Methodenartikel

Beoordeling van collageen en elastine druk-afhankelijke Microarchitectures in Live, menselijke weerstand slagaders door Label-vrije fluorescentie microscopie

DOI:

10.3791/57451

⸱

9 april 2018

 ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular and Renal Research, Institute of Molecular Medicine, University of Southern Denmark, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark, 3Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Surgery, Odense University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven gelijktijdige mechanische testen en 3D-imaging van de arteriële muur van geïsoleerd levende menselijke weerstand slagaders, en Fiji en Ilastik analyses van de afbeelding voor de kwantificering van elastine en collageen ruimtelijke organisatie en volume dichtheden. We bespreken het gebruik van deze gegevens in wiskundige modellen van arteriële muur mechanica.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pathogene bijdrage aan het remodelleren van de slagader van de weerstand wordt beschreven in essentiële hypertensie, diabetes en het metabool syndroom. Onderzoek en ontwikkeling van microstructurally gemotiveerd wiskundige modellen voor het begrijpen van de mechanische eigenschappen van menselijke weerstand slagaders in gezondheid en ziekte hebben het potentieel om te helpen begrijpen hoe ziekte en medische behandelingen invloed op de menselijke microcirculatie. Ontwikkeling van deze wiskundige modellen, is het essentieel om te ontcijferen van de relatie tussen de eigenschappen van het mechanische en microarchitectural van de microvasculaire muur. In dit werk beschrijven we een ex vivo -methode voor het passieve mechanische testen en gelijktijdige label-free driedimensionale beeldvorming van de microarchitectuur van elastine en collageen in de arteriële muur van geïsoleerde menselijke weerstand slagaders. Het imaging protocol kan worden toegepast op weerstand slagaders van elke soort van belang. Beeld analyses worden beschreven voor het kwantificeren van i) druk-geïnduceerde veranderingen in interne elastische lamina vertakkende hoeken en adventitial collageen rechtheid met behulp van Fiji en ii) collageen en elastine volume dichtheid bepaald met behulp van de Ilastik software. Bij voorkeur alle mechanische en imaging metingen worden uitgevoerd op live, geperfundeerd slagaders, is echter een alternatieve aanpak met behulp van video-microscopie standaarddruk myography in combinatie met na fixatie beeldvorming van opnieuw onder druk staande schepen besproken. Deze alternatieve methode biedt gebruikers met verschillende opties voor analyse benaderingen. De opname van de mechanische en imaging gegevens in wiskundige modellen van de arteriële muur mechanica wordt besproken, en toekomstige ontwikkeling en toevoegingen aan het protocol worden voorgesteld.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pathogene bijdrage en de gevolgen van het remodelleren van de slagader van de weerstand worden beschreven in essentiële hypertensie, diabetes en het metabool syndroom1,2,3,4,5. Ontcijferen van de relatie tussen de eigenschappen van het mechanische en microarchitectural van de microvasculaire muur is essentieel voor de ontwikkeling van wiskundige modellen van deze vereniging. Dergelijke modellen inzicht in het remodelleert proces zal verbeteren en de ontwikkeling van in silico modellen handig voor het testen van farmacologische strategieën gericht op ziekte gerelateerde remodelleren van de arteriële muur zullen steunen.

Voorafgaande studies gericht in het begrip van hoe de microarchitectuur van de arteriële muur heeft betrekking op arteriële muur mechanica door mechanische maatregelen te nemen en de microarchitectuur van de extracellulaire matrix (ECM) worden bijna uitsluitend uitgevoerd op grote , elastische conduit slagaders van muizen of varkens6,7,8,9,10,11. Beeldvorming van de microstructuren van de muur worden doorgaans uitgevoerd met behulp van niet-lineaire optische technieken, profiteren van de autofluorescence van elastine en tweede-harmonische generatie door collageen. Hierdoor Spatio beeldvorming van de twee belangrijke componenten van de extracellulaire matrix, elastine en collageen, zonder behoefte aan een kleuring. Beeldvorming van de arteriële muur in volledige dikte is een uitdaging in grote conduit slagaders als gevolg van de spreiding van het licht in de dikke tunica media. Echter, om te bepalen hoe de microarchitectuur van de structurele onderdelen van de arteriële muur zich verhouden tot de waargenomen mechanische eigenschappen, driedimensionale informatie moet worden verkregen tijdens de mechanische testen. Voor grote slagaders zoals de menselijke aorta hiervoor biaxial montage, mechanische testen en beeldvorming van gebieden van belang in 1-2 cm2 stukken van de arteriële muur7,9,10, 12. slechts een deel van de muur kan worden beeld en mechanisch getest.

Voor kleinere slagaders van elke soort (bijvoorbeeld, menselijke pericardvocht13, pulmonale14 en subcutane15 slagaders, rat mesenterische slagaders16,17,18, 19 , 20, muis cremaster, lymfklieren, cerebrale, femur en halsslagaderen21,22,23,24,25,26, 27) beeldvorming van de gehele wanddikte is mogelijk en kan gecombineerd worden met mechanische testen. Hierdoor wordt gelijktijdige opname van de mechanische eigenschappen en de structurele regelingen binnen de stadsmuur. Echter is een directe wiskundige modellering van de relatie tussen de waargenomen veranderingen in de driedimensionale structuur van de ECM en gewijzigde mechanische eigenschappen van de arteriële muur van verzet, om het beste van onze kennis alleen gemeld op recent in de menselijke weerstand slagaders13,15.

