Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

9.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57410

⸱

20 maart 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Université de Sherbrooke

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Samenvatting

De DNA schade reactie (DDR) maakt gebruik van een overvloed aan eiwitten te detecteren, signaleren en repareren van DNA laesies. Deze reactie uitgezet is cruciaal voor het genoom onderhoud mechanismen begrijpen. Aangezien werving en uitwisseling van eiwitten bij letsels hoogst dynamische zijn, vereist hun studie de capaciteit voor het genereren van DNA-beschadiging in een snelle en ruimtelijk gescheiden wijze. Hier beschrijven we procedures om lokaal de schade van DNA in menselijke cellen met behulp van een algemeen beschikbare laser-scannen confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser lijn. Accumulatie van genoom "onderhoud" factoren op laser strepen kunnen worden beoordeeld door immunofluorescentie (IF) of in real-time met behulp van eiwitten die zijn gelabeld met de fluorescerende verslaggevers. Met behulp van gefosforyleerd Histon H2A. X (γ-H2A.X) en replicatie eiwit A (RPA) als markeringen, de methode biedt voldoende resolutie te discrimineren lokaal aangeworven factoren die verspreid over de aangrenzende chromatine. Wij bieden verder ImageJ gebaseerde scripts aan efficiënt toezicht op de kinetiek van eiwit Herlokalisatie op DNA schade sites. Deze verfijningen vereenvoudigen sterk de studie van de dynamiek van de DDR.

Inleiding

Cellen worden voortdurend blootgesteld aan endogene en exogene bronnen van DNA-schade die hun genomic integriteit bedreigen. De DDR is een ensemble van signalering van trajecten die detecteren, signaleren en repareren van DNA laesies te handhaven van de stabiliteit van het genoom. DNA-double-stranded einden (DSBs), de DDR gebeurt voornamelijk op twee complementaire platformen: γ-H2A.X-geëtiketteerden chromatine en een resected single-stranded DNA (ssDNA) regio meestal bekleed met de ssDNA-bindende complexe RPA1,2.

UV-laser-micro-bestraling van cellen vooraf gesensibiliseerde personen met de thymidine analoge 5-bromo-2' deoxyuridine (BrdU) of de bisbenzimide ethoxide trihydrochloride (BBET, Hoechst 33342) DNA kleurstof wordt gemaakt van een mengsel van DNA letsels, met inbegrip van single-stranded einden ( SSBs) en DSBs die een gelokaliseerde DDR op zowel de ssDNA als de chromatine platformen3,4te ontlokken. Vorige werk bleek dat rekrutering van het genoom onderhoud factoren aan deze twee verschillende platformen op DSB kan worden onderscheiden met behulp van energierijke UV-A lasers (335-365 nm) gecombineerd met als2,5. Microscopen uitgerust met dergelijke lasers zijn kostbaar, aangezien zij vereisen een hoge energie-laser en speciale UV-A-verzendende doelstellingen, waardoor ze veel minder gangbaar in academische en farmaceutische instellingen dan laser-scannen confocal microscopen met 405 nm laser lijnen. De studie van eiwit werving en uitwisseling op micro-bestraalde sites is ook uitgesloten door het moeizame handmatige beeldanalyse moet beschrijven het dynamisch gedrag van genoom onderhoud factoren.

Hier, laten we zien dat de pre sensibilisatie van cellen met BrdU of BBET nucleïnezuur vlek gevolgd door micro-bestraling met behulp van een 405 nm laser op een gemeenschappelijke confocal microscoop kan de bewaking van het genoom onderhoud factor dynamiek DNA laesies. Met behulp van γ-H2A.X of RPA complexe subeenheden als platform markers samen met z-stapelen voor groter scherptediepte en deconvolutie voor verbeterde resolutie kunt de experimentator te discrimineren factoren die lokaal worden gerekruteerd voor DSBs die verspreidde zich naar grote chromatine domeinen rondom de initiële laesie. Deze sub classificatie volgens verschillende intra nucleaire compartimenten helpt de potentiële rol van genfunctieonderzoek eiwitten gerekruteerd om micro-bestraalde sites te verfijnen. Bovendien, wij bieden handige protocollen en geoptimaliseerd pijpleidingen om snel de dynamiek van genoom onderhoud factoren met behulp van de open-sourcesoftware Fiji (een ImageJ distributie)6,7,8te analyseren. Deze verfijningen aan huidige micro-bestraling methoden maken de studie van de DDR mogelijk in vrijwel elke omgeving laboratorium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. pre sensibilisatie van cellen

