Een gesloten-borst-Model voor het opwekken van transversale aorta vernauwing in muizen

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol van Transverse aorta vernauwing (TAC) via een laterale Thoracotomie. Deze techniek is een minimaal invasieve, gesloten borst chirurgische ingreep gericht om overbelasting van de druk en hartfalen in muizen met behulp van TAC laboratorium standaardinstellingen te simuleren.

Samenvatting

Onderzoek op hypertrofie van het hart en hartfalen is vaak gebaseerd op druk overbelasting Muismodellen geïnduceerd door TAC. De standaardprocedure is het uitvoeren van een gedeeltelijke Thoracotomie om te visualiseren de dwarse aortaboog. Het chirurgische trauma veroorzaakt door de Thoracotomie in open-borst modellen verandert echter de respiratoire fysiologie als de ribben zijn ontleed en niet-vastgemaakte na sluiting van de borst verliet. Om dit te voorkomen, vastgesteld wij een minimaal invasieve, gesloten borst aanpak via laterale Thoracotomie. Hierin benaderen we de aortaboog via de 2^nd intercostale ruimte zonder het invoeren van de borst bevinden, waardoor de muis met een minder traumatisch letsel herstellen. Wij voeren deze operatie met behulp van standaard laboratorium instellingen voor open borst TAC procedures met gelijke overlevingskans van de patiënt. Naast het onderhouden van fysiologische ademhaling patronen vanwege de gesloten borst aanpak, lijken de muizen te profiteren door aan te tonen van snelle herstel, zoals de minder invasieve techniek wordt weergegeven voor een snelle genezing proces te faciliteren en te verminderen de immune reactie na trauma.

Inleiding

Muismodellen worden vaak gebruikt om na te bootsen van ziekten bij de mens¹. Transversale aorta vernauwing (TAC) wordt gebruikt voor het opwekken van druk overbelasting en links ventriculaire hypertrofie². Het open-borst TAC model in muizen werd gevalideerd door Rockman et al. ³ en de chirurgische ingreep is in detail beschreven door DeAlmeida et al. ⁴. Banding van de dwarse aorta is gunstiger in vergelijking met abdominale aorta vernauwing omdat een groter deel van het verkeer kan negatieve effecten van deze laatste procedure²compenseren.

De strepen van de dwarse aorta leidt tot een verhoogde arteriële druk in de aorta en de oplopende brachiocephalic slagader maar voldoende perfusie van de organen verlaat via de distale schepen (dat wil zeggen de linker gemeenschappelijke halsslagader, de linker subclavian slagader en aflopende aorta). Dit leidt tot een verhoogde cardiale afterload en een verhoogde cardiale muur stress. De muur stress vermindert vervolgens als gevolg van de vezel verdikking⁵. De chronische verandering in de cardiale hemodynamiek resulteert in maladaptation en maagdilatatie van het linkerventrikel. Op deze manier de TAC creëert een reproduceerbare model voor hypertrofie van het hart uiteindelijk zal leiden tot hartfalen.

De standaardprocedure voor TAC zoals beschreven door DeAlmeide et al. ⁴ benadert de aortaboog via een gedeeltelijke bovenste Thoracotomie via dissectie van de ribben of het borstbeen en het invoeren van het mediastinum evenals de pleurale holte. Dit zorgt voor een goede weergave van de aortaboog en de zij-takken. Helaas kunnen niet de ontleed ribben worden reattached, die laat ze vrij zwevende en waardoor het wijzigen van de dynamiek van de ademhaling.

Wij derhalve vastgesteld een minimaal invasieve benadering gesloten-borst van de aortaboog met behulp van een laterale chirurgische aanpak via de 2^nd intercostale ruimte. Het grootste voordeel van dit model is de mogelijkheid voor het uitvoeren van TAC zonder zelfs doorsnijden de ribben. Het chirurgisch trauma is beperkt tot de insnijding van de huid en de dissectie van de intercostale spieren. Deze procedure minimaliseert het trauma zelf en helpt om voldoende borst stabiliteit te handhaven.

