Methodenartikel

Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing

DOI:

10.3791/57444

⸱

27 maart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificatie van dopamine D1-alpha receptor in de nucleus accumbens is van cruciaal belang voor de verduidelijking van de D1-receptor dysfunctie tijdens een ziekte van het centrale zenuwstelsel. Wij uitgevoerd een roman RNA in situ hybridisatie assay om te visualiseren single molecules van RNA in een specifieke hersenen gebied.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het centrale zenuwstelsel is de receptor subtype D1-alpha (Drd1α) de meest voorkomende dopamine (DA) receptor, die een essentiële rol speelt bij het reguleren van de neuronale groei en ontwikkeling. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de Drd1α receptor afwijkingen bemiddelen gedrags reacties en modulerende werking geheugenfunctie zijn echter nog onduidelijk. Met behulp van een roman RNA in situ hybridisatie assay, de huidige studie is gebleken dat dopamine Drd1α receptor en tyrosine hydroxylase (TH) RNA-expressie aan vanaf DA-gerelateerde circuits in de nucleus accumbens (NAc) gebied en de substantia nigra regio (SNR), respectievelijk. Drd1α expressie in de nar toont een "discrete stip" kleuring patroon. Duidelijk seks verschillen in Drd1α expressie werden waargenomen. In tegenstelling, bevat TH een "geclusterde" kleuring patroon. Met betrekking tot TH expressie, maar dan weergegeven vrouwelijke ratten een hogere signaal-expressie per cel ten opzichte van mannelijke dieren. De hier gepresenteerde methoden bieden een roman in situ hybridisatie techniek voor het onderzoeken van veranderingen in dopamine systeem dysfunctie tijdens de progressie van ziekten van het centrale zenuwstelsel.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dysfunctie van het systeem van striatale dopamine is betrokken bij de progressie van klinische symptomen waargenomen in meerdere Neurocognitieve ziekten. Dopamine D1 receptoren zijn aanwezig in de prefrontale cortex (PFC) en striatale gebieden van de hersenen en sterk beïnvloeden van cognitieve processen1, waaronder het werken geheugen, temporal processing en locomotief gedrag2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. vorige studies toegelicht dat wijzigingen van dopamine D1 receptoren geassocieerd met de progressie van aandacht tekort-hyperactivity disorder (ADHD)8, de neurocognitieve symptomen bij schizofrenie9, werden 10 en stress gevoeligheid11. In het bijzonder bij schizofrenie, positron emissie tomografie (PET) onderzoeken aangegeven dat het bindend vermogen van dopamine D1 receptoren in de prefrontale cortices was sterk gerelateerd aan cognitieve tekorten en de aanwezigheid van negatieve symptomen11. De dendritische groei van de excitatory neuronen in de prefrontale cortex, gereguleerd door de dopamine D1-receptor vermindert stress gevoeligheid. Bovendien zou het knockdown van D1 receptor in mediale prefrontale corticale (mPFC) neuronen vergroten de sociale nederlaag sociale vermijden stress-geïnduceerde12.

Hier introduceren wij een nieuwe techniek voor RNA in situ hybridisatie te visualiseren van afzonderlijke RNA-moleculen in een cel met vers bevroren weefselmonsters. De huidige techniek heeft meerdere voordelen ten opzichte van de methoden die bestaan binnen de huidige literatuur. Ten eerste, de huidige procedure behoudt de ruimtelijke en morfologische context van het weefsel en werd uitgevoerd op vers bevroren weefselsteekproeven zodat andere procedures vereisen verse, niet-embedded weefsels kunnen worden gecombineerd met de huidige methoden. Soortgelijke procedures in formaline-vaste en paraffine-ingebedde weefsels hebben geïllustreerd dat één transcriptie resolutie kan worden bereikt gebruikend een RNA in situ hybridisatie techniek13. Opsporing van RNA op het niveau van één transcriptie biedt superieure gevoeligheid voor laag kopie numerieke uitdrukking, evenals de mogelijkheid om te vergelijken van genexpressie op het niveau van afzonderlijke cellen die niet kan worden bereikt door andere methoden voor de detectie van nucleic zuur, zoals polymerase kettingreactie (PCR) technieken. Daarnaast onderhoudt de huidige methode beelden met een hoge signaal-/ ruisverhouding via zeer specifieke sondes van RNA die gekruist doel RNA uitgeschreven, en achter elkaar gebonden met een cascade van versterking signaalmoleculen in de opsporing systeem. Tot slot, de huidige technologie biedt de mogelijkheid te evalueren meerdere biologische systemen met haar doelgroepen gerichte merkgebonden sondes, in plaats van het beperken van ons onderzoek naar slechts één klasse van systeem-gerelateerde gegevensmarkeringen bijvoorbeeld eiwit detectie door Immunohistochemistry methoden.