  1. 24 uur vóór het experiment micro-bestraling zaad 40.000 U2OS cellen per putje in 1 x DMEM met 10% FBS in 8-well cultuur slides met 170 µm dik dekglaasje aan-achtige glas/polymeer bodem om ervoor te zorgen maximale doorlating van 405 nm laserlicht en uitstekende beeldvorming omgekeerde confocal microscoop met een laser-scanning. Als een 8-well-microslide, gebruik 500 µL van media of oplossingen per putje voor alle latere behandelingen en wassen stappen van het protocol.
    Opmerking: Als gevolg van hun platte morfologie, goede hechting, en grote kernen, U2OS cellen vergemakkelijken de detectie van eiwit werving op micro-bestraalde sites maar andere aanhangend celtypes kunnen desgewenst worden gebruikt. Cellen moeten idealiter circa 80% confluentie ten tijde van micro-bestraling te verhogen van het aantal cellen per experiment bestraald. Zeer hoge samenvloeiing kan resulteren in wijzigingen van de celcyclus die specifieke reparatie trajecten zoals homologe recombinatie die tijdens de S en G2 fasen van de celcyclus9 plaatsvindtkunnen erover.
  2. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C met 5% CO2, en dan vooraf het sensibiliseren van de cellen met (stap 1.3) BrdU of (stap 1.4) BBET (Hoechst 33342).
    Opmerking: Om te observeren live aanwerving van een proteïne van belang (POI's) aan DNA laesies, transfect of transduce plasmide DNA uitvoering van een fusie tussen een fluorescente proteïne en een POI 24 h na het zaaien van de cel. 24u na-transfection/signaaltransductie, vooraf sensibiliseren en micro-bestralen van de cellen voor het controleren van de aanwerving van de POI op DNA schade sites in real-time.
  3. Het vergroten van het aantal DSBs gegenereerd door expositie aan de 405 nm laser, voeg toe 10 µM van BrdU tot de media gedurende 24 uur voorafgaand aan micro-bestraling. Spoel de cellen tweemaal met medium zonder fenol red om ervoor te zorgen maximale blootstelling van de cellen aan de 405 nm laser voorafgaand aan micro-bestraling, met behulp van een micropipet.
  4. Als alternatief, het behandelen van cellen voor 15 min met BBET bij 10 µg/mL in het juiste medium in een celkweek incubator bij 37 ° C. Na de behandeling, spoel tweemaal met medium zonder fenol red voorafgaand aan micro-bestraling.