In dit werk, wordt een ex vivo voor passieve mechanische testen en gelijktijdige driedimensionale beeldvorming van de microarchitectuur van elastine en collageen in de arteriële muur van geïsoleerde menselijke weerstand slagaders beschreven. Het imaging protocol kan worden toegepast op weerstand slagaders van elke soort van belang. Beeld analyses worden beschreven voor het verkrijgen van de maatregelen van interne elastische lamina vertakkende hoeken en adventitial collageen rechtheid13 met behulp van Fiji28. Collageen en elastine volume dichtheden worden bepaald met behulp van de Ilastik software29 en ten slotte de opname van de mechanische en imaging gegevens in wiskundige modellen van de arteriële muur mechanica wordt besproken.

Het doel van het beschrijven van de beeldvorming en beeld analyses technieken in combinatie met wiskundige modellering is bedoeld als onderzoekers een planmatige aanpak om te beschrijven en te begrijpen waargenomen druk geïnduceerde veranderingen in de ECM van weerstand slagaders. De beschreven methode is gericht op het kwantificeren van de veranderingen in de ECM in een vaartuig tijdens drukregeling, door het vergelijken van de structuur van de ECM bij 20, 40 en 100 mmHg. Deze druk werden gekozen voor de bepaling van de structuur van de arteriële muur op de meer compatibele (20 mmHg), de stijf (100 mmHg) en de intermediaire (40 mmHg) status, respectievelijk. Echter kan een proces in de vasculaire muur van levende slagaders, met inbegrip van wijzigingen veroorzaakt door vasoactieve onderdelen, hysteresis en stroom, worden gekwantificeerd, afhankelijk van de onderzoek-hypothese in kwestie door de onderzoeker.

Het gebruik van twee-foton excitatie fluorescentie microscopie (TPEM) in combinatie met een druk myograph voor studeren druk (of andere) veroorzaakte veranderingen in de ECM van levende slagaders wordt benadrukt. Ten eerste, omdat hierdoor gelijktijdige overname van de totale driedimensionale structuur van de arteriële muur (diameter en muur dikte) samen met driedimensionale label-vrije verwerving van hoge kwaliteit, gedetailleerde beelden van de collageen en elastine microarchitectures als beschreven13 door te profiteren van de elastine-autofluorescence en de collageen tweede harmonische generatie signaal (SHG)30. Ten tweede, TPEM maakt gebruik van lage-energie nabij-infrarood excitatie licht, minimaliseren van photodamage van het weefsel en dus herhaalde beeldvorming op precies dezelfde positie binnen de vasculaire muur is toegestaan, executoriale herhaald-metingen analyses van waargenomen wijzigingen.

Het gebruik van een alternatieve aanpak met behulp van de confocal beeldvorming van druk vaste slagaders wordt besproken zodat gebruikers zonder toegang tot TPEM kunnen gebruiken van de beschreven methode ook. Uit twee-dimensionale analyses van weefsels gesegmenteerd in seriële, bijvoorbeeld zoals beschreven door31,32kan ook informatie over ECM structuur en volume dichtheden worden opgehaald. Als gevolg van het ontbreken van de mogelijkheid tot drie-dimensionale structurele informatie ophalen over de schalen van de lengte van de slagader en tijdens het veranderende omstandigheden met behulp van deze methode, het is echter niet raden deze aanpak voor onderzoek van druk en behandeling geïnduceerde driedimensionale veranderingen in de ECM.

De minimale eis voor de onderzoeker de hierin beschreven methode toe te passen is de toegang tot een setup voor cannulation en drukregeling van de slagaders in combinatie met een confocal of twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop. De setup beschreven in het volgende protocol is een op maat gemaakte druk myograph met een longitudinale kracht transducer, built to fit op een aangepaste gebouwde omgekeerde twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Collectie van Biopten van het menselijke pariëtale pericard voor gebruik in dit werk werd uitgevoerd na schriftelijke geïnformeerde toestemming, als eerder beschreven33. De studie van menselijke weefsels voldoen aan de beginselen die zijn uiteengezet in de verklaring van Helsinki-34 en werd goedgekeurd door de regionale comités over gezondheid onderzoek ethiek voor Zuid-Denemarken (S-20100044 en S-20140202) en het Bureau voor gegevensbescherming Deens.

1. verzamelen van weefsel en isolaat (menselijk) weerstand slagader

  1. Verzamelen van weefselmonsters van belang onmiddellijk na de besnijdenis tijdens een operatie. Overdracht van het weefsel tot 4 ° C HEPES gebufferde fysiologische zoutoplossing (HBS) onmiddellijk bij de inzameling en sla deze op HBS.
    Opmerking: Menselijke weefsels worden alleen verzameld na goedkeuring door institutionele en ethische commissies, evenals patiënten schriftelijke geïnformeerde toestemming. Samenstelling van de HBS in mM: 144 NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, HEPES 14,9, glucose 5.5. Breng de pH 7.4 met NaOH, en filtreer de oplossing maar 0,2 µm filter.
  2. Laat de verzamelde weefsel in steriele HBS bij 4 ° C's nachts te wassen verdoving.
    Opmerking: Effect van overnachting opslag op schip integriteit en functionaliteit moet worden gecontroleerd door het individuele research laboratory.
  3. Zorgvuldig isoleren weerstand formaat slagaders (± 200 µm lumen diameter) met behulp van een paar scherpe-tip pincet en micro-dissectie schaar.
  4. Bewaar de slagaders bij 4 ° C in ijskoude HBS terwijl priming het imaging/druk kamer.