Hier beschrijven we een stapsgewijze procedure voor het uitvoeren van TAC chirurgie in muizen zonder het uitvoeren van het totaal of de bovenste Thoracotomie. Hoge frequentie Doppler werd gebruikt om dat het succes van TAC ^6,7zoals hiervoor is beschreven.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door de ethische commissie voor dier experimenten LANUV Recklinghausen (#84-02.04.2016.A374). Deze procedure is in het algemeen uitgevoerd op volwassen muizen > 10 weken oud. Het is echter mogelijk voor het uitvoeren van deze ingreep op jongere dieren ook. Chirurgische hulpmiddelen vóór gebruik gesteriliseerd moeten worden, en alle stappen moeten worden uitgevoerd onder aseptische condities.

1. de inductie van de anesthesie en intubatie

1. Injecteren van buprenorfine 0,1 µg/g lichaamsgewicht intraperitoneally voor verlichting van pijn. Herhaal de intraperitoneaal injecties van 0,1 mg/kg buprenorfine elke 8 h voor de komende drie dagen na de operatie.
2. Voor inductie, plaatst u de muisaanwijzer in een verdoving inductie vak die is aangesloten op de vaporizer ingesteld op 3.0 Vol % van Isofluraan met een zuurstof-stroom van 1 L/min.
3. Zorgen voor diepe versuffing door inducerende een tactiele prikkel.
   Opmerking: Verhoging Vol % van Isofluraan tot 5%, als inductie van de anesthesie mislukt of versuffing niet diep genoeg is.
4. Knijp de staart van de muis om reflex ontbreken. In geval van volledige afwezigheid van reflexen, wegen de muis voor optimale ventilator setup (zie 1.12).
5. Verplaats de muis naar een temperatuurgevoelig operatietafel te handhaven een lichaamstemperatuur van 37 ° C gedurende de hele procedure.
6. Plaats de neus van de muis in een kunststof kegel die is aangesloten op het vak inductie anesthesie te handhaven versuffing.
7. Fix de bovenste snijtanden van de muis met een nylon hechtdraad. De uiteinden met een plakband fixeren.
8. Oefen druk uit op de achterste poot met het topje van de verlostang om een voldoende versuffing opnieuw. Bij gebrek aan een terugtrekking reflex gaat u verder met de volgende stappen.
   Opmerking: Verhogen van volume % van Isofluraan als inductie van de anesthesie mislukt of versuffing niet diep genoeg is en wacht op het ontbreken van de terugtrekking reflex.
9. Plaats steriele ophthalmic glijmiddel op het hoornvlies ter voorkoming van uitdroging onder verdoving.
10. Smeer de rectale sonde Voorkom rectale trauma. Invoegen van een rectale temperatuursonde om ervoor te zorgen een inwendige temperatuur van 37 ° C.
11. Ontharen van de keel en de borst met ontharende room volgens de instructies van de fabrikant. Veeg de room na 1 min. Indien nodig, herhaal deze stap totdat succesvol.
    Opmerking: Gebruik katoen-tipped swabs in geval van bloeden.
12. Reinig de depilated gebied met 70% ethanol. Vervolgens toepassen Povidon-jodium voor lokale huid desinfecteren 3 keer en voor ten minste 3 min.
13. Ventilator instellingen fysiologische parameters aanpassen. Stelt het respiratoire tarief tot 150/min en tidal volumes tot 8-10 µL/g lichaamsgewicht (BW).
14. Zet op een nieuw paar steriele handschoenen. Plaatst u de muisaanwijzer onder een chirurgische Microscoop en plaats een steriele fenêtré draperen over de muis.
15. Incise van de huid op de middellijn van ongeveer 3 mm onder de mandibulaire tot de boordsteek 2^nd . Middellijn en bindweefsel van de submandibulaire klier te identificeren. Vervolgens kunt schuine intracapsular pincet voorzichtig de klier op de middellijn ronduit verdelen met twee pincet en verkennen de tracheale spier.
16. Bereid de luchtpijp zachtjes door de para-tracheale spieren botweg uit elkaar trekken met een intracapsular Tang.
17. Trek op de tong met een tang strek de keel gemakkelijker intubatie voorwaarden en zachtjes invoegen een intubatiecanule (OD 1.2 mm) binnen de luchtpijp. Bevestig de intubatie door rechtstreekse visualisatie van de buis in de luchtpijp en door het zoeken van de juiste borst beweging.
18. Pas de Isofluraan na intubatie aan 2% Isofluraan met een stroom van 1,0 L/min en 100% O₂.
    Opmerking: Als ademhaling bewegingen niet stoppen of muizen gaan bewegen, eerst de hogere luchtwegen waarde tot 180/min. Indien nodig, verhogen de concentratie Isofluraan maximaal 3,5% subsidiair totdat de muis stopt met ademhalen op zijn eigen. Lekkages of onvoldoende vulling van de vaporizer hebben worden geëvalueerd als de meest voorkomende problemen.
19. Als alternatief, intubatie zoals voorgesteld in de volgende sub-procedure uitvoeren
    1. Plaats de muis op een tafel in een hoek van 60°.
    2. De uiteinden van de muis met plakband fixeren en rusten van het hoofd.
    3. Plaats een koude-lichtbron rechtstreeks op de huid boven het strottenhoofd.
    4. Trek voorzichtig de tong met een tang om te visualiseren van de stembanden.
    5. Invoegen van een plastic buis van een IV-canule (24 G) door middel van de stembanden en sluit de plastic buis aan de ventilator-instellingen.
    6. De ventilator sluit aan op de canule intubatie bevestigen door synchrone borst bewegingen.
       Opmerking: Als ademhaling bewegingen niet stoppen of muizen gaan bewegen, eerst de hogere luchtwegen waarde tot 180 per min. Indien nodig vergroten subsidiair de Isofluraan concentratie maximaal 3,5% totdat de muis stopt met ademhalen op eigen Lekkages of onvoldoende vulling van de vaporizer hebben worden geëvalueerd als de meest waarschijnlijke problemen.