In onze studie gebruikten we deze roman RNA in situ hybridisatie te evalueren van de Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR) voor zowel mannelijke als vrouwelijke F344/N rats. De innovatieve RNA in situ hybridisatie konden we mechanismen beïnvloeden zowel opname van de DA en DA release gelijktijdig, verbetering van ons inzicht in de complexiteit van het systeem van striatale DA onderzoeken. Hier beschrijven we de procedure voor hersenen vers bevroren plakjes en voorzien in methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: "discrete stip" of "clusters".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het experimentele protocol goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van South Carolina (federale assurance nummer: A3049-01).

1. bereiding van verse, bevroren hersenen secties

  1. Gebruik de F344/N rat stam: drie ratten van elk geslacht, 13 maanden van leeftijd, lichaamsgewicht ongeveer 320 g.
  2. Pas de Sevofluraan tot 5% (overdosis Sevofluraan). Sevofluraan blootstelling na ademhaling stopt voor een extra minuten voortgezet.
  3. Decapitate de rat en het verwijderen van de hersenen.
  4. Onderdompelen van de rat hersenen in vloeibare stikstof voor 15 s binnen 5 min van weefsel oogst.
  5. Equilibreer de hersenen tot-20 ° C in een cryostaat gedurende 1 uur.
  6. Gesneden 30 µm secties af en breng in dia's (Zie Tabel van materialen).
  7. Kies de gedeelten van de nucleus accumbens regio, ongeveer 2.76 mm tot 2,28 mm anterior to Bregma14.
  8. Snijd de rat hersenen van de bulbus olfactorius voortdurend via de nucleus accumbens regio volgens de hersenstructuur van de stereotaxic van de van de rat.
  9. Monsters op de dia's te koppelen. Houd de secties bij-20 ° C gedurende 10 minuten te drogen.
  10. Onmiddellijk het onderdompelen van dia's in de vooraf gekoeld 4% paraformaldehyde gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  11. Plaats van de dia's in een toenemende ethanol verloop bij kamertemperatuur (RT): 50% EtOH gedurende 5 minuten; 70% EtOH gedurende 5 minuten; en 100% EtOH gedurende 5 minuten.
  12. Herhalen met vers 100% EtOH.
  13. Plaatsen van dia's op absorberend papier, en droge lucht.
  14. Tekenen van een barrière rond elke sectie met een barrière-pen (Zie Tabel van materialen). Laat de barrière droog volledig voor 1 min.

2. voorbehandeling van hersenen secties

  1. Zet de oven en selecteer de temperatuur tot 40 ° C.
  2. Voeg 3 druppels (90 µL) voorbehandeling 4 reagens (Zie Tabel van materialen) op elke sectie van de hersenen (één sectie per dia).
  3. Incubeer de secties voor 30 min op RT.
  4. Het onderdompelen van de dia's in 1 x PBS voor 1 min op RT. herhalen met vers 1 x PBS.
    Opmerking: Dia's moeten niet blijven in 1 x PBS langer dan 15 min.