2. Monteer de geïsoleerde slagader in de druk-Myograph

  1. Het monteren van de glazen canules met een tip diameter van ~ 80 µm op canules houders. Plaats de tips ongeveer 150 µm boven de kamer glazen bodem.
    Opmerking: 45° gebogen uiteinde canules kunnen nauwkeurige positionering van het vaartuig boven de glazen bodem.
  2. Vul zowel inlaat en uitlaat buizen met HBS met 1% BSA en verbinding maken met de druk systeem.
    Opmerking: BSA is opgenomen om endothelial cel functie behouden.
  3. Monteer de geïsoleerde slagader met behulp van twee dubbele knoop hechtingen per canule.
    Opmerking: Knopen kunnen worden voorbereid en opgeslagen op dubbele plakband totdat het nodig is.
  4. De kamer vullen met HBS en plaats twee dubbele knopen op elk glas canule.
    Opmerking: Bij gebruik van slagaders worden getoond myogenic Toon, HBS moet worden vervangen met calcium die gratis HBS aangevuld met 3 µM EGTA en 3 µM natrium nitroprusside.
  5. Houd de slagader zachtjes aan de ene kant met behulp van twee paren van scherpe uiteinde pincet. Open het lumen van de slagader en schuif het zachtjes op de canule. Fix op canule met behulp van twee knopen.
  6. Toepassing van een druk van 5 mmHg voor het voorzichtig spoelen van de lumen met HBS / 1% BSA.
  7. Cannulate van het andere uiteinde van de slagader en veilig op de canule met behulp van twee dubbele knopen.
  8. De myograph overbrengen in het stadium van de Microscoop en druk uitoefenen op de slagader tot 5 mmHg (inlaatdruk = outlet druk), dan verwarmen tot 37 ° C gedurende 30 minuten.
  9. Optioneel: Kalibreren de transducer longitudinale kracht volgens de instructies van de fabrikant (1 g = 9,81 mN).
    Opmerking: Het is essentieel voor het kalibreren van de transducer kracht na verwarming is temperatuur gevoelig.

3. Voer Experiment: Beeldvorming van arteriële Diameter, wanddikte en collageen en elastine-microarchitectuur met behulp van TPEM

  1. Snel scannen de gecanuleerde slagader drukkend tot 5 mmHg met behulp van een 20 X doelstelling (numerieke diafragma (nvt) ≥ 0.8) en lage excitatie voedingslampje te beoordelen van de diameter en de muur dikte schip op 5 mmHg.
    Opmerking: Voor omgekeerde microscopen, gebruikt u een water onderdompeling doelstelling; Gebruik een water dompelen doelstelling voor rechtop microscopen. Als het doel geen een correctie kraag om te corrigeren voor de dikte van de cover slip, zorg ervoor dat de gebruikte cover slip overeenkomen met het doel gebruikt. De software-instellingen en beschrijvingen kunnen variëren afhankelijk van de gebruiker-interfase en de Microscoop en de software die wordt gebruikt.
    1. De optische weglengte van Setup.
      1. Mai Tai twee-foton laser activeren en zet deze op 820 nm excitatie licht.
        Let op: Vermijd eventuele blootstelling aan zowel zichtbare als onzichtbare laserlicht.
      2. Verzamelen emissie gelijktijdig in twee kanalen. Splitsen van de uitstoot licht tussen de photomultipliers met behulp van een 460 nm lange pass dichroïde spiegel en verzamelen uitstoot met 30-60 nm breed bandpass filters gecentreerd op 520 nm (elastine) en 410 nm (collageen), respectievelijk.
    2. Schakel continu scannen met 10 µs laser Nadruktijd tijd/pixel en 512 × 512 pixels voor 100% gezichtsveld.
    3. Handmatig scannen door de slagader om te bepalen van de diepte waar maximale diameter wordt waargenomen.
    4. Kies een rechthoekig segment die betrekking hebben op de grootste diameter van de slagader en scannen van één frame met pixel grootte ≤ 300 nm/pixel (figuur 2C). Gebruiken als lage excitatie lichte macht en pixel Nadruktijd mogelijk om te voorkomen dat photodamaging de levende slagader.
      Opmerking: Het is aanbevolen om het verkrijgen van een rechthoekig, bijv., 100 × 1024 pixel afbeelding, in plaats van kwadratische beeld op deze positie om tijd te besparen en het beperken van de weefsel foton blootstelling (figuur 2C).
    5. De afbeelding opslaan voor latere analyses.
  2. Het bepalen van de diameter en de muur dikte lumen bij de maximale diameter van de slagader.
    1. Laden van de afbeelding in Fiji.
    2. De schaal instellen door te klikken op Main menu | Analyseren | Stel schaal en voer µm/pixel en pixel ratio (het is sterk aanbevolen om te houden van de hoogteverhouding voor pixels van 1:1).
