Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn

10.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57466

⸱

10 augustus 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Postgraduate institution, Guangzhou Medical University, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, 3Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopaedic Engineering, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 4Department of Chemistry, Chinese University of Hong Kong, 5Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een eenvoudige en economische protocol voor het eenvoudig isolatie en zuivering van mesenchymale stamcellen uit Nieuw-Zeeland wit konijn gewrichtsvocht.

Samenvatting

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn de bron van de belangrijkste cel voor cel-gebaseerde therapie. MSCs van articulaire holte gewrichtsvocht zou kunnen worden gebruikt voor weefselengineering van kraakbeen. MSCs van gewrichtsvocht (SF-MSCs) zijn veelbelovende kandidaten voor articulair regeneratie beschouwd heeft, en hun potentiële therapeutische voordeel hen een belangrijk onderzoeksonderwerp van laat. SF-MSCs uit de holte van de knie van het Nieuw-Zeeland wit konijn kunnen worden ingezet als een geoptimaliseerde translationeel model te beoordelen van menselijke regeneratieve geneeskunde. Door middel van CD90 gebaseerde magnetische geactiveerde cel sorteren (MACS) technologieën, dit protocol met succes verkrijgt konijn SF-MSCs (rbSF-MSCs) van dit model konijn en volledig toont verder het fenotype van de MSC van deze cellen door het inducerende hen om te differentiëren naar Botcellen, adipocytes en chondrocyten. Daarom kan deze aanpak worden toegepast in het onderzoek van de biologie van de cel- en weefseltechnologie met behulp van eenvoudige apparatuur en procedures.

Inleiding

MSCs hebben gesuggereerd als een waardevolle bron voor regeneratieve geneeskunde, vooral voor kraakbeen letsels. MSCs, met inbegrip van de chondrocyten, botcellen, adipocytes, skelet myocytes en viscerale stromale cellen, expand in grote lijnen de gebieden voor stamceltransplantatie vanwege hun hoge uitbreiding tarief en multi lineage differentiatie potentiële1. MSCs kunnen worden geïsoleerd uit de skeletal muscle, synovia, beenmerg en adipeus weefsel2,3,4. Bevindingen hebben ook confirmed de aanwezigheid van MSCs in het gewrichtsvocht, en vorige onderzoek synoviale vloeistof afkomstige MSCs (SF-MSCs) heeft geïdentificeerd als veelbelovende kandidaten voor articulair regeneratie5,6.

Onderzoek en preklinische experimenten met menselijke specimens zijn echter onderworpen aan veel ethische kwesties. In plaats daarvan, konijnen geweest en blijven de meest gebruikte diersoorten om aan te tonen dat de transplantatie van MSCs kraakbeenletsels kan repareren. In de afgelopen jaren een stijgend aantal onderzoekers hebben bestudeerd konijn mesenchymale stamcellen (rbMSCs) beide in vitro en in vivo, als deze cellen zijn vergelijkbaar met menselijke MSCs in hun cellulaire biologie en weefsel fysiologie. Ook zijn de rbMSCs geschikt voor het vasthouden aan kunststofoppervlakken, spindel-fibroblast morfologie in menselijke MSCs weergeven. Bovendien, konijn mesenchymale monsters zijn eenvoudig en gemakkelijk te verkrijgen van7. Bovendien, zijn de meest cruciale punten dat rbMSCs express oppervlakte markers, zoals CD44, CD90 en CD105, en dat de potentiële multi lineage-differentiatie is bewaard gebleven, die is in overeenstemming met de criteria voor de identificatie van MSC populaties als gedefinieerd door de International Society for cellulaire therapie8,9. In het bijzonder de synoviale vloeistof chondroprogenitors staat niet-hypertrofische chondrogenesis wanneer geïnduceerd door TGF-β1, waardoor ze geschikt mobiele bronnen voor fenotypische articulair kraakbeen regeneratie10,11, zijn 12.

Het isolement van de SF-MSCs verschilt echter sterk van andere weefsels, met inbegrip van de navelstreng, adipeus weefsel, perifeer bloed en beenmerg. Momenteel zijn de meest voorkomende benaderingen voor de zuivering en sortering van SF-MSCs stroom cytometry en immunomagnetic kraal gebaseerde sorteren, hoewel de stroom cytometry methode een specifieke omgeving en zeer dure instrumenten13 vereist.

