Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Samenvatting

Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.

Samenvatting

Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis kwijting. Het heeft zijn veronderstelde dat besmetting van pulmonaire weefsel tijdens longontsteking resulteert in de productie van langlevende cytotoxins die tot daaropvolgende einde orgaanfalen leiden kunnen. Wij hebben ontwikkeld in vitro testen om te testen van de hypothese dat cytotoxins worden geproduceerd tijdens de pulmonaire infectie. Geïsoleerde rat pulmonaire endotheliale cellen en de bacterie Pseudomonas aeruginosa worden gebruikt als modelsystemen, en de productie van cytoxins na infectie van de endotheliale cellen van de bacteriën wordt aangetoond door middel van cultuur van de cel gevolgd door directe kwantificatie met behulp van lactaat dehydrogenase tests en een nieuwe microscopische methode ImageJ technologie. De amyloïde aard van deze cytotoxins werd aangetoond door thioflavin T bindende analyses en door immunoblotting en immunodepletion met behulp van de A11 anti-amyloid antilichaam. Verdere analyses met behulp van immunoblotting aangetoond dat oligomere tau en Aβ werden geproduceerd en uitgebracht door endotheliale cellen na infectie door P. aeruginosa. Deze methoden moeten gemakkelijk aanpasbaar aan analyses van menselijke klinische monsters.

Inleiding

Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis geen kwijting^1,2,3,,^4,,^5,6. In de meeste gevallen overlijden door een soort eind-orgaanfalen zoals renale, pulmonale, cardiale, of lever evenementen, evenals lijn^5,6. De reden voor de verhoogde sterfte in deze populatie is nooit vastgesteld.

Longontsteking is geclassificeerd als zijnde hetzij communautaire verworven of ziekenhuizen opgelopen (nosocomiale) en agenten die longontsteking kunnen veroorzaken bevatten bacteriën, virussen, schimmels en chemicaliën. Een van de belangrijkste oorzaken van nosocomiale pneumonie is de bacterie Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa is een gram-negatieve organisme waarmee een type III secretie systeem overbrengt van verschillende effector moleculen, genoemd exoenzymes, rechtstreeks naar het cytoplasma van target cellen^7,8. Tijdens de infectie van pulmonaire endotheliale cellen richten de exoenzymes verschillende intracellulaire eiwitten, met inbegrip van een endotheel vorm van de microtubulus-geassocieerde eiwit tau^9,10,11,12 , leidt tot endothelial barrière verdeling resulterend in ernstige longoedeem, daalde pulmonaire functie en vaak dood.

Zoals eerder vermeld, hebben patiënten die de eerste longontsteking overleven sterftecijfers in de eerste 12 maanden na ziekenhuis kwijting verheven. Een potentiële mechanisme voor het verklaren van dit verschijnsel is dat een soort van langlevende toxine wordt gegenereerd tijdens de initiële infectie die tot slechte op lange termijn resultaat leidt. Twee opmerkingen ondersteunen deze mogelijkheid. Eerste, gekweekte pulmonaire endotheliale cellen die in eerste instantie worden behandeld met P. aeruginosa niet vermenigvuldigen voor tot een week nadat de bacteriën worden gedood door de antibiotica¹³. Tweede, langlevende prionen en agenten met prion kenmerken zijn aangetoond in verschillende menselijke en dierlijke ziekten, met name het zenuwstelsel^14,15is gekoppeld.

Methoden voor de behandeling van de potentiële productie van langlevende cytotoxische agenten tijdens de pulmonaire infectie zijn nooit beschreven. Hier een aantal eenvoudige in vitro testen worden beschreven die kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van de cytotoxin productie en activiteit na infectie met behulp van een gemeenschappelijk longontsteking veroorzaken agent, P. aeruginosa. Deze testen moeten gemakkelijk aan te passen aan het onderzoeken van mogelijke cytotoxin inductie na infectie met behulp van andere stoffen die longontsteking veroorzaken, en het supernatant die worden gegenereerd ook moet nuttig zijn voor het onderzoeken van de effecten van de cytotoxins geheel organen of dieren. Tot slot zal de tests die worden beschreven hier waarschijnlijk worden aangepast aan het testen van dierlijke en menselijke biologische vloeistoffen voor de productie van cytotoxins tijdens longontsteking.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden herzien en goedgekeurd door de institutionele en Animal Care Comité van de Universiteit van Zuid-Alabama en werden uitgevoerd volgens alle federale, staats- en lokale regelgeving. Primaire culturen van rat pulmonaire microvasculaire endotheliale cellen (PMVECs) werden verkregen uit de cel cultuur Core faciliteit bij de Universiteit van Zuid-Alabama's Center for Lung Biology. Cellen werden opgesteld op basis van de eerder beschreven procedures¹⁶.

