Method Article

Ontwikkeling en validatie van een Ultrasensitive enkel molecuul Array digitale Enzyme-linked Immunosorbent Assay voor menselijk Interferon-α

DOI:

10.3791/57421

⸱

June 14th, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Immunobiology of Dendritic Cells, Institut Pasteur, 2INSERM U1223, 3Laboratory of Neurogenetics and Neuroinflammation, INSERM UMR1163, Institut Imagine, 4MRC Human Genetics Unit, MRC Institute of Genetics and Molecular Medicine, University of Edinburgh, 5Manchester Centre for Genomic Medicine, University of Manchester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een enkel molecuul matrix digitale Analyse ELISA, waarmee de ultra gevoelige detectie van alle IFN-α subtypen in menselijke specimens.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hoofddoel van dit protocol is voor het beschrijven van de ontwikkeling en validatie van een interferon (IFN)-α enkel molecuul matrix digitale Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) assay. Dit systeem maakt het kwantificeren van menselijke IFN-α eiwit met ongekende gevoeligheid, en met geen Kruisallergie voor andere soorten van IFN.

De eerste belangrijke stap van het protocol is de keuze van het antilichaam-paar, gevolgd door de vervoeging van het antilichaam van opname naar paramagnetisch kralen en biotinylation van de detectieantilichaam. Na deze stap, kunnen verschillende parameters zoals assay configuratie, detector antilichaam concentratie en samenstelling van de buffer worden gewijzigd tot optimale gevoeligheid is bereikt. Ten slotte, specificiteit en reproduceerbaarheid van de methode worden beoordeeld om te zorgen voor vertrouwen in de resultaten. Hier, ontwikkelden we een IFN-α enkel molecuul matrix assay met een limiet van detectie van 0,69 fg/mL met behulp van hoge-affiniteit autoantilichamen geïsoleerd van patiënten met biallelic mutaties in het auto-immune regulator (AIRE) eiwit veroorzaakt auto-immune polyendocrinopathy syndroom type 1/auto-immune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermale dystrofie (APS1/APECED). Bovenal ingeschakeld deze antilichamen detectie van alle 13 IFN-α-subtypen.

Deze nieuwe methode kan de detectie en kwantificering van IFN-α eiwit in menselijke biologische monsters bij attomolar concentraties voor de eerste keer. Een dergelijk instrument zullen zeer nuttig zijn bij het toezicht op de niveaus van deze cytokine in gezondheid en ziekte staten, de meeste met name infectie autoimmuniteit en autoinflammation.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Type ik IFNs zijn een familie van cytokines die een centrale rol spelen in het orkestreren van antivirale immuunrespons. Ze werden voor het eerst ontdekt door Isaacs en Lindenmann 60 jaar geleden1,2 en het is nu bekend dat deze heterogene familie van polypeptiden bestaat uit 14 verschillende subklassen (13 IFN-α-subtypen en 1 IFN-β). Type ik IFNs essentieel zijn voor de goedkeuring van virale infecties, maar zijn ook betrokken bij de pathologie van een verscheidenheid van ziekten bij de mens Staten, met inbegrip van de auto-immune aandoeningen systemische lupus erythematosus (SLE), jonge dermatomyositis (JDM), en het type Ik interferonopathies in welk constitutieve type resultaten ik IFN-geïnduceerde signalering in pathologie3,4,5,6,7.

Studeren ik typ IFN proteïne niveaus in biologische monsters sinds de initiële identificatie uitdagende is als een "inmenging stof"1,2. Broodje Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) is momenteel de meest gebruikte methode voor de detectie van IFN-α eiwit. Ondanks het feit dat specifieke, eenvoudige en snelle, typ ik IFN ELISAs huidige belangrijke beperkingen, zoals beperkte gevoeligheid. Daarnaast vereist het meten van alle IFN-α-subtypen het gebruik van meerdere tests elk met hun eigen detectiecapaciteit en gevoeligheid. Hoewel er commerciële ELISAs die verschillende subtypen van IFN-α detecteren, de gevoeligheid is beperkt (1.95 pg/mL, 12,5 pg/mL en 12,5 pg/mL, respectievelijk) die is vaak onvoldoende IFN-α om proteïne te ontdekken in biologische monsters. Om deze beperking ondervangen verschillende biologische proxy testen zijn ontwikkeld om te kwantificeren typ ik IFN door het meten van de geïnduceerde genexpressie of functionele activiteit8,9,10,11, 12 , 13 , 14. deze testen bieden echter niet een directe meting van het IFN-α-eiwit.

In deze studie was enkel molecuul matrix digitale ELISA technologie gebruikt om een assay voor het opsporen van één IFN-α eiwitmolecules. Digitale ELISA maakt gebruik van de dezelfde basischemie als conventionele ELISA, echter de reactie vindt plaats in matrices bestaat uit 50.000 individuele 46 femtoliter formaat wells15,16. Één eiwitmolecules zijn gevangen door antilichaam beklede paramagnetisch kralen en gemarkeerd met een biotinyleerd detectieantilichaam, gevolgd door de binding van een enzym-conjugaat, daar-β-galactosidase (SBG). Daarna worden de parels opgeschort met een fluorogenic enzym substraat, resorufin-β-D-galactopyranoside (RGP), in één-molecuul arrays. Reactie 2 miljard keer17, een hoge plaatselijke concentratie van fluorescent signaal wordt bereikt door het verlagen van het volume en enkel molecuul tellingen worden haalbaar is, zoals elke molecuul genereert een signaal dat kan nu betrouwbaar worden gemeten18. In wezen zijn enkel molecuul arrays geschikt voor het tellen van één immunocomplexes en bepaling van een gemiddeld aantal enzymen per kraal (AEB). Tellen van de microwells waarin een signaal wordt gedetecteerd toelaat kwantificering/digitalisering van eiwitmolecules, aangezien er een direct verband tussen eiwitconcentratie en de verhouding tussen immunocomplexed-kralen en parels aanwezig zijn in in totaal de femtoliter middelgrote kamers.