Dit artikel presenteert een procedure voor het eenvoudig en minimaal invasieve collectie van monsters van synoviale vloeistof uit Nieuw-Zeeland witte konijnen. Tijdens de procedure, de rbSF-MSCs zijn stabiel uitgevouwen in vitro en vervolgens geïsoleerd met CD90 positieve magnetische kraal gebaseerde procedures. Tot slot, het protocol laat zien hoe MSCs met een hoge zuiverheid en de levensvatbaarheid van de geoogste cel bronnen verkrijgen.

In dit protocol worden de geïsoleerde rbSF-MSCs gekenmerkt op basis van hun morfologie, de expressie van specifieke markers en pluripotent voor stamcellen. Stroom cytometry gebaseerde immunophenotyping blijkt een aanzienlijke positieve uitdrukking van CD44 en CD105, overwegende dat de uitdrukking van CD45 en de CD34 negatief is. Tot slot, een in vitro assay voor rbSF-MSCs toont de differentiatie van het osteogenic, adipogenic en chondrogenic van deze cellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd met inachtneming van de richtsnoeren inzake regionale ethische Commissie, en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van Shenzhen tweede People's Hospital, Universiteit Shenzhen.

1. isoleren en cultuur van de rbSF-MSCs

  1. Voorbereidingen voor de dierlijke procedure
    1. Bereiden van vrouwelijke Nieuw-Zeeland schouderfunctie witte konijnen voor de inzameling van rbSF-MSCs. uitvoeren van een klinisch onderzoek van de konijnen een dag voorafgaand aan de narcose en arthrocentesis procedure.
      Opmerking: er zijn lichamelijke onderzoeken dient gewicht (2.0-2.5 kg), geslacht (vrouw), en lichaamstemperatuur, ademhaling en hartslag. Met de parameter intervallen voor klinisch gezonde konijnen zijn 30-50 min. voor ademhalingsfrequentie, 220-280 min voor hartslag en 38-39 ° C voor lichaamstemperatuur.
    2. Snel de dieren gedurende 6 uur voordat de verdoving.
  2. Voorbereidingen en de procedure voor de dierlijke anesthesie
    1. Beperken van het konijn met een kooi (Zie Tabel of Materials), en dan 3% pentobarbital natrium te injecteren in de ader van de marginale oor bij een dosis van 1 mL/kg voor de narcose.
    2. Plaats het konijn in een comfortabele dorsal-lig positie.
    3. Het volgen van de ademhaling, hartslag en lichaamstemperatuur van het konijn tijdens anesthesie.
    4. Oogheelkundig zalf op zijn ogen gebruiken om te voorkomen dat droogte tijdens anesthesie.
    5. De diepte van de verdoving na Guedel de classificatie14te beoordelen.
  3. Voorbereiding voor MSCs isolatie en teelt
    1. Voorbereiden om te cultiveren rbSF-MSCs, 500 mL commerciële kweekmedium (Zie Tabel van materialen) aangevuld met 10% commerciële aanvulling (Zie Tabel of Materials), 10% foetale runderserum (FBS), en 1% penicilline-streptomycine.
    2. Incubeer bij 37 ° C in een waterbad voedingsbodem.
    3. 500 mL fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) voorbereiden van isolatie van de cel en de cel wassen.
    4. 100 mL isotone zoutoplossing voorbereiden op de knie holte arthrocentesis procedure.
  4. Collectie van articulaire synoviale omkaderd uid van de knie van het konijn
    1. Selecteer een gebied ongeveer 5 x 5 cm in omvang rond de knie en scheren van het haar konijn uit dit gebied met behulp van een elektrisch scheerapparaat van veiligheid.
    2. Afwisselend, Desinfecteer de procedure site 3 x met Povidon jodium oplossing en 75% ethanol. Vervolgens passen steriele gordijnen nadat het gebied grondig is opgedroogd.
    3. Injecteer 1-2 mL isotone zoutoplossing, met behulp van een steriele hypodermische spuit (2 mL), in de gezamenlijke holte van de knie van de laterale articulaire ruimte, bewegen van de knie 3-4 x, en vervolgens zuigen uit alle de synoviale vloeistof bij kamertemperatuur.
    4. Filtreer de synoviale fluid door een 40 µm nylon cel zeef te verwijderen elke puin binnen 4 uur.
  5. Cultuur van de rbSF-MSCs
    1. Het verzamelen van de gefilterde fluid in 50 mL centrifuge buizen en centrifugeer bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder het supernatant na het centrifugeren, wassen van de pellet met PBS resuspendeer de pellet met het volledige kweekmedium en vervolgens plaat het medium in 100 mm gerechten.
    3. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2gerechten.
    4. Na 48u, vullen de gerechten met verse medium voor het verwijderen van niet-aanhanger cellen. Vervang het medium tweemaal per week voor 2 weken als passage 0 (P0).
      Opmerking: Er dient ongeveer 1 x 104 Adherente cellen. Levensvatbare cellen/ml in SF zijn ongeveer 2 x 102/mL.
    5. Na 14 dagen na het eerste laagje, moeten veel koloniën hebben gevormd in de cultuur-gerechten. Selecteer de kolonies die groter zijn dan 2 mm in diameter. Markeren waar de geselecteerde kolonies bevinden zich door het traceren van hun omtrek aan de onderkant van de schotel.
    6. Gooi de kolonies < 2 mm breed, met behulp van cel schrapers. De geselecteerde kolonies met ongeveer 5 µL van 0,25% trypsine, met behulp van een klonen cilinder, verteren en de koloniën overbrengen in een nieuwe schotel als passage 1 (P1).
  6. Post-operatieve dierenverzorgers
    1. Volg institutionele operationele standaardprocedures voor postoperatieve bewaking en herstel van anesthesie.
    2. Volgen de vitale tekenen van het konijn iedere 10 minuten totdat het bewustzijn heeft herwonnen. Daarna kopieert u het bewuste dier naar de kooi. Een konijn dat heeft ondergaan chirurgie aan het gezelschap van andere dieren tot het volledig is hersteld niet terugkeren.
    3. Na operatie, desinfecteren van de site met 0,1% Povidon jodium, 2 x per dag gedurende 3 dagen.