1. generatie van cytotoxische supernatant

Opmerking: Hier, wij gebruiken twee verschillende stammen van P. aeruginosa: PA103, die een intact type III secretie systeem geschikt heeft voor het overbrengen van de exoenzymes ExoU en ExoT naar doelcellen tijdens de infectie, en ∆PcrV, die het ontbreken van een type III secretie systeem en is niet in staat zijn van overdracht van exoenzymes naar doelcellen na inoculatie.

1. Strijk bacteriën op Vogel-Bonner (VB) agar platen¹⁷ en 's nachts groeien bij 37 ° C.
   1. Ter voorbereiding van platen, maken de volgende stockoplossing (Vogel-Bonner zouten; 10 x voorraad): 2 g MgSO₄, 20 g citroenzuur (vrij zuur), 100 g K₂PO₄en 35 g NaH₂PO₄meten. DdH₂O aan 1 L en autoclaaf gedurende 15 minuten met langzame uitlaat toevoegen.
   2. Plaats 7,5 g agar in 450 mL ddH₂O en autoclaaf als hierboven.
   3. Na autoclaaf, plaatst u beide oplossingen in een waterbad van 50 ° C afkoelen.
   4. Voeg 50 mL van de 10 x VB zout stockoplossing aan de agar.
   5. Toevoegen van carbenicillin aan 400 µg Mo/mL (voor de stammen van P. aeruginosa wordt gebruikt) en meng goed door de kolf zwenken.
   6. Plaats 5 mL van de oplossing van de agar VB in individuele steriele cultuur gerechten, toestaan de agar stollen, en vervolgens opslaan bij 4 ° C tot de dag van bacteriële zaaien.
   7. Op de dag van bacteriële zaaien, vooraf een plaat tot 37 ° C warm en dan strijk bacteriën op het bord met een steriele lus. Plaats de plaat in een incubator 37 ° C's nachts.
2. Controleer of PMVEC zuiverheid door positieve kleuring met fluorescerende Griffonia simplicifolia lectine en negatieve kleuring met fluorescerende Helix pomatia lectine (een marker voor arteriële endotheliale cellen). Aliquot cellen en bevriezing in vloeibare stikstof.
3. Onderhouden van cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum voor experimenten, en groeien van cellen in een incubator van de 37 ° C met 5% CO₂. Het gebruik van cellen op passages 5-15.
   1. Voor de opwekking van cytotoxische supernatant, plaat 2 x 10⁶ cellen in individuele 150 cm gerechten en groeien voor 3-4 dagen totdat samenvloeiing is bereikt. Gebruik twee platen per experiment (zie hieronder).
   2. Voor analyse van cytotoxische supernatant, plaat 1 x 10⁵ cellen in individuele putjes van een 6-well schotel en groeien voor vier dagen totdat samenvloeiing is bereikt.
4. Om te produceren supernatant, was een van de twee 150 cm gerechten van PMVECs uit stap 1.3.1 met fosfaat gebufferde zoutoplossing, trypsinize en vervolgens de cellen tellen (wij gebruiken een geautomatiseerde cel teller en volg de fabrikant protocol; Zie Tabel van materialen). Het andere gerecht van PMVECs met Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) wassen en vervolgens besmetten met beide stam van P. aeruginosa bij een veelheid van infectie (MOI) van 20:1. Dit wordt als volgt bereikt:
   1. Voor P. aeruginosa, OD₅₄₀ 0,25 = 2 x 10⁸ CFUs/mL. Ter voorbereiding van deze tweevoudige verdunning, aan een wegwerp cuvette van 1 mL met toevoegen van 1 mL HBSS. Schraap genoeg bacteriën off van de plaat dat in stap 1.1 was bereid tot een OD-₅₄₀ van 0,25 wordt bereikt wanneer gemeten met een spectrofotometer. De volgende stap zal zorgen voor een berekening van hoeveel bacteriën nodig zullen zijn.
   2. Nadat het aantal PMVECs in de cultuur-schotel is vastgesteld (stap 1.4 hierboven), bepalen van het juiste aantal bacteriën worden toegevoegd aan de tweede, niet-trypsinized cultuur-schotel met de PMVECs. Bijvoorbeeld, indien wordt vastgesteld dat de cultuur schotel van PMVECs 1.3 x 10⁷ cellen bevat, dan bereiden 1.3 x 10⁷ cellen x 20 bacteriën/cel x 1 mL/2 x 10⁸ CFUs = 1.3 mL bacteriën.
   3. Verdun de 1.3 mL van bacteriën in HBSS tot een eindvolume van 20 mL, zodat de volledige oppervlakte van een 150 cm schotel vloeistof kan worden voorzien, dan de verdunde bacteriën toevoegen aan de plaat van PMVECs.
   4. Incubeer de PMVECs geënt met de bacteriën bij 37 ° C in een 5% CO₂ incubator voor 4-5 h, totdat gaten kunnen worden gezien in de cel enkelgelaagde vormen wanneer de plaat wordt microscopisch waargenomen (Zie Figuur 1 voor goede niveau van kloof vorming).
   5. Verzamelen van het supernatant en Centrifugeer gedurende 10 min bij 2.000 x g in een tafelblad centrifuge cellulaire puin te verwijderen.
      Opmerking: Elk tafelblad centrifuge kunnen genereren voldoende g omzetten in pellet unlysed cellen en grote cel fragmenten kunnen worden gebruikt voor deze stap.
   6. Giet het supernatant in een injectiespuit met een 0,2 µm filter gekoppeld aan zijn einde, vervolgens het supernatant passeren door het filter te verwijderen van bacteriën.
   7. Gebruik een aliquoot gedeelte van het supernatans dat steriele om te testen van de cytotoxiciteit (zie 2.1) en de rest van het supernatant bij-80 ° C voor toekomstig gebruik te bevriezen.

