Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis kwijting. Het heeft zijn veronderstelde dat besmetting van pulmonaire weefsel tijdens longontsteking resulteert in de productie van langlevende cytotoxins die tot daaropvolgende einde orgaanfalen leiden kunnen. Wij hebben ontwikkeld in vitro testen om te testen van de hypothese dat cytotoxins worden geproduceerd tijdens de pulmonaire infectie. Geïsoleerde rat pulmonaire endotheliale cellen en de bacterie Pseudomonas aeruginosa worden gebruikt als modelsystemen, en de productie van cytoxins na infectie van de endotheliale cellen van de bacteriën wordt aangetoond door middel van cultuur van de cel gevolgd door directe kwantificatie met behulp van lactaat dehydrogenase tests en een nieuwe microscopische methode ImageJ technologie. De amyloïde aard van deze cytotoxins werd aangetoond door thioflavin T bindende analyses en door immunoblotting en immunodepletion met behulp van de A11 anti-amyloid antilichaam. Verdere analyses met behulp van immunoblotting aangetoond dat oligomere tau en Aβ werden geproduceerd en uitgebracht door endotheliale cellen na infectie door P. aeruginosa. Deze methoden moeten gemakkelijk aanpasbaar aan analyses van menselijke klinische monsters.
Inleiding
Patiënten die longontsteking overleven hebben verheven sterftecijfers in de maanden na ziekenhuis geen kwijting1,2,3,,4,,5,6. In de meeste gevallen overlijden door een soort eind-orgaanfalen zoals renale, pulmonale, cardiale, of lever evenementen, evenals lijn5,6. De reden voor de verhoogde sterfte in deze populatie is nooit vastgesteld.
Longontsteking is geclassificeerd als zijnde hetzi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden herzien en goedgekeurd door de institutionele en Animal Care Comité van de Universiteit van Zuid-Alabama en werden uitgevoerd volgens alle federale, staats- en lokale regelgeving. Primaire culturen van rat pulmonaire microvasculaire endotheliale cellen (PMVECs) werden verkregen uit de cel cultuur Core faciliteit bij de Universiteit van Zuid-Alabama's Center for Lung Biology. Cellen werden opgesteld op basis van de eerder beschreven procedures16.
1. generatie van cytotoxische supernatant
Opmerking: Hier, wij gebruiken twee verschillende stammen van P. aeru....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een eenvoudige in vitro -assay is ontwikkeld om assay voor de aanwezigheid van cytotoxins in supernatant van cellen die zijn besmet met de bacterie P. aeruginosa. Kortom, kweekmedium van geïnfecteerde cellen 4 h na bacteriële toevoeging is verzameld, de bacteriën worden verwijderd door het filter sterilisatie van de cultuur supernatant en vervolgens het steriele supernatant wordt toegevoegd aan een nieuwe bevolking van cellen. De cellen worden vervolgens waargenomen 21-2.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hier, zijn eenvoudig in vitro methoden beschreven waarmee de demonstratie van de generatie van cytotoxische amyloids tijdens de infectie met een longontsteking veroorzaken organisme. Deze methoden omvatten een cel cultuur cytotoxiciteit assay, immunoblotting, kwantificatie van cel doden met behulp van een nieuwe microscopische methode en ThT bindend. Analyses van de cytotoxische agenten hebben aangetoond dat ze amyloid in de natuur (Figuur 2 en
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen verslag.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd in delen door NIH grants HL66299 Rd, RB en SL, HL60024 naar TS, en HL136869 op MF.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomeer antilichaam | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomeer antilichaam | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavine T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0,22 micron spuitfilters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Geitenantikonijn IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 en ΔPcrV | Deze stammen van P. aeruginosa werden verkregen van Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lektines | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lektines | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0,22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collageenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetaal bovien serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicilline Dinatriumzout | Sigma | C1389 | |
| Microcentrifugeerconcentrators- 10.000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Kaliumfosfaat dibasisch | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesiumfosfaat heptahydraat | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citroenzuur | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat | Sigma | S9506-500G | |
| Countess geautomatiseerde celteller | Invitrogen | C10277 |
Referenties
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