2. CD90-positieve magnetische geactiveerd cel sorteren (MACS) van de rbSF-MSCs en primaire cultuur

  1. Bereiding van de monsters
    1. Wanneer de cellen bereiken rond 80% confluentie, gecombineerd het medium, en voeg vervolgens 1-2 mL van 0,25% trypsine-EDTA aan elk gerecht.
    2. Incubeer de gerechten voor 2-3 min om mobiele-detachement.
    3. Zodra de cellen worden losgemaakt, voeg een gelijke hoeveelheid van het kweekmedium aan de inactivering van de trypsine.
    4. De celsuspensie passeren een 40 µm cel zeef, Vang het filtraat op in een tube van 15 mL en draai vervolgens beneden de cellen bij 600 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Resuspendeer de pellet cel in MACS met buffer (PBS, pH 7,2, 0,5% bovien serumalbumine en 2 mM EDTA) en dan het aantal cellen te tellen.
  2. Magnetische etiketten
    Opmerking: Sorteren de rbSF-MSCs met een magnetische-geactiveerde cel Sorteren kit met kolommen, een stand, en scheidingstekens (Zie Tabel van materialen).
    1. Het nummer van de cel met behulp van een hemocytometer te bepalen.
    2. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Volledig gecombineerd het supernatant.
    3. Voeg 80 µL van resuspensie buffer per 107 totaal aantal cellen.
    4. Voor 107 totaal aantal cellen, Voeg 20 µL van microbeads geconjugeerd met een monoklonaal anti-konijn CD90 antilichaam.
    5. Meng de magnetische kralen en cellen gelijkmatig in de buizen, dan hen bij 4 ° C gedurende 15 min. in het donker uit te broeden.
    6. Voeg 1 mL buffer per 107 cellen aan de buis en het vervolgens Centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C te wassen van de cellen. Verwijder het supernatant na het centrifugeren.
    7. Resuspendeer de pellet in 500 µL van buffer per 107 cellen.
  3. Magnetische scheiding
    1. De kolom met de vleugels van de kolom aan de voorzijde in het magnetisch veld van de Magneet separator plaatsen.
    2. Spoel de kolom magnetische scheidingsteken (MS) met 500 µL van de buffer per 107 cellen.
    3. Spoel de suspensie van één cel in de kolom. Laat de negatieve cellen passeren van het magnetisch veld te ontdoen van deze labelloze cellen.
    4. Was de kolom 1-2 x met 500 µL van de buffer per 107 cellen en gooi de doorstroming.
    5. Breng de kolom in een centrifugebuis (15 mL).
    6. 1 mL van de buffer per 107 cellen toevoegen aan de kolom en vervolgens onmiddellijk duw de zuiger in de kolom te spoelen van de magnetisch gelabelde cellen.
    7. Herhaal de bovengenoemde procedure met een tweede MS-Column om de zuiverheid van CD90+ cellen, die de eluted fractie kunnen verrijken.
    8. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 × g gedurende 10 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer het met het kweekmedium.
  4. Cultuur van de CD90+ rbSF-MSCs
    1. Inoculeer cellen in 100 mm gerechten na het magnetische geactiveerde cel sorteren.
    2. Incubeer bij 37 ° C in een broedstoof bevochtigde cel met 5% CO2gerechten.
    3. Wanneer de samenvloeiing van de 80-90% van de primaire cultuur wordt bereikt, op ongeveer 7-10 dagen, verteren de Adherente cellen met 0,25% trypsine-EDTA en passage hen bij een verdunning 1:2 te maken passage 2 (P2).
    4. Gebruik dezelfde methode om door te geven van de cellen aan de passage 3 (P3), die kunnen worden gebruikt voor het in vitro testen.
      Opmerking: Na de subcultuur en zuivering, ongeveer 1 x 107 rbSF-MSCs worden verkregen.