    3. Kies het lijngereedschap Fiji en trek een lijn tussen de twee interne elastische laminae aan elke kant van de arteriële lumen en op ctrl + M. De lengte van de verslagen van Fiji als standaard in de tabel van de resultaten.
    4. Ook meer lijnen voor het meten van de dikte van elke muur tekenen en klikt u op ctrl + M om te meten van de volgende aantekeningen.
    5. Sla de metingen.
  3. Afbeelding collageen en elastine-microarchitectuur op 5 mmHg door het scannen van de gehele dikte van de arteriële muur, verkrijgen van 3D afbeeldingsstapels met goede kwaliteit voor 1-3-regio's van belang langs de lengte van de slagader.
    1. Afbeeldingsstapels door de gehele wand van de slagader met behulp van een 60 X doelstelling, NB ≥ 1, geoptimaliseerde pixelgrootte en z-spacing te verkrijgen.
      1. De optimale imaging voorwaarden (pixelgrootte en spatiëring van de z-stap) berekenen overeenkomstig de optische traject, onderdompeling medium en proef de refractieve indexen met behulp van de wetenschappelijke Volume Imaging Nyquist calculator (https://svi.nl/NyquistCalculator).
        Opmerking: Let hier op het verschil tussen optimale pixelgrootte en z-afstand ten opzichte van het advies in sectie 3.4. boven op het gebruik van een maximale grootte van de pixel.
    2. Gebruik dezelfde excitatie en emissie instellingen als hierboven (punt 3.1.1.).
    3. Snel scannen de vaatwand, zoals hierboven beschreven om te bepalen van de dikte van de z-stack.
    4. De z-stack start en einde diepte, z-stap afstand en pixeldichtheid (berekend in 3.3.1.1.) definiëren en uitvoeren van de z-scan. Elk kanaal afzonderlijk opslaan.
      Opmerking: Afbeeldingen moet klein genoeg bijv 30 x 30 µm of 50 × 50 µm afhankelijk van de grootte van het vaartuig te vermijden van elke invloed van kromming in de volgende afbeelding analyses.
  4. Bepalen van arteriële diameter, wanddikte en elastine en collageen-microarchitectuur bij resterende druk van protocol.
    1. 3.1-3.2 op druk 10 en 20 mmHg herhalen, herhalen 3.3 op druk 20 mmHg.
    2. Herhaal 3.1 en 3.2 op druk 40 mmHg.
    3. 3.1-3.2 op druk 60, 80 en 100 mmHg herhaal en herhaal 3.3 op 100 mmHg.
      Opmerking: 3.1-3.3 kan worden herhaald voor elke pressie, en combinaties van druk (bijvoorbeeld een serie/combinatie van toenemende zo goed als dalende druk), afhankelijk van de hypothese te testen. Eosine in concentratie 0,3 - 1 µM kan worden toegevoegd aan het verbeteren van elastine autofluorescence in geval van photobleaching. Photobleaching kan worden vermeden door het toe te passen als energiebesparende excitatie licht mogelijk.
    4. De buffer in de zaal van de myograph vervangen door verse 37 ° C HBS na elke stap van de druk. Toestaan dat de slagader aan te passen voor 5 min vóór imaging na elke wijziging in de druk.
  5. Kanaal stapels afzonderlijk voor beeld analyses opslaan.
  6. Test de levensvatbaarheid van de slagader.
    1. Toepassen van 10 µM U46619 in de myograph-zaal, gevolgd door de toevoeging van 10 µM bradykinine wanneer een stabiele vernauwing is geconstateerd.
    2. Diameter en muur dikte opnemen zoals hierboven beschreven in sectie 3.1 na de datum van de aanvraag van elk van de verbindingen.
    3. Voeg 3 µM natrium nitroprusside als de slagader is niet volledig uitgezet na de toevoeging van bradykinine en record diameter en muur dikte.
      Opmerking: Afhankelijk van de farmacologische eigenschappen van de slagader van belang (vasculaire bed en soorten) andere vasoconstrictor en (endotheel-afhankelijke) vaatverwijdende stoffen kunnen worden gebruikt.
  7. Optioneel: Fix de hydrofoor slagader of doorgaan met beeldvorming van collageen en elastine voor volume dichtheid (stap 7).
    1. Voeg 4% formaldehyde in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    2. Spoel de vaste slagader driemaal in 1 x PBS en schuif voorzichtig de slagader uit de canules, alleen die onderdelen van de slagader buiten de knopen aan te raken. Niet verwijderen van de knopen, ze gebruiken voor het houden van de slagader bij het overbrengen naar een opslag buis.
    3. Winkel in 1 x PBS / 0,05% natriumazide bij 4 ° C tot imaging voor elastine en collageen volume dichtheden of andere doeleinden.
      Opmerking: Vaste slagaders kunnen worden opgeslagen gedurende ten minste 3 maanden in 1 x PBS / 0,05% natriumazide bij 4 ° C.

