA1.4).
- Bekijken door de oculaire lenzen, richten de afbeelding en identificeren van een cel in de nucleaire envelop verdeling (NEBD) stadium.
- Initiëren passende laser (488 nm argon laser te visualiseren Histone2B-GFP).
- Overname zeggenschap venster open en blootstellingstijd voor het GFP-kanaal instellen. Een cel die deel uitmaakt NEBD identificeren.
- Handmatig bepalen de doelcel boven- en onderkant brandvlak en voer de xyz optische afdelen instellingen.
- Observeren gedurende 20 minuten; Als de cel gaat niet verder door celdeling, stop Beeldacquisitie na 20 min en gaan naar de volgende cel die zich in NEBD.
- Ongeveer 1 uur per cel is nodig om beeld achterblijvende chromosomen tijdens de mitose in PP2A-B56γ-cellen, die uit de WRA ontsnapt. Om gegevens te verkrijgen voor een film, foto's nemen elke 3 min.
Opmerking: Wild type cellen arresteren en niet verder verleden NEBD wanneer behandeld met nocodazole. - Afbeeldingen opslaan in de bestandsindeling van zvi voor verdere analyse.
6. verwerking en analyse van het beeld
Opmerking: Het uitvoeren van driedimensionale beeldverwerking en analyse met behulp van alle beschikbare software zoals Axiovision versie 4.8.2 of Imaris versie 8.2. Voor deze studie de ImageJ werd software gebruikt.
- Open de reeks afbeeldingen. Als de beelden al in een stapel-indeling zijn, gaat u verder met de volgende stap. Als niet alle relevante afbeeldingen combineren in een stapel met behulp van ' afbeelding > stapels > beelden te stapelen ' in de menubalk.
- Voer eventuele aanpassingen als vereiste helderheid/contrast en niveaus.
- Een tijdstempel aan de film toevoegen
- Ga naar "Image > stapels > Label...' in de menubalk.
- Selecteer de juiste indeling, de beginwaarde van de tijd, en tijdsinterval tussen elke afbeelding.
- Schakel het selectievakje 'Preview' en locatie en formaat instellingen aanpassen. Druk op 'OK' toe te passen van het tijdstempel.
- Een schaal-bar aan de film toevoegen
- Instellen van het beeld schalen onder ' analyseren > schaal instellen ' in de menubalk.
- In het veld 'Afstand in pixels', een aantal pixels opgeven waar de afstand is bekend, en geef de afstand op in het veld 'Bekende afstand'. Stel de juiste eenheid van lengte voor de afstand, bijvoorbeeldin µm. Druk op 'OK' om de omvang van toepassing op de stack.
- Ga naar ' analyseren > Tools > schaal Bar...' toe te voegen van de schaal-bar. Instellen van de grootte van de balk als 'Breedte in µm' en pas de resterende opmaakopties zo nodig. Vink het selectievakje 'Alle segmenten Label' toe te voegen van de schaal-bar aan de hele stapel.
- Voorbeeld van de film door te klikken op de knop van de driehoekige afspelen op de bodem verlaten van de rand van het afbeeldingsvenster. Aanpassen de frame rate met behulp van ' afbeelding > stapels > Animatie > animatieopties in de menubalk.
- Exporteren van het filmbestand door te schakelen ' bestand > opslaan als > AVI...' en selecteer de framesnelheid en compressie.
