Methodenartikel

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

DOI:

10.3791/57465

⸱

15 maart 2018

 ,  , 
1Department of Zoology and Physiology and Program in Neuroscience, University of Wyoming

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Xenopus tadpole retinotectal circuit, bestaat uit de retinale peesknoopcellen (RGCs) in het oog welk formulier synapses rechtstreeks op de neuronen in de optische tectum, is een populair model om te bestuderen hoe neurale circuits zelf monteren. De mogelijkheid voor het uitvoeren van de gehele cel patch klem opnames van tectal neuronen en naar record regering van Cambodja-opgeroepen antwoorden, beide in vivo of met behulp van een hele hersenen voorbereiding, heeft geleid tot een grote hoeveelheid hoge-resolutie data over de mechanismen die ten grondslag liggen aan een normale , abnormale, circuit vorming en functie. Hier beschrijven we het uitvoeren van de in vivo voorbereiding, de oorspronkelijke hele hersenen voorbereiding, en een meer recent ontwikkelde horizontale hersenen segment voorbereiding voor het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames van tectal neuronen. Elk preparaat heeft unieke experimentele voordelen. De in vivo voorbereiding kan de opname van de directe reactie van de tectal neuronen op visuele stimuli geprojecteerd op het oog. De hele hersenen voorbereiding zorgt voor de axonen van de regering van Cambodja worden geactiveerd op een zeer gecontroleerde manier, en de horizontale hersenen segment voorbereiding staat opname uit over alle lagen van de tectum.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het retinotectal circuit is het belangrijke onderdeel van het visuele systeem van amfibieën. Het bestaat uit de RGCs in het oog, die hun axonen aan de optische tectum waar ze synaptic verbindingen met postsynaptisch tectal neuronen vormen uitsteken. Het Xenopus tadpole retinotectal circuit is een populaire developmental model neurale vorming en functie te gaan studeren. Er zijn vele kenmerken van de deze tadpole retinotectal circuit, waardoor zij een krachtige experimentele model1,2,3. Een belangrijke kenmerk, en de focus van dit artikel, is de mogelijkheid voor het uitvoeren van hele cel patch klem opnames vanaf tectal neuronen, in vivo of met behulp van de voorbereiding van een hele hersenen. Met een electrofysiologie tuig uitgerust met een versterker die ondersteuning biedt voor spanning - en stroom-clamp opnamefuncties, toestaan hele cel patch klem opnames van een neuron electrofysiologie te worden gekenmerkt op hoge resolutie. Dientengevolge, hebben hele cel patch klem opnames van tectal neuronen in de belangrijkste stadia van retinotectal circuit vorming verstrekt een gedetailleerde en uitgebreide kennis van de ontwikkeling en plasticiteit van intrinsieke4,5 , 6 , 7 en synaptische8,9,10,11 eigenschappen. Het combineren van hele cel patch klem tectal neuron opnamen, de mogelijkheid om uit te drukken van genen of morpholinos van belang in deze neuronen12, en een methode om te beoordelen van visuele rondleiding gedrag via een gevestigde visuele vermijden test13 bevordert de identificatie van de banden tussen moleculen, circuit functie, en gedrag.

Het is belangrijk op te merken dat het type van hoge resolutie, verkregen uit hele cel patch-clamp opnamen gegevens niet mogelijk met behulp van de nieuwere imaging benaderingen zoals de genetische calcium indicator GCaMP6, is omdat hoewel calcium indicatoren de beeldvorming toelaat van calcium dynamiek in grote populaties van neuronen tegelijkertijd, er is geen directe of voor de hand liggende manier waarop de specifieke elektrische parameters kunnen worden verkregen door het meten van delta fluorescentie in de waarin, en er geen manier om spanning is klem het neuron om te meten stroom-spanning-relaties. Duidelijk deze twee verschillende benaderingen, elektrofysiologische opnames en calcium imaging, niet-overlappende troeven bezitten en genereren van verschillende typen gegevens. De beste aanpak hangt dus af van de specifieke experimentele vraag aangepakt.