2. preoperatieve Doppler meting

1. Bereiden van beide halsslagaderen welke lag aanvulling op de luchtpijp door zachtjes trekken het bindweefsel uit elkaar met een tang.
2. Plaats het uiteinde van de 20 MHz Doppler sonde met sommige steriele ultrageluid-gel op het recht en de linker halsslagader op een hoek van minder dan 45°.
3. Langzaam draaien de sonde om het laterale en mediale te vinden een Doppler signaal en kantelen van de sonde voor het optimaliseren van het signaal te verplaatsen.
4. Een Doppler software gebruiken voor het weergeven en opslaan van stroomsnelheden in de linker- en gemeenschappelijk halsslagaderen op een computer.

3. Thoracotomie

1. Een set van steriele handschoenen voor elke individuele muis gebruiken om chirurgische site infecties te voorkomen.
2. Vouw de huid incisie tot de 2^nd intercostale ruimte met een schaar.
3. De 2^nd intercostale ruimte visueel identificeren door het tellen van de ribben en dan ronduit het doordringen van deze ruimte met een intracapsular Tang.
   Opmerking: De 1^st rib bevindt zich onder het sleutelbeen en is daarom niet zichtbaar omdat de 2^nd intercostale ruimte is gevonden tussen eerste zichtbaar rib (dat wil zeggen 2^nd rib) en de 3^rd rib.
4. Open de 2^nd intercostale ruimte met behulp van een verlostang tips en plaats van de oprolmechanismen.
5. Pas de oprolmechanismen met een elastiekje dat is aangesloten op de operatietafel te hebben een duidelijk beeld van de thymus.
6. In het geval van het bloeden een katoen-tip gebruikt en druk op de oppervlakkige vaten gedurende 2 minuten.

4. "banding" van de dwarse Aorta

1. Pas de vergroting tot 200% om middellijn en bindweefsel te identificeren. Vervolgens kunt schuine pincet voorzichtig verdelen de thymus. Verwijderen vetweefsel totdat de aortaboog duidelijk kan worden gezien.
2. Bereiden een tunnel met schuin koppelverkoop pincet onder de dwarse aorta tussen de slagader van de brachiocephalic en de linker gemeenschappelijke halsslagader (Zie Figuur 1). Houd het uiteinde van een 6.0 hechtdraad met behulp van fijne pincet en passeren van de draad onder de aortaboog.
3. Neem de draad met de tweede verlostang vanaf de andere kant van de boog.
4. Afgesneden van de lengte van een 3 mm lang stuk van een 27 G te gebruiken de naald als een de spacer voor TAC-afbinding voor muizen met een gewicht tussen 19-25 g lichaamsgewicht en een 26 G naald als een spacer voor muizen > 25 g BW.
5. Zorgvuldig plaatst het tussenstuk parallel aan de dwarse aorta.
6. Bereiden van een losse dubbele knoop op de spacer en zorgen voor optimale plaatsing van de spacer parallel aan de aorta. Vervolgens binden de eerste worp en snel uit te voeren een tweede strijd gooien. Verwijder het tussenstuk onmiddellijk.
7. Voer uit sham muizen voor controle, om hetzelfde protocol weglaten van de afbinding van de aorta.
8. Sluit de 2^nd intercostale ruimte met een 6.0 polypropyleen hechtdraad. Speciale aandacht besteden aan de subclavian schepen als ligating.
9. Sutuur (geologie) de huid met behulp van een 6.0 polypropyleen hechtdraad in een patroon van voortdurende hechtdraad.