2. micro-bestraling van cellen

  1. Selecteer een geschikte laser-scannen confocal microscoop.
    Opmerking: De hier gepresenteerde experimenten werden uitgevoerd op een systeem van de Microscoop uitgerust met een 50 mW 405 nm laser lijn en een doelstelling van 63 X 1.4 numerieke diafragma olie. Voor het genereren van DSBs, cellen waren micro-bestraalde op 1 X scan zoom bij 1024 x 1024 pixels/veld (0.21 µm/pixel bij 63 X vergroting) en in de unidirectionele modus op 8 µs/pixel. De kracht van de laser gebruikt was 25% en 80% voor BBET - en BrdU-pre-gesensibiliseerde cellen, respectievelijk. Om gebruikers te helpen hun systeem configureren, werd de laser macht na doelstelling op het voorgestelde systeem gemeten met behulp van een energiemeter volgens de instructies van de fabrikant. De afmetingen komen overeen met 2.6 mW en 7.0 mW voor BBET - en BrdU-pre-gesensibiliseerde cellen, respectievelijk.
  2. Zet de Microscoop en het milieu kamer.
    1. De kamer op 37 ° C met 5% CO2 instellen voordat de monsters worden geplaatst in de on-stage incubator om te voorkomen dat onnodige stress op de cellen en om te zorgen voor homogene DDR kinetiek in experimenten.
  3. Velden met goed gedistribueerde cellen selecteren, aanpassen van de focus en registreren hun positie om Beeldacquisitie na het als protocol. Verwerven van ten minste één beeld dat als een pre schade referentiepunt dienen zal moet controleren de kinetiek van eiwit werving na micro-bestraling.
    Opmerking: Gerasterde kweekvat kunnen ook worden gebruikt om de lokalisatie van micro-bestraalde cellen in opeenvolgende stappen.
    1. Aanpassen voor als experimenten cuvetten BBET-label, de focus op cellen met behulp van de 405 nm laser op de laagste laser kracht voldoende te visualiseren de cellen om ongerechtvaardigde DNA-schade te voorkomen.
      1. Vermijd het gebruik van widefield fluorescentie te passen de focus op BBET gebeitste cellen zoals het UV-licht door de lamp uitgestraalde DNA-beschadiging op verlichte sites zal veroorzaken.
    2. Als cuvetten BrdU-label, past u de focus met behulp van differentiële interferentie contrast (DIC) of fase contrast imaging door te kijken naar sub nucleaire functies zoals nucleoli.
    3. Als cuvetten uiting van fluorescently-geëtiketteerden POI's, selecteert u een brandvlak met representatieve fluorescentie intensiteit.
      Opmerking: Vermijd cellen die uitdrukking geven aan zeer hoge niveaus van de POI als sterke overexpressie in artefactuele lokalisatie resulteren kan. Daarnaast Selecteer cellen die uitdrukking geven aan de POI op vergelijkbare niveaus (selectie van stabiele klonen is sterk aanbevolen om te minimaliseren van de variaties in POI expressie en rekrutering niveaus).
  4. Configureren van de Microscoop voor de stap van de micro-bestraling met de fluorescentie-Systeemherstel na photobleaching (FRAP) _module van het systeem.
    Opmerking: De belangrijkste parameters te overwegen bij het opzetten van het systeem van de Microscoop voor micro-bestraling experimenten zijn: het vermogen van de 405 nm laser, aantal iteraties (dat wil zeggen, aantal keren de laser over dezelfde coördinaten gaat), aantal pixels/veld (op 63 X vergroting en 1 pixel resolutie 1024 x 1024 = 0,21 µm), en Nadruktijd per pixel. Al deze factoren zullen gevolgen voor de hoeveelheid energie die de cellen ervaren en bijgevolg gegenereerde (Zie discussie Zievoormeerinformatie dosis optimalisatie) schade toebrengt aan de hoeveelheid en het type van DNA.
  5. Met behulp van de FRAP-module van het systeem van de Microscoop, micro-bestralen de cellen.
    Opmerking: Op de meeste systemen, micro-bestraling van meerdere cellen kan worden uitgevoerd in een enkel veld als vlekken of lijnen/rechthoeken (meestal 1-2 µm breed). Bij het uitvoeren van live-imaging van fluorescently gelabelde proteïnen onmiddellijk na schade, beperken de micro-bestraling tot een klein aantal cellen per veld omdat de tijd genomen om elke cel micro-bestralen zal resulteren in een vertraagde inductie van de DDR. Dit is vooral belangrijk bij de bewaking van de eiwitten die zeer snel worden gerekruteerd voor DNA laesies.
  6. Na micro-bestraling, zet terug de multi goed dia's of platen in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 , voor de vereiste duur voorafgaand aan de verwerking van de monsters voor als (sectie 5) of direct doorgaan met leven-imaging (sectie 3).
    1. Als een eerste stap, en vast te stellen de cellen binnen een paar minuten tot een paar uur na bestraling voor het als protocol. Afhankelijk van het POI variëren werving kinetiek. Meestal eiwitten die chromatine-geassocieerde op DSBs en SSBs zeer snel zal localiseren naar de laesie en soms worden verwijderd binnen 5 min. Sommige factoren zoals die bij de ssDNA verzamelen zullen worden aangeworven op latere tijdstippen zodra de resectie machine bezig heeft gehouden en blijven er urenlang (Zie Figuur 1 en referentie4).