Yeung et al. een studie van de uitgebreide platformonafhankelijke evaluatie met behulp van negen verschillende technologieën en vier cytokine-immunoassay met als doel assay precisie, gevoeligheid en gegevens correlatie te vergelijken tussen de verschillende platformen19uitgevoerd. Een van de belangrijkste bevindingen van de studie was dat enkel molecuul arrays en enkel molecuul immunoassay tellen de hoogste gevoeligheid voor detectie van cytokines in menselijk serum binnen het concentratiebereik van sub-pg/mL gepresenteerd. Enkel molecuul matrix digitale ELISA cytokine testen zijn gebruikt voor het bestuderen van de rol van TNF-α en IL-6 bij ziekte van Crohn ziekte20, IFN-α in interferonopathy en auto-immuunziekten patiënten 7, en de verschillende post-translationally gewijzigd vormen van C-X-C motief chemokine 10 (CXCL10) in chronische hepatitis en gezonde donoren ontvangen sitagliptin21,22. Andere toepassingen omvatten meting van rodopsine bij patiënten met diabetische retinopathie23; de studie van de hersenen pathologieën via metingen van de serum/plasma van neurofilament licht24 en amyloid-β 1-42 peptide25, in het kader van multiple sclerose en de ziekte van Alzheimer, respectievelijk. Enkel molecuul matrix testen kunnen ook worden gebruikt voor detectie van de verbeterde pathogenen zoals karakterisering van de HIV viral reservoir26, en ook voor detectie van DNA27 en micro RNAs28. Een groot voordeel van de technologie van de matrix één molecuul is deze hoge veelzijdigheid, zoals een bepaling tegen elke analyt van belang kan worden ontwikkeld als een paar specifieke antilichaam beschikbaar is. Daarnaast zijn homebrew assay kits commercieel verkrijgbaar, waardoor de ontwikkeling van nieuwe testen, het protocol waarvan gedetailleerd in een gewijzigde vorm hieronder beschreven wordt.

Hier is een gedetailleerde beschrijving van de ontwikkelings- en valideringsfase stappen voor een enkel molecuul matrix assay dat resultaten gepresenteerd in verbeterde gevoeligheid voor IFN-α eiwit detectie. Antilichamen voor enkel molecuul matrix testen moet zeer specifieke, het vermijden van kruis-reactiviteit met de verwante proteïnen (met soorten specificiteit beschouwd indien van toepassing). In het ideale geval moeten antilichamen met een KD kleiner dan 10-9 M worden gekozen; hoge affiniteit zorgt voor een sterke binding met de productie van een hogere signaal. De kinetiek van de antilichaam-antigeen-bindend zijn ook belangrijk, en snel Kop en langzame Kaf zal gunst antigeen-antilichaam complexe vergadering. Beginnen met een paar van antilichaam dat een goede prestatie in klassieke ELISA, met een limiet aantoonbaarheidsgrens (LOD) van 1-100 pg/mL heeft, verhoogt de kans voor het verkrijgen van een hooggevoelige enkel molecuul matrix assay. Chang en collega's uitgevoerd gedetailleerde kinetische studies van de Biomoleculaire interacties bij elke stap, stelt een geheel van vergelijkingen te voorspellen van analytische gevoeligheid18. Zij toonden aan dat enkel molecuul matrix digitale ELISA lijkt effectief binnen een brede waaier van antilichaam affiniteiten (KD ~ 10−11 - 109 M), evenals die signaal-generatie is meer afhankelijk van de op-rate van dergelijke antistoffen.

Voor het gebruik van hoge affiniteit Typ antilichamen die we van antilichamen geïsoleerd van patiënten met het syndroom van auto-immune polyendocrinopathy profiteerde 1/auto-immune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermale dystrofie (APS1/APECED)29. Om redenen die nog niet zijn begrepen, de grote meerderheid van de AIRE-deficiënte personen ontwikkelen een kernset van hoge-avidity antilichamen tegen alle IFN-α subtypen29en we kozen twee anti-IFN-α antilichaam klonen van complementaire bindende affiniteiten voor de verschillende IFN-α subtypes, zoals geraamd door IC50 waarden. De combinatie van deze unieke antilichamen van hoge-affiniteit met enkel molecuul matrix technologie ingeschakeld de directe kwantificering van IFN-α bij concentraties van attomolar (fg/mL). Dergelijke ultrasensitive IFN-α eiwit detectie zal bijdragen tot een beter begrip van de aard, de verordening en de biologische gevolgen van de reactie van IFN-geïnduceerde in andere ziekte instellingen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. selectie van antilichamen

  1. Voordat u begint met het protocol bekijkt alle belangrijke stappen (tabel 1) en selecteer optimale antilichamen.
    Opmerking: Voor dit protocol hoge affiniteit anti-IFN-α antilichamen - de IC50 voor die zijn beschreven in tabel 2 werden geselecteerd. Bij voorkeur, kies een paar die goed met conventionele ELISA werkt.

2. de vervoeging van Capture antilichaam aan paramagnetisch kralen en het testen van verschillende concentraties

Opmerking: Houd altijd kraal vervoeging Buffer (BCB) en kraal Wash Buffer (BWB) op het ijs tijdens het geconjugeerde antilichaam.