4. berekening van de Stress stam relaties en intrinsieke muur stijfheid

  1. Gelieve te volgen de formules en Berekeningsstappen voor de berekening van benadrukt, stammen en stijfheid van de muur zoals beschreven door Bloksgaard, M. et al. 13 en verwijzingen hierin.

5. beeldanalyse - (interne elastische Lamina) IEL vertakking hoeken

  1. Open afbeeldingsstapel in Fiji. Ga naar bestand | openen afbeelding afbeeldingsstapel kiezen.
    Opmerking: Max intensiteit projecties van 2-7 opeenvolgende z-secties die betrekking hebben op de IEL (1-2 µm dikte) worden gebruikt voor het bepalen van de IEL elastine vezels vertakkende hoeken met behulp van het hulpprogramma hoek in Fiji28,35. Zie figuur 4A voor illustratie.
  2. Ga naar afbeelding | stapels | z project... de beelden en de "Max intensiteit projectie" te kiezen.
  3. De max intensiteit projectie opslaan als TIFF-bestand.
  4. Kies zoveel IEL vezel vertakkende punten mogelijk het hulpprogramma voor de "hoek" en systematisch werken door middel van de beelden. Klik op ctrl + M om te meten van elke hoek.
  5. De Fiji-resultaten blad opslaan.