3. live-imaging van Fluorescently gelabelde proteïnen

  1. Time-lapse beeldvorming van het micro-bestraalde cellen uit te voeren. Voor de eiwitten die zeer snel worden gerekruteerd voor laesies, een paar seconden per frame zal zijn ideaal, maar voor de eiwitten die naar het beschadigde gebied later (b.v., resectie factoren) acquisitie lokaliseren kunnen worden uitgevoerd elke 1-2 minuten totdat een plateau is bereikt.
    Opmerking: De kracht van de laser voor Beeldacquisitie te vermijden bleken zo veel mogelijk en om ervoor te zorgen dat eiwit werving op schade sites niet bereikt verzadiging die signaal kwantificering uitsluiten zou minimaliseren en latere analyseert (Zie data-analyse Punt 4). Op het voorgestelde systeem, de beeldvorming werd gedaan met een 63 X / 1.4 olie objectieve met behulp van een 8 µs/pixel nadruktijd, 1024 x 1024-resolutie, 1 X zoom, en gemiddeld van 2. Merk op dat deze parameters mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor andere systemen en/of verschillende experimenten.
  2. Micro-bestralen cellen in extra velden tot kinetiek metingen voor 15-30 cellen worden verkregen. Herhaal de experimenten ten minste 3 keer in biologische replicatieonderzoeken de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de kinetiek van de aanwerving te waarborgen.
    Opmerking: Bij de aanpassing van dit protocol aan een specifieke confocal systeem, het wellicht nuttig om te beginnen door het toezicht op de kinetiek van de aanwerving van een bekende fluorescently-geëtiketteerden genoom onderhoudsfactor (b.v., 53BP1-GFP, RPA32-GFP, enz.). Met behulp van live-imaging voor het optimaliseren van micro-bestraling voorwaarden, kan de gebruiker voor het testen van meerdere parameters snel.

4. aanwerving kinetiek analyse

  1. De analyse van de Microirradiation plugin10 in de Fiji beeld analyse software11installeren
  2. Open de verworven afbeeldingen in Fiji. Selecteer "De schade Analyzer" in het pull-down plugins menu in de Microirradiation Analysis suite. Volg de aanwijzingen naar een gebied op de achtergrond van belang (ROI) (meestal 3 x 3 µm) en niet-bestraalde en bestraalde ROIs in elke cel van micro-bestraalde definiëren.
    1. Gebruik ROIs van de zelfde grootte te minimaliseren van potentiële fouten in betekenen signaal intensiteit. Voor verworven beelden, omvatten ook ten minste één pre bestraling frame die worden gebruikt als een basislijn voor het controleren van aanwerving op micro-bestraalde sites.
    2. Zodra alle ROI gegevens zijn verzameld over de volledige time-lapse serie, sla het bestand gemaakt door de plugin met de resultaten als een csv (door komma's gescheiden bestand) of txt bestand (tab is scheidingsteken). Dit bestand bevat metingen van de gemiddelde intensiteit voor elk tijdstip en elke ROI (bedoel intensiteit achtergrond, betekenen intensiteit nietdoorstraald, en bedoel intensiteit bestraald).
      Opmerking: De plugin wordt automatisch afgetrokken de achtergrond intensiteit (ikb) van de intensiteit van de bestraalde ROIs (iks) en de niet-bestraalde ROIs (ikn). Het berekent ook een verhouding tussen beide waarden (Zie de onderstaande formule) om te corrigeren voor photobleaching (Irradiated/niet-bestraalde).
      figure-protocol-1
      De plugin ook berekent een normalisatie tussen het eerste punt van de tijd (waarde ingesteld op 1) en alle andere tijd punten voor elke kern (verhouding ten opzichte van het eerste punt van de tijd). Meer informatie vindt u op de website plugin10.
  3. Het uitvoeren van de analyse met behulp van de plugin voor alle micro-bestraalde cellen (ten minste 15 – 30 cellen) en grafiek de gemiddelde relatieve verrijking op micro-bestraalde regio's na verloop van tijd. Bereken de standaardfouten van de gemiddelde voor elk punt en plot ze.
    1. Bevestigen van de verschillen in werving kinetiek tussen twee experimentele omstandigheden door het uitvoeren van de Student t-tests voor elk gegevenspunt.