  1. Vastleggen van antilichaam Buffer Exchange
    1. Neem eerste hoeveelheid anti-IFN-α antilichaam A tot en met 3 verschillende kraal vervoegingen ratio's (0.038 mg/mL, 0.075 mg/mL en 0,3 mg/mL) testen.
      Opmerking: Lage antilichaam coating concentraties kunnen zinvol zijn als de bepaling een hoge achtergrond signaal presenteert. Eerste antilichaam hoeveelheid dient te verwerken voor een geschatte 30% verlies tijdens het uitwisselingsproces buffer. Volgens de instructies van de fabrikant en ter vermindering van de oorspronkelijke achtergrond werden concentraties van 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL en 0,3 mg/mL getest, hoewel deze precieze waarden vaak niet als gevolg van de bovengenoemde variabele verlies in de buffer verkregen zijn uitwisselingsproces.
    2. Voeg de vereiste omvang van het antilichaam in een kolom van het filter samen met BCB, maximaal 500 µL.
    3. Centrifugeer de kolommen op > 10.000 x g voor 5 min en negeren de doorstroming.
    4. Was de kolom twee keer door het toevoegen van een totaal volume van 450 µL van BCB gevolgd door centrifugeren op > 10.000 x g gedurende 5 minuten en negeren de stroom door.
    5. Plaats van de kolom van de filter met het antilichaam in een schone microcentrifuge buis ondersteboven - het open gedeelte van de kolom geconfronteerd met de binnenkant van de nieuwe buis - en centrifugeer bij 800 x g voor 1 min.
      Opmerking: Deze stap zal toestaan collectie van het gezuiverde antilichaam. Geen buffer toevoeging is vereist voor deze stap.
    6. De membranen met 50 µL BCB en centrifuge wassen bij 800 x g gedurende 1 min zoals 2.1.5.
    7. De concentratie van antilichaam met een laag volume spectrofotometer meten.
    8. BCB voor het bereiken van de gewenste antilichaam-concentratie en het eindvolume opmerking toevoegen.
      Opmerking: Een volume van 200 µL zal worden gebruikt voor het beschrijven van de rest van het protocol, dit volume wordt aangeduid als 2 delen (2V). Alle volgende reagens volumes zal dienovereenkomstig worden aangepast.
    9. Vortex en houd op ijs.
  2. Paramagnetisch kraal voorbereiding
    1. Overdracht 2.8 x 108 kralen (100 µL = 1V) in een microfuge buis.
      Opmerking: Het volume van kralen is afhankelijk van het eindvolume verkregen in 2.1.8.
    2. Pulse spin en zet in een magnetische scheidingsteken voor 1 min, verdunningsmiddel negeren en verwijderen van magneet.
    3. Toevoegen van 2V van BWB en vortex voor 5 s.
    4. 2.2.2 en 2.2.3 tweemaal met BWB en nog tweemaal met BCB herhalen
    5. Voor 1V van parels 190 µL BCB, vortex 5 s, pols draai worden toegevoegd en opslaan van de gewassen kralen op ijs.
  3. Activering van de kraal
    1. Voeg 1 mL koude BCB naar een 10-mg Injectieflacon van 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) en vortex totdat de oplossing is een homogeen.
    2. Toevoegen voor 1V van parels 10 µL van koude verdunde EDC gewassen kralen vortex, en houden in een shaker bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: EDC voorbereiding en aanvulling op de kralen zo spoedig mogelijk toe te schrijven aan EDC instabiliteit in waterige oplossingen moeten gebeuren. Ook, zoals EDC zeer reactief is, is het belangrijk dat de schorsing van een homogene kraal vóór toevoeging van de EDC om te voorkomen dat heterogene kraal activering. Na toevoeging van de EDC, kralen moet in suspensie.
  4. Kraal vervoeging van het antilichaam
    1. Vortex en pols draaien de geactiveerde kralen. Nu zetten de kralen in een magnetische scheidingsteken voor 1 min BCB supernatant negeren en verwijderen van de buis van de magneet.
    2. De kralen met 2V van BCB wassen. Vortex, pulse spin, en zet in de magnetische scheidingsteken voor 1 min. Vervolgens negeren de BCB-buffer en verwijder de kralen van de magneet.
    3. Snel toevoegen de koude, buffer-uitgewisseld 200 µL (2V) van de antilichaam aan de geactiveerde kralen.
    4. Vortex en houd gedurende 2 uur in het roteerapparaat bij kamertemperatuur.
  5. Kraal blokkeren en laatste Clean-up
    1. Pols draai de antilichaam-gecoate kralen schorsing, zet in de magnetische scheidingsteken voor 1 min, het supernatant overbrengen naar een nieuwe buis, en meten van de concentratie met een laag volume spectrofotometer.
      Opmerking: Deze stap zal informatie verschaffen over de vraag of de kralen zijn verzadigd - waarden boven nul aangegeven kraal verzadiging - oplosbare antilichaam kunnen binden aan de kralen zal worden gemeten.
    2. Verwijder de geconjugeerd parels uit de magneet, voeg 2V van BWB, vortex voor 5 s, pulse spin en zet in de magnetische scheidingsteken voor 1 min.
    3. Het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en meten van de concentratie met een laag volume spectrofotometer.
      Opmerking: Deze stap zal informatie verstrekken over of de antilichamen stabiel tot de kralen zijn vastgelegd. Detecteerbare antilichamen concentratie in deze supernatant geeft detachement van het antilichaam van de kralen, dat regelmatig gebeurt. Deze test werkt vaak zelfs als zeer kleine hoeveelheden van vangen antilichaam aan de kralen bevestigd blijven.
    4. Verwijder de geconjugeerd parels uit de magneet, voeg 2V van BWB, vortex voor 5 s, pulse spin en zet in de magnetische scheidingsteken voor 1 min.
    5. Geconjugeerd kralen uit de magneet verwijderen, toevoegen van 2V van Parel blokkeert Buffer, vortex voor 5 s, en broeden in de shaker gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Wash de antilichaam-gecoat en geblokkeerde kralen 3 x met 2V, eenmaal met BWS, en 2 x met kraal verdunningsmiddel Buffer (het negeren van alle supernatant).
    7. De gecoate en geblokkeerde kralen bij 4° C bewaren tot gebruik met 2V van kraal verdunningsmiddel Buffer.
      Opmerking: Net voor gebruik, kralen moeten worden gewassen eenmaal met Detector/Sample verdunningsmiddel met behulp van een volume van 250 x kraal volume/20, met behulp van de magnetische scheidingsteken.