6. beeldanalyse - collageen Adventitial-Waviness

  1. Open afbeeldingsstapel in Fiji. Ga naar bestand | openen afbeelding kiezen afbeeldingsstapel.
    Opmerking: Max intensiteit projecties van 2-7 opeenvolgende z-secties die betrekking hebben op collageen recht buiten de externe elastische lamina (paling, 1-4 µm dikte) worden gebruikt voor het bepalen van collageen waviness met behulp van de plugin Fiji NeuronJ36 , zoals beschreven door Rezakhaniha, R . et al. 37 (Figuur 4B).
  2. Stel de schaal. Ga naar analyseren | Stel schaal pixel dimensies invoeren.
  3. Ga naar afbeelding | stapels | z project... beelden om mee te werken en "Max intensiteit projectie" te kiezen.
  4. 8 bitt TIFF Afbeeldingstype wijzigen door te klikken op afbeelding | type | 8 bitt en de max intensiteit projectie opslaan als TIFF-bestand.
  5. Maatregel collageen vezels rechtheid de Fiji Neuron J-plug-in gebruiken.
    1. De plugin van NeuronJ openen door te klikken op Fiji | Plugins | Neuron J.
    2. De 8-bit TIFF in NeuronJ openen door te klikken op Load Image | Selecteer bestand.
    3. Klik op toevoegen van schetsen, en selecteer vezels te analyseren door te klikken op het begin en einde van elke vezel.
    4. Klik op maatregel schetsen, kies weergeven van tracering (Lf) en hoekpunt metingen in het dialoogvenster.
  6. L0/Lf berekenen in excel (of soortgelijke) en de resultaten opslaan.
    1. Kopiëren en plakken van Fiji Neuron J schetsen en hoekpunten uitvoer naar excel (of soortgelijke) en L0 berekenen met behulp van de stelling van Pythagoras van uit de metingen van het hoekpunt. Eerste en laatste punt op lijn geven de posities van de uiteinden van de schuine zijde in een 2D coördinatensysteem.
      Opmerking: Een L0/Lf [collageen vezels bundel end-to-end lengte via een rechte lijn (L0) / volledige lengte (Lf)] dicht bij 1 geeft een bijna rechte collageen vezels.

7. imaging voor collageen en elastine Volume dichtheid

  1. Wassen van de (vaste) slagader 1 x in PBS en vlek het gedurende 15 min. in 1 µM eosine in 1 x PBS in het donker. Voer deze stap bij kamertemperatuur voor vaste slagaders.
    Opmerking: Eosine verbetert de elastine-fluorescentie. Eosine zal vlekken andere structuren zoals collageen en het cytoplasma van de cel als het monster wordt gelaten in de kleurstofoplossing voor langere tijd. Als kleuring van andere structuren te intens is, lager de concentratie van eosine tot 0,3 µM of repeat wassen.
  2. Wassen van de slagader 3 x in 1 x PBS
    1. Voor vaste slagaders: monteren van de slagader voor imaging.
      Let op: Beeldvorming van vaartuigen niet drukkend staat geen ophalen van geometrische kwantitatieve informatie. Als absolute hoeveelheden nodig zijn, moeten deze altijd worden verkregen op live, hydrofoor slagaders. Volume-ratio's kunnen worden verkregen op de slagaders niet drukkend met deze methode.
      1. Plaats twee stukken van dubbele adhesive tape 1-1,5 cm uit elkaar op het glas van een object. Dubbele kleefband is ongeveer 100 µm dik. Toepassing van een of meer lagen van de tape te overeenkomen met de diameter van de slagader te worden gemonteerd.
      2. Plaats van 10-20 µL van PBS op het glas in het midden van het plein en plaats de slagader in de daling van de PBS.
        Opmerking: De daling moet zo klein en plat mogelijk om te voorkomen dat de slagader uit positie duwen bij het monteren van de cover slip.
      3. Plaats het dekglaasje aan en druk op naar dubbele kleefband.
      4. Vul het reservoir tussen het dekglaasje aan en object glas met 1 x PBS. Bijvullen het elk uur om te voorkomen dat het drogen van het monster.
  3. Verkrijgen afbeeldingsstapels voor collageen en elastine volume dichtheden een 20 X doelstelling met NA > 1 om te dekken zoveel mogelijk van de arteriële muur mogelijk terwijl nog het hebben van een goede optische resolutie (figuur 2D, 2 G en 2 H).
    Opmerking: Gebruik een water onderdompeling doelstelling voor beeldvorming van vaste slagaders onder een dekglaasje aan, en een water dompelen doelstelling voor beeldvorming van vitale slagaders. Als het doel geen een correctie kraag om te corrigeren voor de dikte van de cover slip, zorg ervoor dat overeenkomt met het dekglaasje aan aan de doelstelling. Gebruik bij voorkeur optimale pixelgrootte en z-afstand. Bereken deze met behulp van de Calculator van de Nyquist (stap 3.3.1.1.). Ook gebruiken een minimale pixelgrootte van 300 nm en z-afstand van 1 µm. Het is aanbevolen om het verkrijgen van drie afbeeldingen langs de lengte van de slagader kan de gebruiker om te bepalen van intra-assay variabiliteit.
  4. Afbeelding elastine met behulp van 820 nm excitatie licht en verzamelen emissie met behulp van een 30-60 nm breed bandfilter filter gecentreerd op 520 nm.
  5. Afbeelding collageen met behulp van 990 nm excitatie licht te vermijden elke excitatie van elastine en andere autofluorescent eiwitten en verzamelen emissie met behulp van 10-30 nm breed bandfilter filter gecentreerd op 495 nm.
  6. Afbeeldingsstapels van elk kanaal afzonderlijk opslaan als TIFF-bestanden

8. beeldanalyse voor het extraheren van elastine en collageen Volume dichtheid met behulp van Ilastik