Hier beschrijven we onze werkwijze voor het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames van neuronen van de tadpole optic tectum met behulp van een in vivo voorbereiding, hele hersenen voorbereiding, en een nieuwere bewerkt hele hersenen voorbereiding die is ontwikkeld in ons lab14 . In de sectie vertegenwoordiger resultaten tonen we de experimentele voordelen van elk preparaat en de verschillende soorten gegevens die kan worden verkregen. De grenzen en de sterke punten van de verschillende preparaten, alsmede tips voor het oplossen van problemen, zijn opgenomen in de sectie discussie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Wyoming. Alle procedures, met inbegrip van elektrofysiologische opnames, worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, ongeveer 23 ° C. Alle methoden die hier worden beschreven zijn geoptimaliseerd voor het opnemen van de tectal neuronen van kikkervisjes tussen ontwikkelingsstadium 42 en 49 (geënsceneerd volgens Neiuwkoop en Faber15).

1. in Vivo voorbereiding

  1. Anesthetize de tadpole.
    1. Plaats de tadpole in een kleine petrischaal met Steinberg's oplossing met 0,01% MS-222 voor ongeveer 5 min.
      Opmerking: MS-222 aka "tricaïne" is een gemeenschappelijk vissen en amfibieën verdoving. De kikkervisjes zijn opgegroeid in de Steinberg's oplossing in mM: 0.067 KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES.
    2. Zorg ervoor de tadpole diep verdoofde (niet-reagerende en langer zwemmen) voordat u verdergaat met stap 2.
  2. Beveilig de narcose tadpole naar een blok van de ondergedompelde silicone op de verdieping van de schotel ontleden/opname.
    1. Gebruik een pipet wegwerp overdracht om het verdoofde tadpole naar een dissectie/opname schotel met externe opnameoplossing (115 mM van NaCl, KCl, 2 mM 3 mM CaCl,2, 3 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM van glucose; Breng pH op met behulp van de 7,25 10 N van NaOH, osmolariteit 255 mOsm).
      1. Om te minimaliseren van spontane spier twitches, voeg de acetylcholine receptor blocker, tubocurarine (100 µM) aan de externe-oplossing. (Meestal wordt dit gedaan met behulp van een 200 µL Pipetteer 100 µL van een 10 mM tubocurarine voorraad aan 10 mL externe oplossing toevoegen).
    2. Met behulp van insect pins, veilig de tadpole, dorsale zijde, naar een verzonken blok van silicone-elastomeer (Zie Materialen tabel voor details zoals 184 van Sylgard), die heeft zijn gelijmd aan de vloer schotel ontleden.
      Opmerking: De plaatsing van de pennen is van cruciaal belang: plaats ze aan weerszijden van de hersenen, voldoende caudal om te voorkomen dat de afferent axonen van de regering van Cambodja spietsen dat project uit het oog en de hersenen net anterior to de optische tectum (Figuur 1A) invoeren.
  3. Filet de hersenen langs de middellijn.
    1. Voor een duidelijke weergave van de hersenen, verwijder de huid over de hersenen door het maken van een oppervlakkige incisie langs de middellijn met behulp van een steriele naald 25-G.
    2. Filet pur de hersenen langs dezelfde middellijn as door het invoegen van de naald in de neurale buis en zachtjes naar boven trekken (dorsally) zodanig dat het dorsale gedeelte van de buis wordt netjes gesneden (afgehakte) terwijl het verlaten van de vloerplaat intact (Figuur 1B).
      Opmerking: Het is belangrijk dat de vloerplaat van de neurale buis intact gelaten worden omdat de afferent sensorische input Voer de tectum via vloerplaat.
  4. Verwijder de doorzichtige ventriculaire membraan dat betrekking heeft op de tectal neuronen.
    1. De opname-schotel naar de elektrofysiologie rig en een gebroken glas Pipetteer tip gebruiken om het ventriculaire membraan overliggende het tectal neuron cel organen. Breken de tip door het licht over een delicate taak wisser te slepen.
    2. Schroef de pipet in de pipet houder en lager tot de optische tectum via de micromanipulator.
    3. Gebruik de gebroken pipet om schil de ventriculaire membraan uit de buurt van de tectum.
      Opmerking: Het is niet nodig om het membraan van de gehele tectum; een klein venster zal volstaan en bieden toegang tot tal van neuronen.
  5. Het verkrijgen van de hele cel patch klem opnames.
    Opmerking: De aanpak van dit punt naar voren is vergelijkbaar met het uitvoeren van hele cel patch klem opnames van muis hersenen segmenten, zoals beschreven in Segev, et al. 16 (Figuur 1C).
  6. Het opnemen van het tectal neuron reacties op een heel veld lichtflits op het netvlies geprojecteerd.
    1. Om een heel veld lichtflits projecteren op het netvlies, plaatst u een optische vezel grenzend aan de de tadpole oog. Op het andere uiteinde van de optische vezel is een LED in overeenstemming met een variabele weerstand die het mogelijk maakt voor de lichte luminantie worden gecontroleerd. Trigger de LED door de digitale uitgang van de versterker. Op deze manier hele veld flitsen van verschillende intensiteiten van licht kunnen worden opgenomen (Figuur 4A)