3. opsporing antilichaam Biotinylation

  1. Detectie antilichaam Buffer Exchange
    1. Neem de twee anti-IFN-α Ab klonen 260 µg.
      Opmerking: Dit houdt rekening met een verlies van 30% tijdens buffer uitwisseling en laat testen van twee verschillende Biotine/antilichaam-ratio's.
    2. Ga verder als 2.1 met behulp van Biotinylation reactie Buffer (BRB) in plaats van BCB.
    3. Meet het volume en de antilichaam-concentraties en het volume te verkrijgen van een eindconcentratie van 1 mg/mL.
      Nota: Dit is een voorgestelde beginconcentratie, maar het kan worden geoptimaliseerd als de bepaling de vereiste gevoeligheid niet bereikt.
  2. Detectie antilichaam Biotinylation
    1. Breng de N-hydroxysuccinimide-polyethyleen-glycol4-Biotine (NHS-PEG4-Biotine) op kamertemperatuur en resuspendeer met in totaal 400 µL van gedistilleerd water om de concentratie van een 3.4 mM.
    2. De verhouding van de biotine: antilichaam om te testen en meng detectieantilichaam en verdunde Biotine dienovereenkomstig beslissen (60:1 verhouding is gelijk aan 100 µL van detectieantilichaam en 4.5 µL van Biotine).
      Opmerking: Om te beginnen, test ratio van 30: 1 uit en 60:1 's.
    3. Vortex de antilichaam-Biotine mix, pulse spin en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: U hoeft te schudden.
  3. Biotinyleerd detectie antilichaam zuivering
    1. Het antilichaam biotinyleerd overbrengen in een nieuw filter en ga verder als 2.1, 3 wassen stappen met BRB (400, 450 en 450 µL) en een laatste collectie.
    2. Meet het volume en de concentratie van de gezuiverde, biotinyleerd detectieantilichaam en winkel bij 4 ° C tot gebruik.

4. assay optimalisatie

Opmerking: Gebruik van de enkel molecuul matrix analyzer software in een Homebrew configuratie30.
De enkel molecuul matrix analyzer machine wordt bestuurd door software die het mogelijk maakt om uit te voeren test standardizations, voor het uitvoeren van de steekproef ondermeer, als u wilt externe parameters wijzigen (bead, detector, SBG, RGP concentraties; monster verdunningen...) en interne parameters (aantal stappen, incubatie tijden...) om de optimale assay voorwaarden, en kan ook worden gebruikt voor het berekenen van resultaten (achtergrond, LOD, hoeveelheden). Zie de aanwijzingen van de fabrikant voor de configuratie van de Analysator van de matrix één molecuul en voor het berekenen van de volumes van de reagens nodig voor elke ronde van optimalisatie. De eerste rondes van optimalisering met een 2-stap configuratie uitvoeren

  1. Combinaties van capture antilichaam-geconjugeerde kralen en biotinyleerd detectieantilichaam in beide configuraties testen.
    1. Combinaties van de drie verschillende anti-IFN-α A testen antilichaam concentraties met de twee verschillende anti-IFN-α B biotinylation ratio's vastleggen als detectie en opname antilichamen, en vice versa (Figuur 1) door de selectie van de juiste voorwaarden in de analyzer software.
    2. Kies de meest gevoelige combinatie, dat wil zeggen, de voorwaarden die de laagste LOD, aanbieden en gebruiken voor verdere stappen
      Let op: Afbeelding 1 ziet u hoe een 0.3 mg/mL anti-IFN-α een antilichaam kraal concentratie en een biotine: antilichaam-ratio van 30: 1 uit met het anti-IFN-α B antilichaam resulteerde in de hoogste gevoeligheid, zoals blijkt uit een LOD 11.6 fg/ml. (Zie aanvullende tabel 1). Deze combinatie zal worden gebruikt voor alle toekomstige stappen. Merk op dat de grote gevoeligheid met dit bijzondere test voordat alle rondes van optimalisatie bereikt.

figure-protocol-1
Figuur 1: selectie van antilichaam oriëntatie, capture antilichaam concentratie op kralen en biotinylation verhouding. De twee verschillende mogelijke configuraties werden getest, met behulp van de anti-IFN-α-A als vangen antilichaam en anti-IFN-α B als detectie antilichaam (A), en vice versa (B). IFNα - 2c werd gebruikt als antigeen. Verschillende vangen antilichaam concentraties evenals biotine: antilichaam (B:A) ratio's werden ook voor beide configuraties getest. Gestippelde lijn toont LOD voor de beste conditie; anti-IFN-α een 0.3 mg/mL als vastleggen en anti-IFN-α B biotine: detector antilichaam verhouding van 30 (LOD = 11,6 mg/mL overeenkomt met een waarde van het AEB van 0.017265). Een 2-step-configuratie werd gebruikt. Biotine: antilichaam (B:A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Vergelijk een 2 vs. 3-stap configuratie.
    Opmerking: In een 3-stap configuratie, er zijn drie verschillende incubatie stappen, een met het antilichaam vastleggen, één met de detectieantilichaam en een uiteindelijke derde voor de SBG enzym labeling. Echter, in een 2-stap configuratie, vastleggen en detectie antilichamen worden geïncubeerd gelijktijdig met de analyt van belang.
    1. Enkel molecuul matrix analyzer uitvoeren met de opvang en de detector antilichaam concentratie en de ratio's van selecteren van de configuratie van de 2- en 3-staps vooraf geconfigureerd in de analyser, volgende fabrikant instructies304.1.2.
    2. Kies de configuratie die voorziet in de hoogste gevoeligheid en houd het voor toekomstige stappen
      Opmerking: Zoals blijkt uit Figuur 2 en aanvullende tabel 2, de 2-stap configuratie gaf iets hogere gevoeligheid en signaal/achtergrond verhouding voor elke geteste concentratie. Daarom bleef het 2-stap configuratie voor toekomstige stappen.