5. bevestiging van de succesvolle Afbinding van de dwarse Aorta

1. Plaats een 20 MHz Doppler sonde aan beide zijden van de nek op een hoek van 45° zoals in deel 2.
2. Het document van de stroomsnelheden aan elke kant.
   Opmerking: Een succesvolle TAC kan worden gevalideerd door Doppler stroomsnelheid zoals afgebeeld in Figuur 2. Een stroom snelheid verhouding van 4-10 tussen de rechter en linker halsslagader meestal garandeert voldoende TAC (Zie Figuur 2).

6. hart oogst

1. Induceren versuffing volgens stappen 1.2. en 1.3.
2. Plaatst u de muisaanwijzer in een zaal van euthanasie en aanpassen van het debiet van de kooldioxide te verdrijven van 10-30% van de volume/minuut.
3. Het fixeren van de muis op een operatie tafel. Open de buik met schaar en oogst bloed van de vena cava inferior met een canule voor verdere analyse.
4. Snijd het middenrif en de sternale bot met een sterke schaar en verwijder het hart.
5. Verwijder alle arterial en bindweefsel voordat het wegen van het hart.
6. Scheiden het rechterventrikel en het tussenschot van het linkerventrikel en wegen van beide monsters.
7. Het bevriezen van beide weefselmonsters in vloeibare stikstof.

Resultaten

Een succesvolle TAC garandeert de inductie van druk overbelasting en linker ventriculaire hypertrofie. Een ad hoc-validatie van druk overbelasting kan worden bereikt met behulp van Doppler Stroommeting snelheid, zoals weergegeven in Figuur 2. Terwijl preoperatieve bloed stroomsnelheid in beide halsslagaderen bedraagt, TAC veroorzaakt een vergrote bloed snelheid in de rechts halsslagader als gevolg van verhoogde druk in de linker hartkamer en aorta terwijl ver...

Discussie

Het snelle begin van hypertensie als gevolg van de TAC verschilt van klinisch relevante hypertrofie veroorzaakt door aorta stenose of hypertensie. Echter het gebruik van kleine dierlijke modellen voor het opwekken van hartfalen heeft vele voordelen en is, daarom, gekozen door veel onderzoekers¹¹. Deze gesloten borst-model verbetert de reeds bestaande modellen van de chirurgische techniek voor het opwekken van transversale aorta vernauwing in muizen⁴.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Druk-volumekatheter	Millar Instruments, USA	SPR-839
Muisventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Minivent - TYPE 845
Muisventilator	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Y-aansluiting met intubatiecanule OD 1,2mm 73-2844
Verdamper	Dräger Medical AG&CO.KG, Germany	19.3 Isofluran-Verdamper (een nieuwere versie is beschikbaar onder catalogusnummer  D-877-2010)
Microscoop	Leica Microsystems, Germany	MZ 7.5
Lichtbron	Schott AG, Germany	KL 1500 LCD
6-0 Prolene	Ethicon, USA	Polypropyleennaald BV-1 9,3 mm 3/8c	naald voor chirurgie
Seraflex	Serag Wiessner, Germany	USP 5/0 schwarz;  IC108000	naald voor vernauwing
Homoeotherme gecontroleerde operatietafels	Harvard Apparatus GmbH, Germany	Type 872/3 HT met driepootstandaard en homoeotherme controller Type 874; 73-4233
Flexibele rectale sonde	Harvard Apparatus GmbH, Germany	1,6 mm OD; 55-7021
Doppler Signaalvisualisatie Instrument	Indus Instruments, USA	Doppler Signaalverwerkingswerkstation (DSWP) met 20MHz Gepulseerde Doppler Module
Arruga Intracapsulaire Pincetten	Altomed, UK	A5400
Doppler Sonde	Indus Instruments, USA	20MHz Buismaat Sonde
Jaffe Ooglid Retractor	Altomed, UK	A3513