2. de whole Brain voorbereiding

  1. Voer stap 1.1 tot en met 1.3.
    Opmerking: Er is geen behoefte tubocurarine in de externe oplossing voor deze voorbereiding.
  2. Isoleren van de hersenen.
    1. Gebruik een 25-G naald te verbreken van de hindbrain(Figuur 2).
    2. Om te isoleren van het hele brein van de tadpole, lopen voorzichtig de naald onder de hersenen, in een caudal-naar-rostraal richting te verbreken alle laterale en ventrale bindweefsel en zenuwvezels.
  3. Beveilig de hersenen naar een blok van silicone-elastomeer.
    1. Zodra volledig bevrijd, beveiligde de hersenen naar een blok van silicium elastomeer door het plaatsen van een pincode via een van de bulbus bollen en een andere pincode via het hindbrain (Figuur 2B). Dit is de optimale configuratie voor opnemen vanaf de tectal neuronen.
  4. Verplaats de schotel met de voorbereiding van de vastgezette hele hersenen buiten de ontleden om de elektrofysiologie tuig. Verwijder de ventriculaire membraan met behulp van een precisiepipet gebroken glas zoals beschreven in stap 1.4.
  5. Plaats een bipolaire stimulerende elektrode op de optic opticum (waar de axon traktaten uit elk van beide ogen kruisen op de veroorzaakt) als u wilt direct activeren de axonen van de regering van Cambodja.
    1. Plaats de bipolaire stimulerende elektrode rostraal en bijna grenzend aan, de grote middelste ventrikel. De optische opticum ligt onmiddellijk rostraal van de grote middelste ventrikel (Figuur 2B).
      1. Zachtjes lager het stimulerende elektrode naar beneden op de optic opticum zodanig dat een kleine deuk wordt gevormd in het weefsel. De bipolaire elektrode wordt gedreven door een pulse stimulator waarmee de kracht van de stimulatie juist worden gecontroleerd.
  6. Voert u de hele cel patch klem opname (Figuur 2C) zoals beschreven door Segev, et al.. 16

3. horizontale Brain Slice voorbereiding

  1. Voer stap 2.1 tot 2.3.
  2. Gebruik een scheermesje de meest laterale vierde (welke in vivo correspondeert met de meest dorsale vierde) van de ene kant van een optische tectum accijnzen. Deze verlaging is evenwijdig aan de rostraal-caudal vlak zoals aangegeven in Figuur 3Agemaakt.
  3. Opnieuw vastzetten van de hersenen naar de kant van de silicone-elastomeer met de gesneden kant naar boven (zodat de waarin en de neuropil kunnen rechtstreeks worden benaderd voor opname) en de ventriculaire oppervlak van de hersenen geconfronteerd weg van de silicone-elastomeer blok (Figuur 3 B) (zodat een bipolaire elektrode kan worden geplaatst op de optic opticum).
  4. Voert u de hele cel patch klem of lokale gearchiveerde potentiële opname (Figuur 3C) zoals beschreven door Segev, et al.. 16