3. identificatie van rbSF-MSCs

  1. Oppervlakte marker bevestiging van de rbSF-MSCs door stroom cytometry
    1. Wanneer de MSCs 80-90% heuvels op P3, wassen van de cellen met PBS en behandelen met 0,25% 1 mL trypsine-EDTA. Vervolgens, Incubeer de MSCs bij 37 ° C gedurende 2-3 minuten totdat de cellen zijn vrijstaand.
    2. Oogsten van de cellen met behulp van 10 mL PBS, ze vervolgens overbrengen naar een conische buis (15 mL) en centrifugeer ze bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Gooi het supernatant. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van PBS en breng dit in een 1,5 mL-buis.
    4. Incubeer een 1:100 verdunning van het FITC-geconjugeerd en PE-geconjugeerde antilichamen (isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) gedurende 1 uur in het donker bij 4 ° C.
    5. Centrifugeer dit mengsel bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de cellen tweemaal met PBS door centrifugeren bij 300 × g gedurende 5 minuten elke keer wassen. Gooi het supernatant.
    6. Resuspendeer de cellen in 500 µL van PBS, de celsuspensie overboeken naar een ronde-onderkant-buis (5 mL) en analyseren met behulp van een cytometer stroom.
      Opmerking: Verwerven gegevens over een cytometer uitgerust met twee kanalen van de fluorescentie: 533/30 en 585/40. Elke isotype fluorescentie, het besturingselement isotype kruisspanning passende laser, en stel de minimale intensiteit vereist voor het verkrijgen van een fluorescentie-histogram waarin zowel linker- en rechterrand van de piek. Verzamel minimaal 10.000 gebeurtenissen voor de statistische analyses.
  2. Multidifferentiation van de rbSF-MSCs
    Opmerking: Gebruik P3 rbSF-MSCs voor de tests in vitro multidifferentiation.
    1. Osteogenic differentiatie
      1. Bereiden van het medium osteogenic inductie: DMEM basic (1 x) met 50 mM van L-ascorbinezuur zuur-2-fosfaat, 10 mM van α-glycerophosphate en 100 nM van dexamethason.
      2. Zaad van de cellen op 103 cellen/cm2 in een 6-well weefselkweek plaat en cultuur hen in het medium osteogenic inductie.
      3. Wijzig het inductie-medium om de 3 dagen voor 3 weken.
      4. Herstellen van de cellen met de 4% formaldehyde gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, nadat de differentiatie is voltooid, de cellen vlek met 1% Alizarine rood voor 5 minuten, en daarna wassen ze 3 x met PBS15.
    2. Adipogenic differentiatie
      1. Bereiden van het medium van de inductie adipogenic: DMEM basic (1 x), bestaande uit 100 mM indomethacin, 10 mg/mL recombinante menselijke insuline, 1 mM van dexamethason en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine.
      2. De P3 rbSF-MSCs voor 3 weken in het medium van de inductie adipogenic behandelen.
      3. Na 3 weken, vlek de neutrale lipide vacuolen olie Red O met de differentiatie van de adipogenic bevestigen. Bevestigen van de cellen in een 4% formaldehyde-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, en dan was ze 3 x met PBS16.
    3. Chondrogenic differentiatie
      1. Bereiden van het medium van de inductie chondrogenic: DMEM basic (1 x), bestaande uit de 10 ng/mL TGFβ1, 1% zijn supplement, L-proline, 100 nM van dexamethason, 50 mM van L-ascorbinezuur zuur-2-fosfaat, en 1 mM van natrium pyruvaat 0.35 mM.
      2. Gebruik pellet kweken voor de chondrogenic-inductie. Centrifugeer 5 × 105 P3 rbSF-MSCs bij 1500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten in een polypropyleen buis (15 mL) vormen een pellet.
