Evaluatie van het effect van eiwit aggregatie op cellulaire oxidatieve Stress in gist

Samenvatting

Eiwit aggregatie lokt cellulaire oxidatieve stress. Dit protocol wordt een methode voor de controle van de intracellulaire toestanden van eiwitten van de amyloidogenic en de oxidatieve stress geassocieerd met hen, met behulp van stroom cytometry beschreven. De aanpak wordt gebruikt voor het bestuderen van het gedrag van oplosbare en aggregatie-naar voren gebogen varianten van de amyloid-β-peptide.

Samenvatting

Eiwit misfolding en aggregatie in amyloïde conformaties verband met het ontstaan en de progressie van verschillende neurodegeneratieve aandoeningen. Echter, er is nog weinig bekend over hoe onoplosbaar eiwit-aggregaten oefenen hun toxische effecten in vivo. Eenvoudig model van de prokaryote en eukaryote organismen, zoals bacteriën en gist, hebben aanzienlijk bijgedragen aan onze huidige inzicht in de mechanismen achter de intracellulaire amyloïde vorming, aggregaten propagatie en toxiciteit. In dit protocol, wordt het gebruik van gist beschreven als een model om te ontleden de relatie tussen de vorming van eiwit-aggregaten en hun impact op de cellulaire oxidatieve stress. De methode combineert de detectie van de intracellulaire oplosbare/geaggregeerde staat een amyloidogenic eiwit met de kwantificering van de cellulaire oxidatieve schade ten gevolge van de expressie met behulp van stroom cytometry (FC). Deze aanpak is eenvoudig, snel en kwantitatieve. De studie illustreert de techniek door correleren de cellulaire oxidatieve stress veroorzaakt door een groot aantal amyloid-β peptide varianten met hun respectieve intrinsieke aggregatie neigingen.

Inleiding

Proteostasis is een fundamentele factor voor cel processen op het gebied van fitness en veroudering. In cellen, wordt eiwit homeostase onderhouden door geavanceerde eiwit kwaliteitscontrole netwerken gericht om ervoor te zorgen dat de juiste uiteinde van misfolded eiwit conformeren van chaperones en/of hun gerichte proteolyse met verschillende goed geconserveerde mechanismen^{1 ,2,},^3,,^4,5. Een groot aantal studies verlenen steun aan het verband tussen het ontstaan en de progressie van een breed scala van ziekten bij de mens en het falen van proteostasis, wat leidt tot het eiwit misfolding en aggregatie. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van eiwitten deposito's wordt beschouwd als een pathologische kenmerk van vele neurodegeneratieve ziekten, zoals Alzheimer, Parkinson, en Huntingtons ziekten^6,7,8, prionogenic ziekten en niet-degeneratieve amyloidoses⁹. Er is gesuggereerd dat vroege oligomere en protofibrillar assemblages in de reactie van de globalisatie de belangrijkste elicitors van cytotoxiciteit zijn, tot oprichting van afwijkende interacties met andere eiwitten in de drukke mobiele milieu¹⁰. Eiwit insluitsels (PI) kunnen bovendien worden overgebracht tussen cellen, teeltmateriaal hun toxisch effect^11,12. Dus zou kunnen het zijn dat de vorming van PI inderdaad een ontgiftende mechanisme dat de aanwezigheid van gevaarlijke geaggregeerde soorten tot specifieke locaties in de cel beperkt, waar ze kunnen worden verwerkt of verzameld zonder belangrijke bijwerkingen kan inhouden ^{13 , 14}.

Standaard in vitro biochemische benaderingen hebben belangrijke inzichten in de verschillende soorten die aggregatie reacties en hun eigenschappen^{15,16 bevolken}verstrekt. De voorwaarden gebruikt in deze tests zijn echter duidelijk anders dan die welke voorkomen in de cel en, dus, vraag hun fysiologische relevantie. Vanwege de opmerkelijke behoud van cellulaire routes zoals de controle van de kwaliteit van het eiwit, autophagy of de regulering van de cellulaire redox staat^17,18 onder eukaryoten^{19,20,21 ,22,23}, de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) heeft ontpopt als een bevoorrechte eenvoudig cellulaire model te bestuderen van de Moleculaire determinanten van aggregatie van eiwitten en het bijbehorende cytotoxisch effect ervan in biologisch relevante omgevingen^24,25,26.