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als u wilt opnemen van licht-opgeroepen reacties wordt een hele veld lichtflits geprojecteerd op het netvlies terwijl de resulterende reactie van individuele tectal neuronen (Figuur 4A) wordt geregistreerd. Dit bijzondere protocol is bedoeld voor het meten van zowel de reactie van het neuron aan het licht het op ("On" reactie) en vervolgens uitschakelen 15 s later voor het meten van de "Off reactie." Tectal neuronen vertonen meestal solide aa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle methoden die worden beschreven in dit werk zijn geoptimaliseerd voor het opnemen van de tectal neuronen van kikkervisjes tussen ontwikkelingsstadium 42 en 49 (geënsceneerd volgens Neiuwkoop en Faber15). Door stage 42, de kikkervisjes zijn groot genoeg en voldoende ontwikkeld, zodat de insecten pinnen aan weerszijden van de hersenen voor in vivo opnames en voor het uitvoeren van de gehele hersendissectie kunnen worden geplaatst. In eerdere stadia, wanneer de kikkervisjes in wezen twee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondersteund door de NIH-subsidie SBC COBRE 1P20GM121310-01.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Dissectiemicroscoop
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAlgemeen amfibieënanestheticum
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3Wordt gebruikt voor het bereiden van Steinberg's oplossing en externe oplossing
Potassium Chloride (KCl)Fisher ScientificP217-500Wordt gebruikt voor het bereiden van Steinberg's oplossing en externe oplossing
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGWordt gebruikt voor het bereiden van Steinberg's oplossing en externe oplossing
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GWordt gebruikt voor het bereiden van Steinberg's oplossing  
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Wordt gebruikt voor het bereiden van Steinberg's oplossing
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GWordt gebruikt voor het bereiden van externe opnameoplossing
Magnesium Chloride (MgCl2)J.T. Baker2444-01Wordt gebruikt voor het bereiden van externe opnameoplossing
D-glucose AnhydrousMallinckrodt Chemicals6066-04Wordt gebruikt voor het bereiden van externe opnameoplossing
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379Nicotinische acetylcholine receptor antagonist
Insect PinsFine Science Tools26002-10Roestvrijstalen pennen met een diameter van 0,1 mm
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning761028Vooraf gewogen kit met monomeer en uitharder
Steriele polystyreen petrischaal - 60x15mmFisher ScientificAS4052Kleine petrischalen
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)BD305122Spuitnaalden
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe BD309659Wegwerpspuiten, steriel
Borosilicaat pijpglasSutter InstrumentBF150-86-10HPGetrokken naar gewenste specificaties met behulp van een pijpglastrekker
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97Maakt micropipetten voor elektrofysiologisch opnemen
Kimwipes Kimtech doekjesKimberly-Clark34120Veerkrachtige doekjes zonder pluisjes voor delicate taken
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BHuidige klemmen en spanningsklem voor hoofdfase
MP-285 gemotoriseerde manipulator met tafeltopcontrollerSutter InstrumentMP-285/TControle voor hoofdfase op elektrofysiologie rig
Fiber-Coupled LED (Groen)ThorlabsM530F2Vezeloptische kabel gekoppeld aan groene LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)FHC30207Bipolare stimulerende elektrode
ISO-Flex StimulatorA.M.P.I. (Israël) Contacteer fabrikantFlexibele stimulusisolator
Axon Instruments 700B Multipatch VersterkerMolecular Devices2500-0157Versterker voor spannings- en stroomklemopname 
Digidata 1322A digitizerMolecular Devices2500-135Gegevensverzamelsysteem voor elektrofysiologisch opnemen
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Microscoop voor elektrofysiologie
Micro-g LabtafelTMC63-533Luchttafel voor elektrofysiologie microscoop
Inspiron 620 Personal Desktop Computer met Windows 7 64-bitDellD06D001Computer die elektrofysiologie software gebruikt
c2400 CCD cameraHamamatsu70826-5Ladebepaald apparaat camera voor elektrofysiologie beeldvorming
7 O'Clock Super Platinum Stainless RazorbladesGilletteCMM01049Platinum-gecoate roestvrijstalen scheermessen
Transfer PipettenFisher Scientific13-711-7MWegwerp Polyethyleen transferpipetten

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vivo preparatiepreparatie van het gehele breinhorizontale brensnijplakregistraties uit het opticum tectumactivatie van ganglioncellen van het netvliesbipolaire stimulerende elektrodeblok van siliconenelastomeerexterne registratie oplossing

Gerelateerde artikelen