      3. De pellets voor 3 weken met het medium van de inductie chondrogenic cultuur.
      4. Wijzig het medium om de 3 dagen voor 3 weken.
      5. Na 3 weken inductie, insluiten de cel pellet met paraffine, deel het in 4 mm plakjes en vlek met behulp van 0,1% toluïdine blauw gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur17.
  3. Totaal RNA extractie en analyse door kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (qRT-PCR)
    1. Isolaat totaal RNA van cellen na 3 weken differentiatie inductie met behulp van de commerciële RNA extractie kit (Zie Tabel van materialen).
      1. Verwijder het kweekmedium in de cultuur-schotel en voeg vervolgens 1 mL van isolatie reagens.
      2. Lyse de cellen door herhaalde pipetteren totdat de oplossing is een homogeen. Na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
      3. Breng de cel lysate in een tube van 1,5 mL microcentrifuge.
      4. Voeg 100 µL van chloroform, schud het met de hand 15 x en Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
      5. Centrifugeer de buis bij 12.000 × g gedurende 15 min bij 4 ° C. Breng het supernatant in een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.
      6. Voeg 500 µL van isopropanol en neerslag van het RNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
      7. Centrifuge op 12.000 × g voor 10 minat 4 ° C. De RNA-pellet moet worden weergegeven aan de onderkant van de buis.
      8. Verwijder het supernatant en voeg vervolgens 500 µL van 75% ethanol. Kort draaien de buis gedurende enkele seconden om te wassen van de RNA-pellet. Centrifugeer het bij 7.500 × g gedurende 5 min bij 4 ° C.
      9. Verwijder de resterende ethanol.
      10. Los van de RNA-pellet in 10 µL van DEPC water en plaats de buizen op ijs.
    2. Omgekeerde transcriberen totaal RNA in cDNA met een DNA-herstelsynthese kit (Zie Tabel van materialen).
      Opmerking: Alle de volgende procedures uitvoeren op ijs.
      1. De master mix van omgekeerde transcriptie voor te bereiden.
      2. Voeg 25 µL van RNA DNase behandeld aan elke buis met 1 microgram van RNA.
      3. Incubeer het mengsel bij de volgende temperaturen met behulp van een PCR thermische cycler: 26 ° C gedurende 10 min (voor de willekeurige hexamers te gloeien), 42 ° C voor 45 min (reverse transcriptie) en 75 ° C gedurende 10 minuten (aan de inactivering van de reverse-transcriptase).
      4. Onmiddellijk de resulterende cDNA door kwantitatieve PCR in real time analyseren of opgeslagen bij-20 ° C.
    3. Het gen expressie analyses uitvoeren met een kwantitatieve real-time PCR-systeem.
      1. QRT-PCR Master Mix gebruiken (Zie Tabel of Materials) voor het uitvoeren van PCR. De PCR inleidingen voor de GAPDH, Runx2, Agg en PPARγ zijn vermeld in tabel 1.
      2. Bereken met behulp van de methode van deΔΔCT 2−genexpressie.
      3. Voeren een statistische analyse met behulp van statistische standaardsoftware. Gebruik een onafhankelijke sample t-test te vergelijken van de groep betekent.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Isolatie, zuivering en cultuur van de rbSF-MSCs:
Dit protocol maakt gebruik van MACS te isoleren rbSF-MSCs, gebaseerd op de expressie van de MSC oppervlakte markering CD90. Een processtroomdiagram rbSF-MSCs isolatie, zuivering, karakterisering en het in vitro cultuur protocol is afgebeeld in Figuur 1.