3. RNA In Situ hybridisatie fluorescerende Multiplex Assay

  1. Warm de sonde van de doelgroep voor 10 min bij 40 ° C in een waterbad, en vervolgens afkoelen tot RT.
  2. Plaats van het RNA-reagens (bijvoorbeeld Amp 1-4 FL) op RT.
  3. Verwijderen van overtollige vocht uit dia's met absorberend papier en plaats terug op het dia-rek (Zie Tabel van materialen).
  4. Voeg 3 druppels (90 µL) van de Drd1α sonde (C1) op het monster segment. Incubeer gedurende 2 h bij 40 ° C.
  5. Dia's in 1 x wassen buffer dompelen gedurende 2 minuten bij RT. herhalen met vers 1 x wassen buffer.
  6. Verwijderen van de overtollige vocht uit de dia's met absorberend papier en plaats terug op het dia-rek (Zie Tabel van materialen).
  7. Voeg 3 druppels (90 µL) van Amp 1-FL op het monster segment. Incubeer gedurende 30 min op 40 ° C.
  8. Dia's in 1 was buffer voor 2 min op RT. herhalen met vers 1wash buffer dompelen.
  9. Verwijderen van de overtollige vocht uit de dia's met absorberend papier en plaats terug op het dia-rek (Zie Tabel van materialen).
  10. Voeg 3 druppels (90 µL) van versterker 2-FL op het monster segment. Incubeer gedurende 15 min bij 40 ° C.
  11. Dia's in 1 x wassen buffer dompelen gedurende 2 minuten bij RT. herhalen met vers 1 x wassen buffer.
  12. Verwijderen van de overtollige vocht uit de dia's met absorberend papier en plaats terug op het dia-rek (Zie Tabel van materialen).
  13. Voeg 3 druppels (90 µL) van Amp 3-FL op het monster segment. Incubeer gedurende 30 min op 40 ° C.
  14. Dia's in 1 x wassen buffer voor 2 min op RT. herhalen met vers 1 x wassen buffer dompelen.
  15. Verwijderen van de overtollige vocht uit de dia's met absorberend papier en plaats terug op het dia-rek (Zie Tabel van materialen).
  16. Voeg 3 druppels (90 µL) van Amp 4-FL-Alt A op het monster segment. Incubeer gedurende 15 min bij 40 ° C.
  17. Dia's in 1 x wassen buffer dompelen gedurende 2 minuten bij RT. herhalen met vers 1 x wassen buffer.
  18. Verwijder overtollige vocht uit dia's en onmiddellijk plaats 2 druppels montage reagens (Zie Tabel van materialen) in elke sectie.
  19. Plaats een dekglaasje 22 mm 22 mm aan (Zie Tabel van materialen) over elke sectie van de hersenen.
  20. Dia's opslaan in het donker bij 2-8 ° C tot droog.
  21. Inschakelen van de confocal microscoop en overschakelen naar een 60 X doelstelling.
  22. Z-stapel afbeeldingen verkrijgen met een confocal microscoop. Zie de aanvullende video voor een detail procedure voor confocal imaging.
  23. Verwerven van beelden van Drd1α cellen in de nucleus accumbens regio label (excitatie: 488 nm; Emissie: 515/30 nm).
    Opmerking: Laat geen hersenen secties tussen incubatie stappen uitdrogen.

4. de gegevensanalyse

  1. Semi-kwantitatief de kleuring patroon te analyseren: "afzonderlijke punten".
    1. Uitvoeren DAPI kleuring als nucleaire merkstof voor de identificatie van de individuele cel van het beeld zijn. Het is echter nog steeds moeilijk om te analyseren van bepaalde delen van hersenweefsel, omdat er meerdere soorten cellen met onregelmatige vorm van kernen en/of cellen. Hier toewijzen twee ervaren onderzoekers afzonderlijk in elke cel afbeeldingen te definiëren van cel regio.
    2. Visueel score elke cel binnen de representatieve confocal afbeeldingen op basis van het aantal dots per cel met behulp van de specifieke criteria (figuur 1B).
    3. Het nummer van de cel Totaal in elke categorie bepalen en delen door de totale celaantal x100 maken de relatieve frequentie grafieken waarin de percentage frequentie van cellen binnen elke categorie voor alle weefselsecties (figuur 2A) en voor mannen en vrouwen afzonderlijk (figuur 2E).
    4. De som van de cellen binnen alle voorafgaande categorieën verdelen door de cel Totaal aantal x100 om te bepalen van de cumulatieve frequentie van cellen voor alle weefselsecties (figuur 2B) en voor mannen en vrouwen apart (figuur 2F).
  2. Statistisch analyseren de "afzonderlijke punten" kleuring patroon (optioneel).
    1. Het aantal dots per cel om een categorische variabele die is ordinaal in de natuur (dat wil zeggen, het aantal cellen die in de categorie van elke rang van laagste cel expressie (1) op hoogste cel expressie (9 vallen)) onderzoeken voor verdere statistische analyses.
    2. Na onderzoek van beschrijvende statistiek, gebruiken drie belangrijkste benaderingen: een Mantel-Haenszel-statistiek, een Mann-Whitney U test, en een test Kruskal-Wallis. Hoewel de precieze statistische benadering zal afhankelijk van kan de experimentele ontwerp en onderzoek vraag van belang, een statistische besluit boom (Figuur 4) steun bij het maken van beslissingen over iemands analytische aanpak.
  3. Kwantificeren van de intensiteit van het signaal in de regio van belang (ROI) voor de kleuring van patroon: "clusters".
    1. Bereken de signaalsterkte van elke afbeelding met behulp van de volgende vergelijking:
      Signaal intensiteit = totale intensiteit van ROI afbeelding - (gemiddelde intensiteit × totaalbeeld achtergrondgebied)
    2. Het totale aantal cellen binnen ROI afbeelding voor het berekenen van de geschatte signaal expressie per cel tellen. Groep verschillen in signaal intensiteit/beeld evenals het aantal cellen/afbeelding van belang te overwegen van mechanismen die tot groep verschillen gezien in signaal expressie/cel bijdragen kunnen kunnen zijn (figuur 3B-3D).
  4. Statistisch analyseren de "clusters" kleuring patroon (optioneel).
    1. Controleer de signaal-expressie/cel om een continu variabele voor verdere statistische analyse. Gebruik twee benaderingen, met inbegrip van een onafhankelijke sample t-test en de variantieanalyse (ANOVA), gebaseerd op het aantal tussen-onderwerpen factoren in het ontwerp opgenomen. Een statistische besluit boom (Figuur 4) kan steun bij het nemen van beslissingen met betrekking tot de meest geschikte statistische benadering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie waargenomen een 'discrete dots' kleuring patroon voor RNA expressie in de dopamine D1-alpha receptoren (Drd1α) van de nar in F344/N ratten (figuur 1A). Individuele fluorescentie signalen werden gemakkelijk geïdentificeerd en kunnen worden gezien als één 'dots', die elk vertegenwoordigt een enkele RNA transcriptie binnen de cel. Voor afbeeldingen van de nar die de 'discrete dots weergeven' kleuring van de patroon, beoordeeld wij het dynamisch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we een nieuwe techniek van in situ hybridisatie voor hersenen vers bevroren plakjes Drd1α receptor expressie in de nucleus accumbens (NAc) en tyrosine hydroxylase (TH) expressie in de substantia nigra (SNR)-regio te evalueren. We bieden ook methoden van data-analyse voor kleuring kruisbare: "discrete stip" of "clusters".