2. analyse van cytotoxische supernatant

1. Bepaling van de cytotoxiciteit
   1. Groeien PMVECs in 6-well gerechten tot de samenvloeiing. Wash wells Voeg eenmaal HBSS, vervolgens 1,5 mL filter-gesteriliseerde supernatant (verzameld uit beide cellen PA103 - of ∆PcrV-geënt) aan individuele putjes. Steriele HBSS wordt als een negatieve controle aan een ander goed toevoegen.
   2. Plaats de plaat in de CO₂ -incubator voor 21-24 h, en vervolgens waarnemen voor cel doden/cytotoxiciteit (zie volgende stap). Gebruik van supernatant die vertonen van de cytotoxiciteit voor verdere experimenten en negeren die geen cel doden vertonen.
   3. Kwantificatie van het doden van de cel
      1. Maatregel lactaat dehydrogenase (LDH) vrijlating uit dode cellen met behulp van commercieel beschikbare LDH test Kits en fabrikant aanbevolen procedures.
      2. Als alternatief, cel doden microscopisch ImageJ softwarematig te kwantificeren. Hiervoor opnemen van microscopische beelden en gebieden van de cultuur-schotel met intact cellen, dan kwantificeren regio's ontbreekt cellen (indicatief van celdood in een enkelgelaagde) met behulp van een aangepaste macro voor ImageJ (National Institutes of Health) (Zie aanvullende codering bestand ). Indien gewenst, voert u de stappen van de macro als volgt handmatig:
         1. Input beelden (RGB- of TIFF-formaat) in de macro en helderheid op 15% verzadigd pixels. Contrast-aangepast afbeeldingen dupliceren en uitvoeren van de opdracht "aftrekken achtergrond" om een contrastrijk beeld van zowel de cel als de kloof gebied binnen het gezichtsveld te krijgen.
         2. Aftrekken van dit beeld van de oorspronkelijke afbeelding en de resulterende afbeelding met de oorspronkelijke afbeelding met behulp van de calculator van het beeld "En"-functie te combineren. De resulterende afbeelding omzetten in zwart (hiaten) en wit (cellen) masker met de drempel-functie (minimaal 0, maximaal 5), en gebruik van de functie "binaire eroderen" verwijderen van ruis van het beeld.
         3. Het meten van de verhouding van zwart naar wit pixels binnen het resulterende beeld met behulp van de "gebied fractie" meting. Uitzetten en fractionele gebieden voor het tijdstip van elke behandeling wordt uitgedrukt als percentage van maximale gap omgeving.
         4. Berekenen van de middelen en vergelijken met one-way ANOVA met de Tukey post hoc test, met p -waarden minder dan 0,05 beschouwd als belangrijke.
   4. Immunoblot analyse gebruiken om de aanwezigheid van amyloid oligomere tau en Aβ in supernatant van cultuur. Immunoblot analyses met behulp van standaardprocedures^10,11,12, met uitzondering van concentreren cultuur supernatant ten minste 10-fold voordat de elektroforese uit te voeren.
      1. Te concentreren supernatant, 1-2 mL van het supernatans dat in een centrifugeren filter eenheid waarvan membraan een cut-off molecuulgewicht van 10 kDa heeft te plaatsen. Dan, plaats de filter eenheid in een tafelblad centrifuge en centrifuge op 2.000 x g totdat de vereiste mate van concentratie is bereikt (meestal 45-60 minuten).
      2. Bepalen van de hoeveelheid eiwit in de geconcentreerde supernatant¹¹ en laadt gelijke hoeveelheden van monsters in individuele putjes van de gel.
      3. Stormloop gels, de eiwitten overbrengen in nitrocellulose, vervolgens sonde blots met A11 anti-amyloid antilichaam, T22 anti-oligomere tau antilichaam of MOAB2 anti-Aβ antilichaam gevolgd door passende secundaire antilichamen. De vlekken met behulp van standaard Chemoluminescentie procedures te ontwikkelen.
   5. Gebruiken om te doen een thioflavin T-Assay, thioflavin T, fluorescentie (ThT) te kwantificeren amyloids in supernatant. Voor deze metingen, gebruik filter-gesteriliseerde supernatant.
      1. Bereiden een stockoplossing (50 x) van thioflavin T door schorsing van 8 mg thioflavin T (ThT) in 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Filtreer de oplossing door een 0,22 µm filter verwijderen deeltjes na mengen.
      2. Voor metingen, Voeg 20 µL van ThT voorraad aan 1 mL PBS in een cuvet van de spectrofotometer 1 mL. Plaats het verdunde monster af in een spectrofluorimeter.
      3. Het meten van de basislijn fluorescentie uitstoot met behulp van 425 nm excitatie en scannen van de uitstoot van de fluorescentie van 450-575 nm in stappen van 2 nm.
      4. Een time-lapse scannen met behulp van 425 nm excitatie en 482 nm emissie, met gegevens verworven elke 0,2 s voor 60 s.
      5. De eerste 20 s van de time-lapse scan meet fluorescentie in de lege cuvette. 20 s, de scan pauzeren en 10 µL van het supernatans dat filter-gesteriliseerde toevoegen aan de cuvette. Meng de cuvette door inversie en vervolgens plaats terug in de spectrofluorimeter.
      6. Hervatten van de tijd gebaseerde scan, verwerven de laatste 40 s van gegevens.
      7. Na voltooiing van de time-lapse scan, scannen een definitieve fluorescentie emissiespectrum met identieke instellingen, zoals wordt beschreven in 2.1.5.3.