De morfologie van de cel na magnetische geactiveerde cel sorte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het bestaan van MSCs in gewrichtsvocht biedt een alternatief voor cel-gebaseerde therapie. Eerdere studies hebben aangetoond dat letsel sites bevatten hogere hoeveelheden mesenchymale stamcellen in hun gewrichtsvocht, die positief kunnen worden gecorreleerd met de periode van na letsel5. De MSCs in gewrichtsvocht kunnen zinvol zijn om weefsel voor het verbeteren van de spontane genezing na een letsel18,19. De klinische toepassing van SF-MS...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd financieel ondersteund door de volgende subsidies: de Natural Science Foundation van China (nr. 81572198; Nr. 81772394); het Fonds voor hoog niveau medische Discipline bouw van Universiteit Shenzhen (nr. 2016031638); de medische Research Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. A2016314); en Shenzhen wetenschaps- en technologieprojecten (nr. JCYJ20170306092215436; Nr. JCYJ20170412150609690; Nr. JCYJ20170413161800287; Nr. SGLH20161209105517753; Nr. JCYJ20160301111338144).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagenten
MesenGroStemRDMGro-500 1703Warm in 37 °C water bad voor gebruik
MesenGro SupplementStemRDMGro-500 M1512Component van MSCs kweekmedium
DMEM basicGibco Inc.C11995500BTMSCs differentiatiemedium
Isotone zoutoplossingLitai, China5217080305Reagens voor gewrichtspuncieproceduur
Fosfaat-bufferoplossing (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BPBS, vrij van Ca2+/Mg2+
Foetale boviene serum (FBS)Gibco Inc.10099-141Component van MSCs kweekmedium
PovidonjooplossingGuangdong, China150605Sterilisatiemiddel
75% ethanolLircon, China170917Sterilisatiemiddel
0,25% Trypsine/EDTAGibco Inc.25200-056Celdissociatiereagens
1% Penicilline-StreptomycineGibco Inc.15140-122Component van MSCs medium
MACS Running BufferMiltenyiBiotec5160112089Bevat fosfaat-bufferoplossing (PBS), 0,5% bovien serumalbumine(BSA), en 2 mM EDTA
CD90 antilichaam geconjugeerd MicroBeadsMiltenyiBiotec5160801456Voor magnetisch geactiveerde celsortering
NatriumpyrovaatSigma-AldrichP2256Component van MSCs chondrogene differentiatie
DexamethasonSigma-AldrichD1756Component van MSCs osteogene differentiatie
ITSBD3543521%, Component van MSCs chondrogene differentiatie
L-prolineSigma-AldrichP56070,35 mM, Component van MSCs chondrogene differentiatie
L-ascorbinezuur-2-fosfaatSigma-AldrichA896050 mM, Component van MSCs chondrogene differentiatie
3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-AldrichI58790,5 mM, Component van adipogene differentiatie
IndomethacineSigma-AldrichI7378100 mM, Component van adipogene differentiatie
TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL, Component van MSCs chondrogene differentiatie
α-glycerofosfaatSigma-AldrichG6751Component van MSCs osteogene differentiatie
CD34 Polyklonaal Antilichaam, FITC GeconjugeerdBiossbs-0646R-FITCHematopoietische stamcelmarker
Muis anti-konijn CD44Bio-RadMCA806GAThy-1 membraan glycoproteïne (MSCs marker)
CD45 (Monoklonaal Antilichaam)Bio-RadMCA808GAHematopoietische stamcelmarker
CD105 antilichaamGenetexGTX11415MSCs marker
IsopropylalcoholSigma-AldrichI9030Precipiteert RNA extractie organische fasen
TrichloormethaenWenge, China61553Extract totaal RNA
TrizolInvitrogen15596-018Isoleer totaal RNA
SYBR green mastermixTakara Bio, JapanRR420APCR test
cDNA synthesekitTakara Bio, JapanRR047AOmgekeerd getranskribeerd naar complementair DNA
Alizarine RoodSigma-AldrichA5533Kleuring van calciumverbindingen
Toluidine BlauwSigma-Aldrich89640Kleuring van kraakbeenweefsel
Oil Red O oplossingSigma-AldrichO1391LLipide vacuole kleuring
Apparatuur
MiniMACS SeparatorMiltenyiBiotec130-042-102Voor magnetisch geactiveerde celsortering
MultiStandMiltenyiBiotec130-042-303Voor magnetisch geactiveerde celsortering
MS KolommenMiltenyiBiotec130-042-201Voor magnetisch geactiveerde celsortering
Cell StrainerFALCON Inc.35234040 μm nylon
HemocytometerISOLAB Inc.075.03.001Celtelling
Falcon 100 mm schaalCorning353003Celcultuurschaal
MicrocentrifugebuisAxygenMCT-150-CRNA Extractie en PCR
CentrifugebuizenSigma-Aldrich91050Gamma-gesteriliseerd
Hoge-snelheidscentrifugeEppendorf5804RCentrifugeer cellen
Kooldioxide celincubatorThermo scientific3111Celcultuur
Real-Time PCR InstrumentLife TechQuantStudioReal-Time kwantitatieve polymerasekettingreactie
Flow cytometerBD Biosciences342975Celanalyzer
PipettorEppendorfO25456FTransfer de vloeistof
Kloon cilinderSigma-AldrichC3983-50EAIsoleer en kies individuele celkolonies
Steriele hypodermische spuitDouble-Dove, China131010Artrocentese procedure
KonijnenkooiZhike, ChinaZC-TGDHoud het konijn vast