figure-protocol-2
Figuur 2:2 vs 3-stap configuratie vergelijking. De 2- en 3-staps configuraties werden geschat aan de hand van 0,3 mg/mL anti-IFN-α een antilichaam vastleggen als anti-IFN-α B als detectieantilichaam in de verhouding 30 biotine: antilichaam. IFNα - 2c werd gebruikt als antigeen. In de omgeving van een 3-stap voorwaarde zijn er drie verschillende incubatie stappen, een met het antilichaam vastleggen, één met de detectieantilichaam en een uiteindelijke derde voor de SBG enzym etikettering. Echter, in een 2-stap configuratie, vastleggen en detectie antilichamen worden geïncubeerd gelijktijdig met de analyt van belang. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Detector antilichaam en SBG concentratie optimalisatie
    1. Drie verschillende testconcentraties van detector antilichaam (0.1, 0.3 en 0.6 µg/mL) samen met drie verschillende concentraties van SBG (50, 150 en 250 uur) als beschreven boven30.
    2. Kies de concentraties die geeft de hoogste gevoeligheid en houd ze voor toekomstige stappen.
      Opmerking: Figuur 3 toont dat detector 0,3 µg/mL en SBG 150 uur waren de omstandigheden die de optimale LOD toonde. Deze voorwaarden gaf ook lage achtergrondniveaus en middellange amplitude, een gedrag dat goede standaarddeviatie (SD) waarden (aanvullende tabel 3 produceert). Typische concentraties variëren tussen 0,1 - 1 µg/mL voor de detectieantilichaam en 50-200 pM voor SBG, hoewel hogere concentraties (bijvoorbeeld tot 300 uur) van de laatste nodig zouden kunnen zijn. Het is belangrijk om te voorkomen dat voorwaarden dat achtergronden hoger dan 0,02 AEB weergeeft. Verhoging van de concentratie van de detector monoklonaal antilichaam (mAb) of SBG zal verbeteren zowel signaal respons en achtergrond. Als echter de toename in signaal overwint de verandering in de achtergrond, de LOD zal verbeteren. Een situatie kan ontstaan waarin een afname van de achtergrond beter discriminatie tussen lage kalibratoren kunt.

figure-protocol-3
Figuur 3: Detector en SBG concentratie optimalisatie. Drie verschillende concentraties van biotinyleerd detector antilichaam (0.1, 0.3 en 0.6 µg/ml) samen met drie verschillende concentraties van SBG (50, 150 en 250 uur) werden beoordeeld. Gestippelde lijn toont LOD voor de beste conditie; detector antilichaam op 0,3 mg/mL en SBG 150 pM (LOD = 0.09 mg/mL overeenkomt met een waarde van het AEB van 0.017184). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. Aanvullende optimalisatie stappen
    1. Als de vereiste gevoeligheid niet bereikt is, test verschillende incubatie tijden voor de verschillende stappen, met behulp van de vooraf geconfigureerde opties in de analyzer software.
    2. Als de test niet genoeg gevoeligheid is, optimaliseert het aantal kralen per bepaling met behulp van de vooraf geconfigureerde opties in de analyzer software.
      Opmerking: Zodra het testen van biologische monsters begint, monstervolume is een extra parameter die vatbaar zijn voor optimalisatie. Zorg ervoor dat de monsters worden verwerkt volgens de procedures van gezondheid en veiligheid.

5. assay specificiteit en reproduceerbaarheid

  1. IFN-α assay specificiteit, test door het testen van de test met verschillende subtypen van IFN-α en andere verwante proteïnen (figuur 4a en 4b).

figure-protocol-4
Figuur 4: specificiteit en de gevoeligheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. (A) IFN-β, IFN-λ1 IFN-λ2, IFN-ω en IFN-γ recombinante eiwitten werden getest, samen met (B) 16 subtypen van IFN-α, waaronder drie IFN-alpha2-typen (IFN-α2a, IFN-α2b en IFN-α2c). Aangepast van Rodero et al. 2017. de Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

  1. De reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde assay beoordelen door drie onafhankelijke repliceren experimenten uitvoeren en beoordelen van Inter assay variabiliteit (Figuur 5).
  2. Berekenen van de LOD voor de bepaling
    Opmerking: De LOD was berekend op basis van het gemiddelde van de drie blanco + 3 standaarddeviaties (SD), aldus het verkrijgen van een waarde van 0,23 fg/mL. Zoals de verdunningsfactor standaardmonster 1:3 is, geeft de opneming van de verdunningsfactor een LOD 0,69 fg/ml.

figure-protocol-5
Figuur 5: reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde pan-IFN-α enkel molecuul matrix assay. Onafhankelijke driemaal werden uitgevoerd met behulp van twee verschillende partijen van parels. Voor de tweede partij, werden twee onafhankelijke experimenten uitgevoerd. Elke meting werd overgenomen in duplicaten. De stippellijn geeft de LOD, gedefinieerd door gemiddelde leeg gemiddelde enzym per kraal + SD van alle punten. IFN-α17 werd gebruikt als een verwijzing, rekening houdend met dat de afgeleide standaard curve vertegenwoordiger van alle andere IFN-α-subtypen, is zoals aangegeven in figuur 4b. Perceel toont gemiddelde waarde en SD (foutbalken). Stippellijnen Toon LOD voor de verschillende punten; Uitvoeren van 1: 0.073 fg/mL AEB = 0.006238, Run 2: 0.113 fg/mL AEB = 0.007119, lopen 3: 0,043 fg/mL AEB = 0.05518). Aangepast van Rodero et al. 2017. de Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

6. eiwit competitie Assay

  1. Een eiwit competitie assay (beschreven in Figuur 6 legenda) om aan te tonen verder de specificiteit van de test uitvoeren
    Opmerking: Plasma monsters van patiënten met SLE (n = 5) werden gebruikt.
    1. Als virussen worden verdacht moet aanwezig zijn in de biologische steekproef, bereiden inactivatie buffer door 200 µL van een niet-ioinic oppervlakteactieve stof (0,5% nonidet P40 vervanger) krachtig 40 mL verdunningsmiddel Detector/Sample en vortex toe te voegen.
    2. Centrifugeer biologische monsters met de analyt van belang bij 10.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C tot cellulaire puin te verwijderen.
    3. Mix 185 µL Detector/Sample verdunningsmiddel of inactivering buffer met 100 µL biologische steekproef (eindverdunning factor 3) en 15 µL anti-IFN-α antilichaam A (beginconcentratie 1 mg/mL, eindconcentratie van 50 mg/mL) of buffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Voorbeelden uitvoeren met en zonder anti-IFN-α antilichaam in de Analysator van één molecuul matrix, zoals hierboven beschreven.
      Opmerking: In geval van verzadiging van het signaal, monsters moeten worden verder verdund. Ook is 300 µL het volume dat is vereist voor dubbele analyse.