Resultaten

Een eenvoudige in vitro -assay is ontwikkeld om assay voor de aanwezigheid van cytotoxins in supernatant van cellen die zijn besmet met de bacterie P. aeruginosa. Kortom, kweekmedium van geïnfecteerde cellen 4 h na bacteriële toevoeging is verzameld, de bacteriën worden verwijderd door het filter sterilisatie van de cultuur supernatant en vervolgens het steriele supernatant wordt toegevoegd aan een nieuwe bevolking van cellen. De cellen worden vervolgens waargenomen 21-2...

Discussie

Hier, zijn eenvoudig in vitro methoden beschreven waarmee de demonstratie van de generatie van cytotoxische amyloids tijdens de infectie met een longontsteking veroorzaken organisme. Deze methoden omvatten een cel cultuur cytotoxiciteit assay, immunoblotting, kwantificatie van cel doden met behulp van een nieuwe microscopische methode en ThT bindend. Analyses van de cytotoxische agenten hebben aangetoond dat ze amyloid in de natuur (Figuur 2 en

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Rabbit anti beta amyloid	Thermo	71-5800
A11 amyloid oligomeer antilichaam	StressMarq	SPC-506D
T22 anti-tau oligomeer antilichaam	EMD Millipore	ABN454
Thioflavine T	Sigma Aldrich	T3516
HBSS	Gibco	14025-092
PBS	Gibco	10010-023
0,22 micron spuitfilters	Millipore	SLGP033RS
DMEM	Gibco	11965-092
HRP Geitenantikonijn IgG	Abcam	ab6721-1
Strains PA103 en ΔPcrV			Deze stammen van P. aeruginosa werden verkregen van Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI
FITC Griffonia lektines	Sigma Aldrich	L9381
TRITC Helix pomatia lektines	Sigma Aldrich	L1261
Agar	Fisher	BP1423-500
0,22 micron nitrocellulose	BioRad	162-0112
Type 2 collageenase	Worthington	LS004176
Fetaal bovien serum	Hyclone	SH30898.03IH
PenStrep	Gibco	15070063
Carbenicilline Dinatriumzout	Sigma	C1389
Microcentrifugeerconcentrators- 10.000 MW cut-off	Millipore	UFC801008
Kaliumfosfaat dibasisch	Sigma	795496-500G
Magnesiumfosfaat heptahydraat	MP Biomedicals	MP021914221
Citroenzuur	G Biosciences	50-103-5801
Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat	Sigma	S9506-500G
Countess geautomatiseerde celteller	Invitrogen	C10277