Referenties

  1. Oreffo, R. O., Cooper, C., Mason, C., Clements, M. Mesenchymal stem cells: lineage, plasticity, and skeletal therapeutic potential. Stem Cell Reviews. 1 (2), 169-178 (2005).
  2. Asakura, A., Rudnicki, M. A., Komaki, M. Muscle satellite cells are multipotential stem cells that exhibit myogenic, osteogenic, and adipogenic differentiation. Differentiation. 68 (4-5), 245-253 (2001).
  3. De, B. C., Dell'Accio, F., Tylzanowski, P., Luyten, F. P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheumatology. 44 (8), 1928-1942 (2001).
  4. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  5. McGonagle, D., Jones, E., English, A., Emery, P. Enumeration and phenotypic characterization of synovial fluid multipotential mesenchymal progenitor cells in inflammatory and degenerative arthritis. Arthritis & Rheumatism. 50 (3), 817-827 (2004).
  6. Jia, Z., et al. Isolation and characterisation of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid by magnetic activated cell sorting (MACS). Cell Biology International. , (2017).
  7. Bashir, M., et al. Isolation, culture and characterization of New Zealand white rabbit mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Asian Journal of Animal & Veterinary Advances. 10 (8), 13-30 (2015).
  8. Song, X., et al. Differentiation potential of rabbit CD90-positive cells sorted from adipose-derived stem cells in vitro. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 53 (1), 1-6 (2016).
  9. Lee, T. C., et al. Comparison of surface markers between human and rabbit mesenchymal stem cells. PLOS One. 9 (11), e111390(2014).
  10. Stewart, M. C., Chen, Y., Bianchessi, M., Pondenis, H. Phenotypic characterization of equine synovial fluid-derived chondroprogenitor cells. Stem Cell Biology and Research. 3 (1), (2016).
  11. Prado, A. A. F., et al. Characterization of mesenchymal stem cells derived from the equine synovial fluid and membrane. BioMed Central Veterinary Research. 11 (1), 281(2015).
  12. Yoshimura, H., et al. Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow, synovium, periosteum, adipose tissue, and muscle. Cell and Tissue Research. 327 (3), 449-462 (2007).
  13. Wu, C. C., et al. Intra-articular injection of platelet-rich fibrin releasates in combination with bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of articular cartilage defects: an in vivo study in rabbits. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (6), 1536-1543 (2017).
  14. John, T., Lerche, P. Anesthesia and Analgesia for Veterinary Technicians. , Mosby Elsevier. St. Louis, Missouri. (2011).
  15. Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sciences. 89 (19-20), 741-747 (2011).
  16. Kim, Y. S., et al. Isolation and characterization of human mesenchymal stem cells derived from synovial fluid in patients with osteochondral lesion of the talus. American Journal of Sports Medicine. 43 (2), 399-406 (2015).
  17. Vereb, Z., et al. Immunological properties of synovial fluid-derived mesenchymal stem cell-like cells in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 74 (Suppl 1), A64-A65 (2015).