  1. TIFF-afbeeldingsstapels aan HDF5 Fiji28,35 te gebruiken door te klikken op Kies bestand converteren | Opslaan als... Hdf5.
  2. Maak twee gegevens bestandsmappen op de vaste schijf van de computer, een voor elastine, een voor collageen afbeeldingsstapels, respectievelijk. Relevante afbeeldingsstapels naar de relevante map kopiëren.
  3. Maak twee nieuwe projecten van de Ilastik in de Ilastik-software, één van elastine, één voor collageen, respectievelijk.
    1. Open Ilastik | Nieuw project maken | pixel classificatie | nieuw project | gegevens toevoegen en selecteer afbeeldingenmap gemaakt in stap 8.2.
      Opmerking: Volg de wizard Ilastik.
  4. Importeren van één 3D beeld stack om de trein van de software.
    1. Selecteer de Input Data applet | belangrijkste werkruimte gebied | Ruwe gegevens tabblad | Toevoegen van nieuwe... | Aparte afbeelding(en) toevoegen en kies de gewenste afbeeldingsgegevens
  5. Kies relevante functies in de software.
    1. Open functie selectie applet | Selecteer functie die opent een nieuw dialoogvenster. Zie figuur 5A voor details.
  6. Ten minste twee labels met de Label toevoegen knop onder de opleiding-applet toevoegen.
    Opmerking: Elke label komt overeen met een objecttype dat moet worden gescheiden. In dit werk, drie labels worden gebruikt voor elastine: elastine zelf, lichtpuntjes (te sluiten), en achtergrond (worden uitgesloten).
  7. Trekken van labels boven aan de stapel van de raw-afbeeldingen met behulp van de stijl van de aantekeningsfunctie kwast.
    1. Selecteer het geschikte etiket: Klik op het gereedschap penseel en beginnen tekenen.
  8. Gevraagd Ilastik te analyseren de afbeeldingsstapel en zoeken naar vergelijkbare kenmerken door te klikken op Inschakelen Live Update.
  9. Controleer zorgvuldig de voorspelling kaart (figuur 5D).
    Opmerking: Het proces van raw-afbeeldingen tot een volledige voorspelling kaart is afgebeeld in Figuur 5. Ilastik gebruikt de voorspelling kaart segmenten van de afbeelding gestapeld volgens welk label een pixel is meer kans om te worden gekoppeld (figuur 5D).
  10. Toepassing van een drempel.
    1. Selecteer drempelmethode applet, kies een geschikte methode input label, gladde, drempel maat filter parameters en klik tot slot op toepassen.
      Opmerking: Dit beveiligingsmethode de Evenzo gelabelde delen van de afbeelding in afzonderlijke objecten. Zeer verbonden weefsel, zoals elastine en collageen niet hoeft te worden gescheiden, dus een drempel van 0.4 is toegepast (de standaardinstelling is 0,5). Figuur 5E en 5F illustreren het resultaat van de toepassing van een drempel.
  11. Herhaal de opleiding van Ilastik, totdat het resultaat bevredigend is (alleen elastine, respectievelijk collageen is erkend voor de respectieve analyses).
    1. Vaak schakelen tussen de opleiding en segmentatie (en soms ook de drempelmethode) applets tijdens dit proces. Een voorbeeld van het effect van omscholing Ilastik wordt weergegeven in Figuur 6.
  12. Batch analyseren soortgelijke afbeeldingsgegevens: Selecteer batch voorspelling Invoerselectie en relevante bestanden toevoegen.
    Opmerking: De Ilastik uitvoer is een verzameling pseudo - 1 bit 3D afbeeldingsstapels (afbeelding maskers) met 0 (nul) ter aanduiding van het ontbreken of elastine (collageen) en 1 (een) ter aanduiding van de aanwezigheid daarvan (de werkelijke bitdiepte is 8-bits).
  13. De resultaten voor elke afbeeldingsstapel controleren door het visueel vergelijken de afbeelding maskers en raw-afbeeldingsbestanden.
  14. Optimaliseren van het Ilastik masker (stappen 8.4-8,9) en opnieuw analyseren elke afbeeldingsstapels met onbevredigende resultaten.
  15. Berekenen van elastine en collageen volume dichtheden van Ilastik beeld maskers met behulp van MATLAB
    1. Open MATLAB.
    2. Selecteer de map met ilastik afbeelding maskers in MATLAB "huidige map" venster.
    3. Kopieer het script MATLAB van aanvullende bestand 1 aan de MATLAB-editor en sla de code op als volumeCalculator.m in de MATLAB-map op de vaste schijf van de computer.
    4. Voer pixelgrootte en pixel hoogte in de script-lijnen
      pixelSize = 0.1230000 * 0.1230000; % micron * micron
      pixelHeight = 0,9; % micron
    5. Sla het script.
    6. Ga naar MATLAB troepenleiding venster en voer "volumeCalculator (' pad-naar-data')" voor het laden van het script.
    7. Klik op invoeren. Elke Afbeeldingsmasker is nu samengevat en vermenigvuldigd met het (bekende) pixel/voxel-volume (de fysieke afmetingen van een pixel vermenigvuldigd met de resolutie van de z-as). De uitvoer vanuit MATLAB is het totale volume van elastine en collageen in elke afbeeldingsstapel.
  16. De resultaten opslaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De op maat gemaakte druk myograph voor imaging gebruikt in dit werk is afgebeeld in Figuur 1. Speciale aandacht voor het ontwerp van de myograph werd besteed aan i) de kamer met een klein volume (2 mL) en ii) de mogelijkheid voor het plaatsen van de canules dicht bij en parallel met de glazen bodem (figuur 1B). De bodem van de kamer past een 50 × 24 mm #1.5 glas dekglaasje aan (vervangbare). De druk-controller werd gebouwd uit ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk vertegenwoordigt onze suggestie voor een gestandaardiseerde, gecombineerde beeldvorming en druk myography aanpak, waardevol voor gelijktijdige evaluatie van de mechanische eigenschappen van weerstand slagaders en druk-gerelateerde veranderingen in de structuur van het arterial muur over een drukbereik van 0 tot 100 mmHg. De voorgestelde aanpak werd ontwikkeld met behulp van aangepaste ingebouwde apparatuur, echter druk myograph die op een twee-foton excitatie fluorescentie Microscoop past kan worden gebruikt, wa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken het Deens moleculaire Biomedical Imaging Center op de faculteit of Natural Sciences, Universiteit van Zuid-Denemarken, voor het gebruik van laboratoria en microscopen. Kristoffer Rosenstand en Ulla Melchior worden erkend voor uitstekende technische bijstand met de druk myography en imaging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fine Science Tools15401-12
Fine Science Tools11251-23
NikonSMZ800N
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.761028voor dissectiedoeleinden
Vitrex Medical A/S, Herlev, Denmark1.63, 2.13, 210mm
Smiths medical Intl, UK
EthiconEthilon 11-0
Op maat gebouwdDK octrooinummer 201200167, Universiteit van Zuid-Denemarken, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt
Mettler toledo
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.B3259
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.A7030
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.C5670
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.G7021
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.E3889
Merck Millipore, Hellerup, Denmark1.00496.9010Fosfaat gebufferde (pH 6,9) 4% formaldehyde oplossing 
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.H3784
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.P9666
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.P5655
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.M2643
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S2002
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S5886
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.S5761
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.1.06462
Gibco, ThermoFisher Scientific10010015
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.PHR1423
 Sigma-Aldrich, Brøndby, Denmark.Z370525
 Tocris Bioscience, Bristol, UK538944
NikonOp maat gebouwd
Spectra Physics, Mountain View, CA
NikonCFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27
NikonCFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersie) NA 0.75
Hamamatsu, Ballerup, DenmarkH7422P-40
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).ChromaET 460 nm long pass dichroic
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).Semrock FF01-520/35-25 BrightLine filter
AHF analysentechnik AG (Tübingen, Germany).Chroma ET402/15X 
Scotch TM
dekkingsdikte moet overeenkomen met gebruikte objectief op microscoop (#1 of #1.5), alternatief, stel aanpassingskraag in op dekglas