figure-protocol-6
Figuur 6: eiwit competitie assay. Competitie experimenten werden uitgevoerd met behulp van monsters van vijf verschillende SLE-patiënten. Biologische monsters werden gecentrifugeerd bij 10.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Ze waren verdund 1/3 met Detector/Sample verdunningsmiddel met NP40 voor virale inactivatie. 15µl van anti-IFN-α antilichaam A (beginconcentratie 1 mg/mL, eindconcentratie 50 µg/mL) of buffer werden toegevoegd aan een totaal volume van 300 µL. incubatie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur voor 30 min. controlegroep in het grijs weergegeven en monsters behandeld met anti-IFN-α A antilichaam worden weergegeven in het zwart. Grafiek toont de gemiddelde waarde en SD (foutbalken). Gestippelde lijn vertegenwoordigt LOD (AEB = 0.024774, 0.8037 fg/mL). Aangepast van Rodero et al. 2017 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kortom bekleed een pan-IFN-α enkel molecuul matrix assay met een limiet van detectie van 0,69 fg/mL, met behulp van een 2-stap configuratie met capture kralen met 0,3 mg/mL anti-IFN-α een biotinyleerd antilichaam en anti-IFN-α B detectie antilichaam in een verhouding van biotine: antilichaam van 30 werd ontwikkeld. De gebruikte voor biotinyleerd detectieantilichaam en SBG concentraties waren 0,3 µg/mL en 150 uur, respectievelijk. Deze zeer specifieke assay voor het opsporen van alle 13 IFN-α-subtypen van is en kruis niet reageert met andere soort IFNs. Dus, terwijl het is niet mogelijk om te identificeren en kwantificeren van elke afzonderlijke soort IFN-α, alle van hen kan worden gedetecteerd en gemeten geven samen een waarde van de totale concentratie voor IFN-α, die bestaat uit de 13 verschillende subklassen.

Verkennen van de potentiële diagnostische waarde van deze nieuw ontwikkelde assay, IFN-α eiwitten in plasma en serum van gezonde individuen werden gemeten en vergeleken met monsters van patiënten met SLE en JDM. Zoals geïllustreerd in Figuur 7, werden hoge niveaus van IFN-α proteïne ontdekt in beide cohorten van de ziekte in vergelijking met gezonde controles. De stippellijn geeft de LOD voor een conventionele verkrijgbare ELISA, ter illustratie van hoe deze aanpak zou niet detecteren IFN-α eiwit in deze patiëntengroepen ondanks de bekende verenigingen van deze cytokine met deze fenotypen. Bovendien, IFN-α kan worden gekwantificeerd over 5 logs van omvang, ter illustratie van het brede dynamische bereik van de bepaling, met detecteerbare niveaus tussen 1-10 fg/mL bevestiging van de gevoelige aard van de test.

figure-results-1
Figuur 7: kwantificering van IFN-α eiwitten in plasma en serum van patiënten cohorten. Dit cijfer is gewijzigd van Rodero et al. 2017. de plasma van gezonde controles (n = 20) en patiënten met SLE (n = 72) en JDM (n = 43) werden getest met de pan-IFNα enkel molecuul matrix assay. Analyse werd uitgevoerd met behulp van one-way ANOVA-test (Kruskal-Wallis) en Dunns meerdere vergelijking tussen groepen te testen. Mediaan wordt afgebeeld. Stippellijn geeft LOD voor een verwijzing menselijke anti-IFN-α ELISA (1.95 pg/mL = 1950 fg/mL). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

StapOverwegingenReferentie
1. antilichaam paar keuzeDoel verschillende epitopenTabel 2
Hoge affiniteit
Kop snel / traag Kaf
2. antilichaam paar oriëntatieKies voorwaarden met de laagste limiet van detectieFiguur 1
3. het vastleggen van antilichaam concentratie
4. biotine: Detector antilichaam verhouding
5. 2 vs. 3-stap configuratieKies voorwaarde met de hoogste verhouding van signaal: achtergrondFiguur 2
6. detector antilichaam concentratieKies voorwaarden met de laagste limiet van detectieFiguur 3
7. SBG concentratie
8. specificiteitKruisallergie beoordelenFiguur 4
9. gevoeligheidErkenning van subtypen beoordelen (indien van toepassing)
10. reproduceerbaarheidBeoordelen assay variabiliteitFiguur 5

Tabel 1: overzicht van stappen voor ontwikkeling en optimalisatie van een enkel molecuul matrix assay. Deze tabel bevat een overzicht van de verschillende stappen die nodig zijn voor de ontwikkeling en de optimalisatie van een enkel molecuul matrix assay, vanaf de eerste keuze van antilichaam paar tot de beoordeling van de reproduceerbaarheid.

Antigeen8H 1 (A)12H 5 (B)SifalimumabRontalizumab
IFNΑ128.351,346022.63
IFNΑ2256310,79.022.15
IFNΑ45.112.9935.35325.3
IFNΑ52.0119.693,292.49
IFNΑ664,73.034,97-
IFNΑ70.90.63233,1-
IFNΑ83020.8369110.86
IFNΑ102,540.7143.2-
IFNΑ1432242.114,520.9
IFNΑ161,8332.9959.1828.65
IFNΑ172.210.77890.923,86
IFNΑ212,7812.8717695.8