5. Indien Protocol

  1. ALS oplossingen voor te bereiden. Bereid de oplossing van de pre/post-extraction (ijskoude 1 x PBS met 0,25% Triton X-100), oplossing wassen (1 x PBS met 0,05% Tween-20), blokkeren van oplossing (1 x PBS met 3% BSA en 0,05% Tween-20), en fixatie oplossing (Paraformaldehyde 3% + sacharose 2% in PBS 1 x) in conische polypropyleen-buizen.
    Opmerking: Voor een enkel 8-well microslide, 10 mL pre/post-extraction oplossing, 50 mL oplossing van blokkerende 10 mL en 5 mL van de oplossing van de fixatie te wassen zijn.
    1. Bereid de oplossing van de fixatie.
      1. Onder een chemische motorkap, meng 400 mL tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O) met 15 g paraformaldehyde en 30 µL van 10 N NaOH in een erlenmeyer van 1 L.
      2. Sluit de container en warmte bij 65 ° C op een warmhoudplaat magneetroerder tijdens het roeren om te solubilize de paraformaldehyde volledig.
      3. Met behulp van een precisiepipet 25 mL, voeg 50 mL 10 X PBS, roer en filter door middel van een 0,45 µm filter.
      4. Voeg 10 g van sacharose en vul tot 500 mL met ddH2O.
      5. Aliquot de oplossing in de conische buisjes 15 mL; bewaren bij-20 ° C tot gebruik.
    2. De kernen kleurstofoplossing door verdunning van een stamoplossing van 1 mg/mL van 4,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:1,000 in 1 x PBS voor te bereiden.
  2. Met behulp van een micropipet, zorgvuldig Verwijder het medium van de putten van de multi goed microscopie dia's of platen en onmiddellijk wassen met 500 µL van als wassen oplossing door het veranderen van de oplossing twee keer zonder te wachten.
    Opmerking: De hier gepresenteerde als gegevens werden verkregen met behulp van cellen gekweekt in 8-well microscopie dia's die werden gewassen en geïncubeerd in 500 µL van alle oplossingen. Volumes moeten worden aangepast afhankelijk van de cel cultuur recipiënten die worden gebruikt door onderzoekers. Bovendien voeren het als protocol met uiterste zorg zoals cellen gemakkelijk van de onderkant van de glazen/polymeer losmaken kunnen. Gebruik een micropipet voor alle wijzigingen van de oplossing om te minimaliseren van cel verlies.
  3. Incubeer op ijs voor 5 min met 500 µL van ijskoud als pre/post-extraction oplossing en swirl zachtjes met de hand voor 15 – 30 s voor het uitvoeren van de pre-winning stap die meest cytoplasmatische en nucleoplasmic eiwitten verwijdert en het signaal van de chromatine maximaliseert / DNA-geassocieerde factoren.
  4. Wassen tweemaal met 500 µL van als wassen oplossing.
  5. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 500 µL van als fixatie oplossing. Ook gebruiken een pre-en-klare paraformaldehyde-oplossing (3-4%) voor de fixatie stap.
  6. Wassen tweemaal met 500 µL van als wassen oplossing.
  7. Incubeer op ijs gedurende 5 min. in 500 µL van ijskoud als pre/post-extraction oplossing en swirl van de dia voorzichtig met de hand de permeabilization stap moet uitvoeren.
  8. Wassen tweemaal met 500 µL van als wassen oplossing.
  9. Incubeer ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur met 500 µL van als blokkerende oplossing.
  10. Verwijderen van blokkerende oplossing met behulp van een micropipet en na een nacht bebroeden in een bevochtigde ruimte bij 4 ° C met 250 µL primaire antilichamen verdunde oplossing te blokkeren.
    Opmerking: Het is raadzaam voor het uitvoeren van de incubatie met primaire antilichamen opeenvolgend om te voorkomen dat potentiële artefacten van co lokalisatie. Zodra de nodige controles zijn verricht, incubeer gelijktijdig primaire antilichamen om te versnellen het proces.
  11. Wassen vier keer gedurende 5 min. in 500 µL van als wassen oplossing met zachte agitatie (60 rpm op een rotator).
  12. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C met 250 µL van secundaire antilichamen verdund in blokkerende oplossing in een bevochtigde kamer.
    Opmerking: De monsters behoeden voor licht op toevoeging van secundaire antilichamen fluorescently-label.