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Briones, A. M., Arribas, S. M., Salaices, M. Role of extracellular matrix in vascular remodeling of hypertension. Curr Opin Nephrol Hy. 19 (2), 187-194 (2010).
  2. Heagerty, A. M., Heerkens, E. H., Izzard, A. S. Small artery structure and function in hypertension. J Cell Mol Med. 14 (5), 1037-1043 (2010).
  3. van den Akker, J., Schoorl, M. J., Bakker, E. N., Vanbavel, E. Small artery remodeling: current concepts and questions. J Vasc Res. 47 (3), 183-202 (2010).
  4. Rizzoni, D., Agabiti-Rosei, E. Structural abnormalities of small resistance arteries in essential hypertension. Intern Emerg Med. 7 (3), 205-212 (2012).
  5. Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: mechanisms and treatment. Hypertension. 59 (2), 367-374 (2012).
  6. Fonck, E., et al. Effect of elastin degradation on carotid wall mechanics as assessed by a constituent-based biomechanical model. Am J Physiol-Heart C. 292 (6), H2754-H2763 (2007).
  7. Chow, M. J., Turcotte, R., Lin, C. P., Zhang, Y. Arterial extracellular matrix: a mechanobiological study of the contributions and interactions of elastin and collagen. Biophys J. 106 (12), 2684-2692 (2014).
  8. Chen, H., et al. Biaxial deformation of collagen and elastin fibers in coronary adventitia. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1683-1693 (2013).
  9. Schriefl, A. J., Schmidt, T., Balzani, D., Sommer, G., Holzapfel, G. A. Selective enzymatic removal of elastin and collagen from human abdominal aortas: uniaxial mechanical response and constitutive modeling. Acta Biomater. 17, 125-136 (2015).
  10. Zeinali-Davarani, S., Wang, Y., Chow, M. J., Turcotte, R., Zhang, Y. Contribution of collagen fiber undulation to regional biomechanical properties along porcine thoracic aorta. J Biomech Eng. 137 (5), 051001(2015).
  11. Mattson, J. M., Turcotte, R., Zhang, Y. Glycosaminoglycans contribute to extracellular matrix fiber recruitment and arterial wall mechanics. Biomech Model Mechan. 16 (1), 213-225 (2017).
  12. Schriefl, A. J., Zeindlinger, G., Pierce, D. M., Regitnig, P., Holzapfel, G. A. Determination of the layer-specific distributed collagen fibre orientations in human thoracic and abdominal aortas and common iliac arteries. J R Soc Interface. 9 (71), 1275-1286 (2012).
  13. Bloksgaard, M., et al. Imaging and modeling of acute pressure-induced changes of collagen and elastin microarchitectures in pig and human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. , (2017).
  14. Dora, K. A., et al. Isolated Human Pulmonary Artery Structure and Function Pre- and Post-Cardiopulmonary Bypass Surgery. J Am Heart Assoc. 5 (2), (2016).
  15. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  16. Roque, F. R., et al. Aerobic exercise reduces oxidative stress and improves vascular changes of small mesenteric and coronary arteries in hypertension. Brit J Pharmacol. 168 (3), 686-703 (2013).
  17. Briones, A. M., et al. Alterations in structure and mechanics of resistance arteries from ouabain-induced hypertensive rats. Am J Physiol-Heart C. 291 (1), H193-H201 (2006).
  18. Briones, A. M., et al. Role of elastin in spontaneously hypertensive rat small mesenteric artery remodelling. J Physiol. 552 (Pt 1), 185-195 (2003).
  19. Arribas, S. M., et al. Confocal myography for the study of hypertensive vascular remodelling. Clin Hemorheol Micro. 37 (1-2), 205-210 (2007).
  20. Gonzalez, J. M., et al. Postnatal alterations in elastic fiber organization precede resistance artery narrowing in SHR. Am J Physiol-Heart C. 291 (2), H804-H812 (2006).
  21. Spronck, B., Megens, R. T., Reesink, K. D., Delhaas, T. A method for three-dimensional quantification of vascular smooth muscle orientation: application in viable murine carotid arteries. Biomech Model Mechan. 15 (2), 419-432 (2015).
  22. Megens, R. T., et al. In vivo high-resolution structural imaging of large arteries in small rodents using two-photon laser scanning microscopy. J Biomed Opt. 15 (1), 011108(2010).
  23. Megens, R. T., oude Egbrink, M. G., Merkx, M., Slaaf, D. W., van Zandvoort, M. A. Two-photon microscopy on vital carotid arteries: imaging the relationship between collagen and inflammatory cells in atherosclerotic plaques. J Biomed Opt. 13 (4), 044022(2008).
  24. Bender, S. B., et al. Regional variation in arterial stiffening and dysfunction in Western diet-induced obesity. Am J Physiol-Heart C. 309 (4), H574-H582 (2015).
  25. Clifford, P. S., et al. Spatial distribution and mechanical function of elastin in resistance arteries: a role in bearing longitudinal stress. Arterioscler Thromb. 31 (12), 2889-2896 (2011).
  26. Martinez-Revelles, S., et al. Lysyl Oxidase Induces Vascular Oxidative Stress and Contributes to Arterial Stiffness and Abnormal Elastin Structure in Hypertension: Role of p38MAPK. Antioxid Redox Sign. 27 (7), 379-397 (2017).
  27. Foote, C. A., et al. Arterial Stiffening in Western Diet-Fed Mice Is Associated with Increased Vascular Elastin, Transforming Growth Factor-beta, and Plasma Neuraminidase. Front Physiol. 7, 285(2016).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive Learning and Segmentation Toolkit. 2011 8th Ieee International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro, , 230-233 (2011).
  30. Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82 (1 Pt 1), 493-508 (2002).
  31. Intengan, H. D., Deng, L. Y., Li, J. S., Schiffrin, E. L. Mechanics and composition of human subcutaneous resistance arteries in essential hypertension. Hypertension. 33 (1 Pt 2), 569-574 (1999).
  32. Saatchi, S., et al. Three-dimensional microstructural changes in murine abdominal aortic aneurysms quantified using immunofluorescent array tomography. J Histochem Cytochem. 60 (2), 97-109 (2012).
  33. Bloksgaard, M., et al. Elastin Organization in Pig and Cardiovascular Disease Patients' Pericardial Resistance Arteries. J Vasc Res. 52 (1), 1-11 (2015).
  34. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  37. Rezakhaniha, R., et al. Experimental investigation of collagen waviness and orientation in the arterial adventitia using confocal laser scanning microscopy. Biomech Model Mechan. 11 (3-4), 461-473 (2012).
  38. Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058(2014).
  39. Bell, J. S., et al. Microstructure and mechanics of human resistance arteries. Am J Physiol-Heart C. 311 (6), H1560-H1568 (2016).
  40. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).
  41. Megens, R. T., et al. Imaging collagen in intact viable healthy and atherosclerotic arteries using fluorescently labeled CNA35 and two-photon laser scanning microscopy. Mol Imaging. 6 (4), 247-260 (2007).
  42. Staiculescu, M. C., et al. Prolonged vasoconstriction of resistance arteries involves vascular smooth muscle actin polymerization leading to inward remodelling. Cardiovasc Res. 98 (3), 428-436 (2013).
  43. Fung, Y. C., Sobin, S. S. The retained elasticity of elastin under fixation agents. J Biomech Eng. 103 (2), 121-122 (1981).
  44. Fung, Y. C. Biomechanics : mechanical properties of living tissues. , 2nd, Springer-Verlag. (1993).
  45. Bakker, E. N., et al. Heterogeneity in arterial remodeling among sublines of spontaneously hypertensive rats. PLoS One. 9 (9), e1107998(2014).
  46. VanBavel, E., Siersma, P., Spaan, J. A. Elasticity of passive blood vessels: a new concept. Am J Physiol-Heart C. 285 (5), H1986-H2000 (2003).
  47. Chen, H., et al. Microstructural constitutive model of active coronary media. Biomaterials. 34 (31), 7575-7583 (2013).
  48. Saez, P., Garcia, A., Pena, E., Gasser, T. C., Martinez, M. A. Microstructural quantification of collagen fiber orientations and its integration in constitutive modeling of the porcine carotid artery. Acta Biomater. 33, 183-193 (2016).
  49. Bellini, C., Ferruzzi, J., Roccabianca, S., Di Martino, E. S., Humphrey, J. D. A microstructurally motivated model of arterial wall mechanics with mechanobiological implications. Ann Biomed Eng. 42 (3), 488-502 (2014).
  50. Schriefl, A. J., Wolinski, H., Regitnig, P., Kohlwein, S. D., Holzapfel, G. A. An automated approach for three-dimensional quantification of fibrillar structures in optically cleared soft biological tissues. J R Soc Interface. 10 (80), 20120760(2013).
  51. Weisbecker, H., Unterberger, M. J., Holzapfel, G. A. Constitutive modelling of arteries considering fibre recruitment and three-dimensional fibre distribution. J R Soc Interface. 12 (105), 20150111(2015).
  52. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based biomechanics of coronary arteries in health and disease. J Biomech. 49 (12), 2548-2559 (2016).
  53. Chen, H., Kassab, G. S. Microstructure-based constitutive model of coronary artery with active smooth muscle contraction. Sci Rep. 7 (1), 9339(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Collagen Elastin MicroarchitectureResistance Artery MechanicsLabel free Fluorescence MicroscopyTwo photon Excitation ImagingElastin AutofluorescenceCollagen Second Harmonic GenerationFiji Image AnalysisIlastik Software AnalysisPressure induced Vascular ChangesExtracellular Matrix Quantification

Gerelateerde artikelen