Tabel 2: Pan-alpha antilichaam selectie. IC50 (ng/mL) bepaald met behulp van de interferon-gestimuleerd respons-element (ISRE)-Luciferase neutralisatie assay. Tabel wordt IC50 waarden voor mAbs gebruikt in één molecuul matrix assay voor alle IFN-α subtypen. 10.000 HEK 293 MSR cellen waren geplaatst in witte helft-gebied 96-wells-platen en omgekeerde-transfected met 50 ng vooraf gemengd ISRE-Firefly luciferase verslaggever en Renilla luciferase constructies met behulp van transfectie reagentia volgens de instructies van de fabrikant. De constructie luciferase-uiten diende als een interne normalisatie-besturingselement. Cellen werden 's nachts geïncubeerd in verminderd Serum Medium aangevuld met niet-essentiële aminozuren van 0,1 mM, 1 mM natrium pyruvaat, 0,5% foetale runderserum bij 37 ° C, 5% CO2 in een bevochtigde sfeer. Na een incubatieperiode van overnachting, werden cellen gestimuleerd gedurende 24 uur met medium dat mengsels van recombinante menselijke IFN-α met of zonder anti-IFN-α mAbs of besturingselement IgG, die had zijn gepreïncubeerd gedurende 1 uur bij 37 ° C. Na 24u van stimulatie, werden dubbele luciferase verslaggever testen uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. «-» Niet bepaald. Sifalimumab is een volledig mens, immunoglobulin G1 κ monoklonaal antilichaam dat bindt en neutraliseert de meerderheid van IFN-α subtypen; Rontalizumab is een Latijnse monoclonal antilichaam tegen IFN-α. Aangepast van Meyer et al. 2016 en Rodero et al. 2017.

Aanvullende tabel 1: selectie van antilichaam oriëntatie, capture antilichaam concentratie op kralen en biotinylation verhouding. De twee verschillende mogelijke configuraties werden getest, met behulp van de anti-IFN-α-A als vangen antilichaam en anti-IFN-α B als detectie antilichaam (A), en vice versa (B). IFNα - 2c werd gebruikt als antigeen. Verschillende vangen antilichaam concentraties evenals biotine: antilichaam (B:A) ratio's werden ook voor beide configuraties getest. Verzadiging (Sat). Oranje: AEB waarden die werden gebruikt voor de berekening van de LOD; deze concentraties werden gezien als blanco als de waarden van de AEB bleef stabiel. LOD werd berekend als lege bedoel + 3SD. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Test van 2 vs 3-stap configuratie. De 2 en 3 - stap configuraties werden beoordeeld met behulp van IFNα - 2c als antigeen. AEB worden ook als signaal/achtergrond rantsoenen (S/B) waarden weergegeven voor beide voorwaarden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Detector en SBG concentratie optimalisatie. Drie verschillende concentraties van biotinyleerd detector antilichaam (0.1, 0.3 en 0.6 µg/mL) samen met drie verschillende concentraties van SBG (50, 150 en 250 uur) werden beoordeeld. AEB waarden weergegeven voor de negen geteste voorwaarden. Oranje: AEB waarden die werden gebruikt voor de berekening van de LOD; deze concentraties werden gezien als blanco als de waarden van de AEB bleef stabiel. LOD werd berekend als lege bedoel + 3SD. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 4: specificiteit en de gevoeligheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. Gemiddelde enzym per kralen waarden worden weergegeven wanneer IFN-β, IFN-λ1 IFN-λ2, IFN-ω en IFN-γ recombinante eiwitten werden getest (A), samen met de 16 subtypen van IFN-α (B). «-» Niet bepaald. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 5: reproduceerbaarheid van de geoptimaliseerde IFNα enkel molecuul matrix assay. De gemiddelde waarden van het AEB voor alle onafhankelijke driemaal zijn komen opdagen bij een concentratie van 10.000 fg/mL. «-» Niet bepaald. Verzadiging (Sat). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 6: eiwit competitie assay. Gemiddelde enzym per kralen waarden voor alle omstandigheden getest weergegeven worden. Metingen werden gedaan in tweevoud. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin, beschreven we de ontwikkeling en validatie van een zeer reproduceerbaar, ultrasensitive enkel molecuul matrix digitale ELISA voor directe kwantificering van IFN-α eiwit in menselijke specimens (stappen samengevat in tabel 1). Een van de belangrijkste stappen in de ontwikkeling van de bepaling is de keuze van antilichaam paar16, met de kenmerken in termen van kinetiek en epitoop bindende sleutel tot een succesvolle test. Het is belangrijk om te voorkomen dat het gebruik van gekoppelde monoclonal antilichamen die gericht het dezelfde epitoop of daardoor sterische belemmering. Polyclonal antilichamen kunnen worden gebruikt als detectie antilichamen te overwinnen dergelijke beperkingen. Als bij een bepaalde stap de gewenste gevoeligheid niet is bereikt, moeten verdere optimalisatie mogelijkheden worden overwogen. Hierbij kan het gebruik van alternatieve antilichaam paren, veranderingen in de parameters zoals eiwit type (bijvoorbeeld BSA < caseïne), pH (6.0-8,5), Ionische sterkte, buffercapaciteit (bijvoorbeeld NaCl en fosfaat concentraties), vervoerder kralen en/of aanwezigheid van oppervlakteactieve stoffen. Een groot aantal parameters worden con geoptimaliseerd bij het ontwikkelen van een enkel molecuul matrix assay. Echter over het algemeen voorwaarden die hoge signaal: achtergrond ratio's en minimale LODs geven zijn de voorkeur (Zie Figuur 1en Figuur 2 Figuur 3).

Met betrekking tot de specificiteit, de IFN-α-test toonde geen kruis reactiviteit voor elke andere IFNs getest (β, γ, λ1, λ2, ω) (figuur 4a) en was voor het opsporen van alle 13 IFN-α subtypen (figuur 4b) van. De test toonde echter een lagere affiniteit voor het subtype van IFN-alpha2, (figuur 4b en aanvullende tabel 4). Interessant is dat werden verschillende gevoeligheden voor de verschillende klassen van IFN-alpha2 (a, b, c) ook waargenomen, die veroorzaakt door verschillende productieprocessen of verschillende aminozuur sequenties worden kan, zoals de IFN-alpha2-subtypen zijn verkregen van verschillende commerciële leveranciers. Met deze uitzondering gaf alle soorten van de IFN-α zeer soortgelijke reacties. De specificiteit van de test werd verder aangetoond door de voorbehandeling van de monsters met de anti-IFN-α een kloon, die het signaal (Figuur 6 en aanvullende tabel 6) afgeschaft.