  13. Was viermaal voor 5 min in 500 µL van als wassen oplossing met zachte agitatie.
  14. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. in 500 µL van 1 x PBS, met 1 µg/mL DAPI om vlek kernen.
  15. Wassen tweemaal met 500 µL van 1 x PBS en laat cellen in 500 µL 1 x PBS oplossing voor imaging.
  16. Met behulp van gerasterde dia's of geregistreerde podium posities, vinden de micro-bestraalde cellen met behulp van een goed gekarakteriseerd DNA schade markering (b.v., γ-H2A.X, RPA32, enz.).
  17. Het imago van de multi goed cultuur dia's of platen in alle relevante kanalen met behulp van de juiste instellingen op een laser-scanner confocal microscoop.
    Opmerking: Op het voorgestelde systeem, de beeldvorming werd gedaan met een 63 X / 1.4 olie objectieve met behulp van een 8 µs/pixel nadruktijd, 1024 x 1024-resolutie, 1 X zoom, en gemiddeld van 2. Merk op dat deze parameters mogelijk moet worden geoptimaliseerd voor andere systemen en/of verschillende experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Naar aanleiding van micro-bestraling, cellen zijn toegestaan om te herstellen voor een bepaalde periode van tijd, afhankelijk van de aard van het genoom onderhoud eiwitten1,12. DSBs zullen worden verwerkt door nucleasen, meest uitgebreid tijdens de S en G2 fasen van de celcyclus, maken een beperkt gebied van ssDNA die snel is bekleed door RPA en andere genoom onderhoud factoren9. Deze ssDNA regio is omgeven...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hierboven beschreven methoden kunt, 405 nm laser-micro-bestraling van vooraf met BBET of BrdU gesensibiliseerde cellen de gelokaliseerde generatie van DNA letsels, met inbegrip van DSBs binnen de kernen van aanhangend menselijke cellen. Kinetiek van de DDR op deze DSBs zijn vergelijkbaar met die worden gegenereerd met andere methoden in eukaryote cellen9,18,19. DSB resectie op micro-bestraalde sites leidt tot ssDNA-generatie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada [Discovery subsidie 5026 A.M] en door een volgende generatie van wetenschappers beurs van de Cancer Research Society [21531 naar A.M]. Wij danken Jean-François Lucier voor het uitstekende kwaliteitscontrole van de Fiji Python scripts en advies verstrekken over statistische analyse. Wij danken Dr. Stephanie A. Yazinski voor de als recept voor de oplossing van de fixatie. We bedanken Paul-Ludovic Karsenti voor hulp met laser macht metingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscopeOlympus
FluoView FV3000 software (version 2.1)Olympus
405 nm laserCoherentRadiatiebron
Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1OkolabOKO-UNO-1
60X /1.4 ObjectiefOlympusOlie-immersieobjectief
8-well culture slides on coverglass (X-well)Sarstedt94.6190.802
U2OS osteosarcoma human cell lineATCCHTB-96Stabile cellijnen
4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)ThermoFisherD1306Let op giftig
5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) Sigma-Aldrich59-14-3
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Let op giftig
Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342)ThermoFisher62249
Bovine serum albumin (BSA)ThermoFisherBP1600-100
Trypsin EDTA 0.1% ThermoFisher15400-054
Triton X-100 BioShopTRX777.100
Tween-20 ThermoFisherBP337-500
Sucrose BioShopSUC507
JetPRIME transfectiereagens Polyplus114-07
ProLong Diamond Antifade mountant met DAPI ThermoFisherP36962
DMEM 1X, + phenol redWisent 319-005-CL
DMEM 1X, - phenol redWisent319-051-CL
Fetaal bovien serum (FBS)Wisent 080-150
Muis anti-RPA32 antilichaamAbcamab21751:500 voor IF
Konijn anti-γ-H2A.X antilichaamCell Signaling 9718S1:500 voor IF
Konijn Anti-53BP1 antilichaamCell Signaling 4937S1:500 voor IF
Konijn Anti-PRP19 antilichaamAbcamab276921:500 voor IF
Geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 647Cell Signaling 4414S1:250 voor IF
Geit anti-muis IgG Alexa Fluor 488 Cell Signaling 4408S1:250 voor IF
Fiji image analysis open-source software https://fiji.sc
1918-K Power meter  met een 918D-SL-0D3 sensorNewport