  18. Matsukura, Y., Muneta, T., Tsuji, K., Koga, H., Sekija, I. Mesenchymal stem cells in synovial fluid increase after meniscus injury. Clinical Orthopaedics & Related Research. 472 (5), 1357-1364 (2014).
  19. Morito, T., et al. Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans. Rheumatology. 47 (8), 1137-1143 (2008).
  20. Hegewald, A. A., et al. Hyaluronic acid and autologous synovial fluid induce chondrogenic differentiation of equine mesenchymal stem cells: a preliminary study. Tissue & Cell. 36 (6), 431-438 (2004).
  21. Jones, E. A., et al. Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single cell level. Arthritis & Rheumatism. 58 (6), 1731-1740 (2008).
  22. Makker, K., Agarwal, A., Sharma, R. K. Magnetic activated cell sorting (MACS): utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology. 46 (7), 491-497 (2008).
  23. Schmitz, B., et al. Magnetic activated cell sorting (MACS) — a new immunomagnetic method for megakaryocytic cell isolation: comparison of different separation techniques. European Journal of Haematology. 52 (5), 267-275 (1994).
  24. Reinhardt, M., Bader, A., Giri, S. Devices for stem cell isolation and delivery: current need for drug discovery and cell therapy. Expert Review of Medical Devices. 12 (3), 353-364 (2015).
  25. Gronthos, S., Zannettino, A. C. W. A method to isolate and purify human bone marrow stromal stem cells. Mesenchymal Stem Cells. Prockop, D. J., Bunnell, B. A., Phinney, D. G. , Vol. 449 of Methods in Molecular Biology 45-57 (2008).
  26. Krawetz, R. J., et al. Synovial fluid progenitors expressing CD90+ from normal but not osteoarthritic joints undergo chondrogenic differentiation without micro-mass culture. PLOS One. 7 (8), e43616(2012).
  27. Ogata, Y., et al. Purified human synovium mesenchymal stem cells as a good resource for cartilage regeneration. PLOS One. 10 (6), e0129096(2015).
  28. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  29. Gauci, S. J., et al. Modulating chondrocyte hypertrophy in growth plate and osteoarthritic cartilage. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interact. 8 (4), 308(2008).
  30. Cooke, M. E., et al. Structured three-dimensional co-culture of mesenchymal stem cells with chondrocytes promotes chondrogenic differentiation without hypertrophy. Osteoarthritis and Cartilage. 19 (10), 1210-1218 (2011).
  31. Fischer, J., Dickhut, A., Rickert, M., Richter, W. Human articular chondrocytes secrete parathyroid hormone-related protein and inhibit hypertrophy of mesenchymal stem cells in coculture during chondrogenesis. Arthritis and Rheumatism. 62 (9), 2696-2706 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mesenchymale stamcellen uit synoviale vloeistofisolatie in konijnenmodelpositieve selectie van CD90flowcytometrie analyseosteogene adipogene chondrogene differentiatiebereiding van een enkelcellesuspensieprotocol voor kolonieselectieexpressie van MSC markersregeneratie van gewrichtskraakbeen
Magnetische-geactiveerde cel sorteren van strategieën om te isoleren en zuiveren van de synoviale vloeistof afkomstige mesenchymale stamcellen uit het Model van een konijn
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.