Een van de belangrijkste voordelen van deze technologie is dat elke analyt van belang gerichte16potentieel kan zijn. Bovendien kunnen verschillende biologische monsters worden getest, zoals serum, plasma, cerebrospinale vloeistof, cellulaire lysates, cultuur supernatant31 en zelfs adem32. Een verdunning 1:3 plasma wordt meestal uitgevoerd om te voorkomen dat potentiële verstopping van de Analysator van de matrix één molecuul. Echter de analyt van belang aanwezig kon zijn bij zeer lage concentraties in de relevante biologische steekproef en hogere concentraties van monster wellicht vereist (afhankelijk van de gevoeligheid van de test)33. Hoewel er potentieel is voor multiplexing met behoud van goede vingergevoeligheid34, is het een meer uitdagende proces en testen voor het meten van meer dan 6 eiwitten binnen de dezelfde experimenten hebben nog worden ontwikkeld35.

De mogelijkheid om te detecteren en kwantificeren van cytokines en andere biologische relevante eiwitten bij dergelijke lage concentraties opent een hele nieuwe reeks van toepassingen33,36. Het is algemeen bekend dat talrijke proteïnen oefenen hun effecten zelfs bij zeer lage concentraties, die tot nu toe onder de limiet van de opsporing van de beste ELISAs-37 waren. Terwijl andere immunoassay technologieën voordelen ten opzichte van conventionele ELISA19 bieden, wij laten zien hier dat enkel molecuul matrix digitale ELISA een reproduceerbare en robuust platform voor de ultrasensitive detectie van lage concentratie cytokines in menselijke specimens. Als zodanig is deze technologie biedt enorme mogelijkheden voor de ontdekking van biomarker en verbeterde patiëntenbeheer van een breed scala van ziekten.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DD en YJC erkentelijk voor steun van de ANR (Project IFNX, geen. CE17001002) en ImmunoQure AG voor het verstrekken van monoklonale antilichamen. Wij danken Brigitte Bader-Meunier, Nathalia Bellon, Christine Bodemer, Alex Belot, Isabelle Melki en Pierre Quartier voor het verstrekken van klinische monsters. YJC erkent de Europese Onderzoeksraad (GA 309449: Fellowship aan YJC), en een overheidssubsidie beheerd door de National Research Agency (Frankrijk) onder de "Investeringen voor de toekomst" programma, rekening houdend met de verwijzing ANR-10-IAHU-01.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone)ImmunoQure AGNANot commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone)ImmunoQure AGNANot commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 cloneeBioscienceBMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK cloneeBioscienceBMS216BKNot an ELISA kit but bulk abs
IFN α2ceBioscienceBMS305OK
IFN αI (17)PBL11150-1
IFN α2aPBL11100-1
IFN α2aPeproTechNo longer available
IFN α2bPBL11105-1
IFN α1PBL11175-1
IFN α4a (M1)PBL11177-1
IFN α4b (a4)PBL11180-1
IFN αB2 (a8)PBL11115-1
IFN αC (a10)PBL11120-1
IFN αD (a1)PBL11125-1
IFN αG (a5)PBL11135-1
IFN αF (a21)PBL11130-1
IFN αH2 (a14)PBL11145-1
IFN αJ1 (a7)PBL11160-1
IFN αK (a6)PBL11165-1
IFN αWA (a16)PBL11190-1
IFN λ1PeproTech300-02L
IFN λ2PeproTech300-02K
IFN ωPeproTech300-02J
IFN βPeproTech300-02BC
IFN γPeproTech300-02
Anti-IFN-α ELISAPBL41115.1
96-well platesCorning3904
ISRE-ReporterQiagenCCS-008L
Fu-GENE HD Transfection ReagentPromegaE2311
Opti-MEM Reduced Serum MediuemThermoFischer Scientific31985062
Dual-Luciferase Reporter assayPromegaE1910
Nonidet P40 SubstituteSigma-Aldrich74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000Thermo ScientificNo longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtresMerck MilliporeUFC505096
Bead Conjugation BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic BeadsQuanterix101360
Bead Wash BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
EDCFisher Scientific11844071
Bead Blocking BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
Bead Diluent BufferQuanterix101362
Detector and Sample DiluentQuanterix101359
Biotinylation Reaction BufferQuanterix102040Can not be ordered separately
NHS-PEG4-BiotinFisher Scientific11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge)Thermo Scientific75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker)IKAMS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl)Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl)Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubesEppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2)ThermoFisher Scientific12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar)VWR521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort)Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode LabelsQuanterix101652
15 mL Reagent BottlesQuanterix102411
Simoa specimen 96-well platesQuanterix101457
Simoa DiscsQuanterix100001
Simoa 2.0 conductive TipsQuanterix101726
Simoa CuvettesQuanterix100803
Simoa SBG ReagentQuanterix102295
Simoa RGP ReagentQuanterix101736
Simoa System Buffer 1Quanterix100486
Simoa System Buffer 2Quanterix100487
Sealing OilQuanterix100206
ddH2O
Simoa HD-1 AnalyzerQuanterix100032
Technologies
Single molecule array (Simoa)Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay SystemsSingluex

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).">Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).">Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).">Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).">Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).">Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).">Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).">Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).">Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).">Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).">Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).">Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).">Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).">Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858(2011).">Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858(2011).
  15. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).">Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).">Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).">Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. , Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).">Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).">Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).">Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236(2015).">Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236(2015).
  22. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).">Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).">Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).">Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).">Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296(2017).">Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296(2017).
  27. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).">Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).">Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137(2017).
  29. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).">Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. , Quanterix corporation. (2017).
  31. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).">Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108(2015).">Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108(2015).
  33. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).">Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).">Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).">Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).">Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).">Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ArrayDigital ELISAInterferon Alpha DetectionAntibody ConjugationParamagnetic BeadsAssay OptimizationLimit Of DetectionSpecificity ValidationReproducibility AssessmentCytokine Quantification

Related Articles