Referenties

  1. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  2. Bekker-Jensen, S., et al. Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks. The Journal of Cell Biology. 173 (2), 195-206 (2006).
  3. Limoli, A. C. L., Ward, J. F., May, N. A New Method for Introducing Double-Strand Breaks into Cellular DNA. Radiation Research. 134 (2), 160-169 (1993).
  4. Polo, S. E., Jackson, S. P. Dynamics of DNA damage response proteins at DNA breaks: a focus on protein modifications. Genes & development. 25 (5), 409-433 (2011).
  5. Lukas, C., Falck, J., Bartkova, J., Bartek, J., Lukas, J. Distinct spatiotemporal dynamics of mammalian checkpoint regulators induced by DNA damage. Nature cell biology. 5 (3), 255-260 (2003).
  6. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  7. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Symington, L. S., Gautier, J. Double-strand break end resection and repair pathway choice. Annual review of genetics. 45, 247-271 (2011).
  10. Garneau, D., Maréchal, A. Microirradiation Analysis Fiji Plugin. , Available from: https://bitbucket.org/daniel_garneau/microirradiation_analysis/ (2017).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Izhar, L., et al. A Systematic Analysis of Factors Localized to Damaged Chromatin Reveals PARP-Dependent Recruitment of Transcription Factors. Cell Reports. 11 (9), 1-15 (2015).
  13. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2013).
  14. Maréchal, A., et al. PRP19 Transforms into a Sensor of RPA-ssDNA after DNA Damage and Drives ATR Activation via a Ubiquitin-Mediated Circuitry. Molecular Cell. 53 (2), 235-246 (2014).
  15. Dubois, J. -C., et al. A phosphorylation-and-ubiquitylation circuitry driving ATR activation and homologous recombination. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8859-8872 (2017).
  16. Wan, L., Huang, J. The PSO4 Complex Associates with RPA and Modulates the Activation of ATR. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6619-6626 (2014).
  17. Abbas, M., Shanmugam, I., Bsaili, M., Hromas, R., Shaheen, M. The role of the human Psoralen 4 (hPso4) complex in replication stress and homologous recombination. The Journal of Biological Chemistry. 289 (20), 14009-14019 (2014).
  18. Chung, W. H., Zhu, Z., Papusha, A., Malkova, A., Ira, G. Defective resection at DNA double-strand breaks leads to de novo telomere formation and enhances gene targeting. PLoS Genetics. 6 (5), (2010).
  19. Hicks, W. W. M., Yamaguchi, M., Haber, J. E. Real-time analysis of double-strand DNA break repair by homologous recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (8), 3108-3115 (2011).
  20. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237(2015).
  21. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5 (9592), (2015).
  22. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  23. Dinant, C., et al. Activation of multiple DNA repair pathways by sub-nuclear damage induction methods. Journal of Cell Science. 120 (15), 2731-2740 (2007).
  24. Kong, X., et al. Comparative analysis of different laser systems to study cellular responses to DNA damage in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 37 (9), e68(2009).
  25. Holton, N. W., Andrews, J. F., Gassman, N. R. Application of Laser Micro-irradiation for Examination of Single and Double Strand Break Repair in Mammalian Cells. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
  26. Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation. Bioconjugate Chemistry. 18 (2), 431-437 (2007).
  27. Mortusewicz, O., Amé, J. C., Schreiber, V., Leonhardt, H. Feedback-regulated poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1 is required for rapid response to DNA damage in living cells. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7665-7675 (2007).
  28. Kleiner, R. E., Verma, P., Molloy, K. R., Chait, B. T., Kapoor, T. M. Chemical proteomics reveals a γH2AX-53BP1 interaction in the DNA damage response. Nature Chemical Biology. 11 (10), 807-814 (2015).
  29. Soultanakis, R. P., et al. Fluorescence detection of 8-oxoguanine in nuclear and mitochondrial DNA of cultured cells using a recombinant Fab and confocal scanning laser microscopy. Free Radical Biology and Medicine. 28 (6), 987-998 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Respons op DNA-schadeconfocale microscopiehiston H2AXreplicatieproteïne AImageJ-analyseFRAP-moduleimmunofluorescentieprotocol
Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.