Identificatie van dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verduidelijking van de D1-receptor dysfunctie tijdens een ziekte van het centrale zenuwstelsel. Wij uitgevoerd een roman RNA in situ hybridisatie assay om te visualiseren single molecules van RNA in een specifieke hersenen gebied.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In het centrale zenuwstelsel is de receptor subtype D1-alpha (Drd1α) de meest voorkomende dopamine (DA) receptor, die een essentiële rol speelt bij het reguleren van de neuronale groei en ontwikkeling. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de Drd1α receptor afwijkingen bemiddelen gedrags reacties en modulerende werking geheugenfunctie zijn echter nog onduidelijk. Met behulp van een roman RNA in situ hybridisatie assay, de huidige studie is gebleken dat dopamine Drd1α receptor en tyrosine hydroxylase (TH) RNA-expressie aan vanaf DA-gerelateerde circuits in de nucleus accumbens (NAc) gebied en de substantia nigra regio (SNR), respectievelijk. Drd1α expressie in de nar toont een "discrete stip" kleuring patroon. Duidelijk seks verschillen in Drd1α expressie werden waargenomen. In tegenstelling, bevat TH een "geclusterde" kleuring patroon. Met betrekking tot TH expressie, maar dan weergegeven vrouwelijke ratten een hogere signaal-expressie per cel ten opzichte van mannelijke dieren. De hier gepresenteerde methoden bieden een roman in situ hybridisatie techniek voor het onderzoeken van veranderingen in dopamine systeem dysfunctie tijdens de progressie van ziekten van het centrale zenuwstelsel.
Inleiding
Dysfunctie van het systeem van striatale dopamine is betrokken bij de progressie van klinische symptomen waargenomen in meerdere Neurocognitieve ziekten. Dopamine D1 receptoren zijn aanwezig in de prefrontale cortex (PFC) en striatale gebieden van de hersenen en sterk beïnvloeden van cognitieve processen1, waaronder het werken geheugen, temporal processing en locomotief gedrag2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. vorige studies toegelicht dat wijzigingen van dopamin....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het experimentele protocol goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van South Carolina (federale assurance nummer: A3049-01).
1. bereiding van verse, bevroren hersenen secties
- Gebruik de F344/N rat stam: drie ratten van elk geslacht, 13 maanden van leeftijd, lichaamsgewicht ongeveer 320 g.
- Pas de Sevofluraan tot 5% (overdosis Sevofluraan). Sevofluraan blootstelling na ademhaling stopt voor een extra minuten voortgezet.
- Decapitate de rat en het verwijderen van de hersenen.
- Onderdompelen van de rat hersenen in vloeibare stikstof voor 15 s binnen 5 min van weefsel oog....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De huidige studie waargenomen een 'discrete dots' kleuring patroon voor RNA expressie in de dopamine D1-alpha receptoren (Drd1α) van de nar in F344/N ratten (figuur 1A). Individuele fluorescentie signalen werden gemakkelijk geïdentificeerd en kunnen worden gezien als één 'dots', die elk vertegenwoordigt een enkele RNA transcriptie binnen de cel. Voor afbeeldingen van de nar die de 'discrete dots weergeven' kleuring van de patroon, beoordeeld wij het dynamisch.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol beschrijven we een nieuwe techniek van in situ hybridisatie voor hersenen vers bevroren plakjes Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR)-regio te evalueren. We bieden ook methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: "discrete stip" of "clusters".
De kritische stappen voor een succesvolle multiplex fluorescentie RNA in situ hybridisatie assay zijn opgenomen. Zodra het onthoo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
De huidige werken werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies, HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624. Gedeeltelijke Fonds werd verstrekt door een subsidie van de opleiding NIH T32 in biomedische-Behavioral science.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| HybEZ Oven systeem | Advanced Cell Diagnostics | 310010 | |
| RNAscope Probe - Rn-Drd1a | Advanced Cell Diagnostics | 317031 | Kleurkanaal 1, Groen |
| RNAscope Probe - Rn-Th-C2 | Advanced Cell Diagnostics | 314651-C2 | Kleurkanaal 2, Oranje |
| RNAscope Fluorescent Multiplex Reagens Kit | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | |
| ImmEdge Hydrofobe Barrière Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Sevofluraan | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Tissue-Tek vertical 24 schuiflade | Fisher Scientific | NC9837976 | |
| Tissue-Tek kleedschotel | Fisher Scientific | NC0731403 | |
| Precision Algemeen Gebruik Baths | ThermoFisher Scientific | TSGP28 | |
| Pretreatment 4 | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | onderdelen van kits |
| ProLong Gold anti-fade reagens | Life Technologies | P36930 | |
| Amp 1-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | onderdelen van kits |
| Amp 2-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | onderdelen van kits |
| Amp 3-FL | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | onderdelen van kits |
| Amp 4-FL-Alt A | Advanced Cell Diagnostics | 320850 | onderdelen van kits |
| EZ-C1 softwarepakket | Nikon Instruments | versie 3.81b | |
| SAS/STAT Software | SAS Institute, Inc., | versie 9.4 |
Referenties
- Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