De kritische stappen voor een succesvolle multiplex fluorescentie RNA in situ hybridisatie assay zijn opgenomen. Zodra het onthoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige werken werden ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies, HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624. Gedeeltelijke Fonds werd verstrekt door een subsidie van de opleiding NIH T32 in biomedische-Behavioral science.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
HybEZ Oven systeemAdvanced Cell Diagnostics 310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1aAdvanced Cell Diagnostics 317031Kleurkanaal 1, Groen
RNAscope Probe - Rn-Th-C2Advanced Cell Diagnostics 314651-C2Kleurkanaal 2, Oranje
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagens KitAdvanced Cell Diagnostics 320850
ImmEdge Hydrofobe Barrière PenVector LaboratoryH-4000
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154% 
4% paraformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
SevofluraanMerritt Veterinary Supply347075
Tissue-Tek vertical 24 schuifladeFisher ScientificNC9837976
Tissue-Tek kleedschotelFisher ScientificNC0731403
Precision Algemeen Gebruik BathsThermoFisher ScientificTSGP28
Pretreatment 4Advanced Cell Diagnostics 320850onderdelen van kits
ProLong Gold anti-fade reagensLife TechnologiesP36930
Amp 1-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850onderdelen van kits
Amp 2-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850onderdelen van kits
Amp 3-FLAdvanced Cell Diagnostics 320850onderdelen van kits
Amp 4-FL-Alt AAdvanced Cell Diagnostics 320850onderdelen van kits
EZ-C1 softwarepakketNikon Instrumentsversie 3.81b
SAS/STAT SoftwareSAS Institute, Inc.,versie 9.4

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction. Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).
  2. Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
  3. Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance. J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).
  4. Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting. Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).
  5. Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia. Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).
  6. Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex. Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).
  7. Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance. Neuroscience. 255, 246-254 (2013).
  8. Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats. Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).
  9. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).
  10. Abi-Dargham, A., et al. Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia. J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).
  11. Shinohara, R., et al. Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice. Mol Psychiatry. 19, (2017).
  12. Okubo, Y., et al. Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET. Nature. 385, 634-636 (1997).
  13. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  14. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 7th ed, Elsevier Academic Press. Burlington. (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

RNA in situ hybridisatieconfocale microscopiesekseverschillentyrosinehydroxylasecentraal zenuwstelselfluorescentie imagingz stack analyseMann Whitney U toets

Gerelateerde artikelen