- Druk op 'OK' om te kiezen voor het opslaan locatie en bestandsnaam. Druk op 'Opslaan' om het filmbestand.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
MEFs van wild type en PP2A-B56γ-muizen waren zaadjes in een 2-well kamer cover glas en toegestaan om te koppelen. Op dag 2, MEFs zijn gesynchroniseerd met behulp van 0,1% FBS gedurende 24 uur. Op dag 3, MEFs in de media met 200 ng/mL nocodazole en 30 PPC CL-HB regentwere uncubeerd 18u op 37° C en 5% CO2. Op dag 4, werden de cellen beeld met behulp van een draaiende schijf confocal microscoop systeem (Figuur 1). Live cel imaging werd gebr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Celcyclus controle controlepunten die zorgen voor nauwkeurige chromosoom segregatie voorkomen aneuploïdie en cel transformatie 1,2,3. In de huidige studie, vonden we dat inactivatie van PP2A-B56γ resulteerde in een verzwakte spindel vergadering checkpoint. Beeldvorming van de levende cel konden we observeren chromosomale verkeerde segregatie tijdens de mitose in PP2A-B56γ MEFs met nocodazole 9behandeld.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij wil Dr. Guo-Chiuan Hung en Dr. Bharatkumar Joshi bedanken voor de waardevolle opmerkingen dat het manuscript is verbeterd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Gibco | 11320082 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| MEM Non-Essential amino acids solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | |
| Fetal bovien serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMSO | EMD Millipore | MX 1458-6 | |
| Cryogenic vial storage boxes | Fisherbrand | 10-500-28 | |
| Cryogenic vials | Corning/costar | 431416 | |
| T75 flasks | Cellstar | 658175 | |
| 2 well chambered cover glass | Nunc | 155380PK | |
| Cellometer Vision Cell Profiler | Nexcelom Bioscience LLC | Cellometer Vision Trio | |
| Nocodazole | Sigma | M1404 | |
| CellLight Histone 2B-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific Inc. | C10594 | |
| Zeiss Cell Observer Spinning Disk Confocal Microscope system | Carl Zeiss Microscopy | Zeiss Cell Observer SD | |
| Water Bath | Thermoscientific | 280 series | |
| Incubator | Sanyo commercial solutions | MCO-18AIC (UV) | |
| Class II Biological safety cabinet | The Baker Company | SterilGard | |
| Axiovision software | Zeiss | Ver.4.8.2 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | Ver. 1.51r |
Referenties
- Funk, L. C., Zasadil, L. M., Weaver, B. A. Living in CIN: Mitotic Infidelity and Its Consequences for Tumor Promotion and Suppression. Dev Cell. 39, 638-652 (2016).
- Etemad, B., Kops, G. J. Attachment issues: kinetochore transformations and spindle checkpoint silencing. Curr Opin Cell Biol. 39, 101-108 (2016).
- Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. The spindle assembly checkpoint. Curr Biol. 22, 966-980 (2012).
- Jallepalli, P. V., Lengauer, C. Chromosome segregation and cancer: cutting through the mystery. Nat Rev Cancer. (2), 109-117 (2001).
- Zhu, L., et al. Mitotic protein CSPP1 interacts with CENP-H protein to coordinate accurate chromosome oscillation in mitosis. J Biol Chem. 290 (45), 27053-27066 (2015).
- Pikor, L., Thu, K., Vucic, E., Lam, W. The detection and implication of genome instability in cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (3-4), 341-352 (2013).
- Varadkar, P., Despres, D., Kraman, M., Lozier, J., Phadke, A., Nagaraju, K., McCright, B. The protein phosphatase 2A B56γ regulatory subunit is required for heart development. Dev Dyn. 243 (6), 778-790 (2014).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (64), e3854(2012).
- Varadkar, P., Abbasi, F., Takeda, K., Dyson, J. J., McCright, B. PP2A-B56γ is required for an efficient spindle assembly checkpoint. Cell Cycle. 18 (12), 1210-1219 (2017).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nat Protoc. 8 (3), 602-626 (2013).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26 (2), 54-65 (2015).
- Versaevel, M., Braquenier, J. B., Riaz, M., Grevesse, T., Lantoine, J., Gabriele, S. Super-resolution microscopy reveals LINC complex recruitment at nuclear indentation sites. Sci Rep. 8 (4), 7362(2014).
- Wild, T., Larsen, M. S., Narita, T., Schou, J., Nilsson, J., Choudhary, C. The Spindle Assembly Checkpoint Is Not Essential for Viability of Human Cells with Genetically Lowered APC/C Activity. Cell Rep. 1 (8), 1829-1840 (2016).
- Iuso, D., et al. Exogenous Expression of Human Protamine 1 (hPrm1) Remodels Fibroblast Nuclei into Spermatid-like Structures. Cell Rep. 1 (9), 1765-1771 (2015).
- Ratcliffe, E., Glen, K. E., Naing, M. W., Williams, D. J. Current status and perspectives on stem cell-based therapies undergoing clinical trials for regenerative medicine: case studies. Br Med Bull. 108, 73-94 (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