Eiwit aggregatie neiging is een functie die inherent gecodeerd in de primaire volgorde. Dus, kan de vorming van amyloid-achtige structuren worden voorspeld op basis van de identificatie en evaluatie van de potentie van aggregatie-bevordering van regio's in polypeptiden²⁷. Echter, ondanks het succes van bioinformatic algoritmen te voorspellen van de eigenschappen van aggregatie in vitro van proteïne sequenties, ze zijn nog lang niet voorspellen hoe deze neigingen vertalen naar in vivo cytotoxisch effect. Studies die betrekking hebben op het verband tussen de geaggregeerde staat van een bepaald eiwit en haar verbonden cellulaire schade op een systematische wijze kunnen bijdragen tot het omzeilen van deze beperking van computationele. Deze verbinding wordt behandeld in de huidige studie, profiteren van een groot aantal varianten van de amyloid-β peptide Aβ42 die alleen verschillen in een enkel residu, maar een doorlopend bereik van aggregatie neigingen in vivo²⁸weergeven. In het bijzonder wordt een FC gebaseerde benadering voor het identificeren van de conformationele soorten administratieve verwerking van de oxidatieve schade door aggregatie-naar voren gebogen eiwitten in gistcellen ontlokte beschreven. De methodologie biedt vele voordelen zoals eenvoud, hoge gegevensdoorvoer vermogen en nauwkeurige kwantitatieve meting. Deze aanpak maakte het mogelijk om te bevestigen dat PI spelen een beschermende rol tegen oxidatieve stress.

Protocol

1. S. cerevisiae culturen en eiwit expressie

Opmerking: Aβ varianten vertonen verschillende relatieve aggregatie neigingen als gevolg van een mutatie in een enkel residu op positie 19 (Phe19) van de Aβ42 peptide (figuur 1A). Deze peptide varianten zijn gelabeld met groen fluorescente proteïne (GFP), die als een aggregatie verslaggever (Figuur 1)^{29 optreedt}.

1. Transformeren plasmiden codering voor 20 Aβ42-GFP varianten in gistcellen met een BY4741 ouderlijke achtergrond (MATa zijn3Δ1 leu2Δ0 ontmoette15Δ0 ura3Δ0)³⁰. Elke plasmide codeert voor een Aβ42 mutant gesmolten tot GFP door een linker GSSGSSG. De plasmiden zijn pESC(-URA) en bevatten de selecteerbare markering URA3²⁹.
   1. Voorbereiden van de synthetische compleet medium zonder uracil (SC-URA) met de volgende onderdelen: 1.9 g/L gist stikstof basis zonder uracil, 5 g/L ammoniumsulfaat en 900 mL ddH₂O gecombineerd met 100 mL glucose van 20% (m/v).
   2. Zet een kolonie van de getransformeerde gistcellen in 20 mL van de SC-URA medium met 2% glucose en groeien de culturen 's nachts bij 30 ° C onder agitatie bij 210 t/min.
2. De volgende dag, groeien nieuwe gist cellen culturen door inoculating 100 µL van de overnachting cultuur tot 5 mL verse SC-URA voedingsbodem.
3. Bij een OD₅₉₀ van 0,5, centrifugeren van de culturen op 3000 x g gedurende 4 minuten, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de dezelfde hoeveelheid verse SC-URA medium met 2% raffinose.
4. Incubeer bij 30 ° C onder agitatie bij 210 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten. Vervolgens de cellen bij 3000 x g gedurende 4 min centrifugeren en verwijder het supernatant. Resuspendeer de cellen in verse SC-URA medium met 2% galactose om de recombinant eiwit expressie.
5. Na 16 h van het inducerende eiwituitdrukking in SC-URA medium met 2% galactose, oogst 1 mL van de geïnduceerde cellen in steriele microcentrifuge buizen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 4 min.
   Opmerking: De meest relevante verschillen optreden nadat een inductieperiode van 16 h. ingegeven gistcellen uiting van Aβ42-GFP varianten kan worden gevisualiseerd door fluorescentie microscopie om te bepalen van de verdeling van de recombinante eiwitten in de cellen (figuur 2B).

2. cel kleuring

Let op: Verse niet-geïnduceerde cellen zijn verplicht als een negatieve controle drempel vast te stellen een fluorescerende tijdens een FC-analyse.

1. Neem de 16 h-geïnduceerde gistcellen en bepalen hun optische dichtheid bij 590 nm (OD₅₉₀)_. Verdun hen in een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) naar een OD₅₉₀ 0.1.
   1. 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing als volgt voorbereiden: Voeg 8 g NaCl, KCl, 1,44 g nb₂HPO₄, 0.2 g en 0,24 g van KH₂PO₄ tot 800 mL ddH₂O. Vul de oplossing tot 1 L ddH₂O na het aanpassen van de pH op 7.4 met HCl. Filter de buffer door een 0,2 µm filter.
2. Breng de schorsingen cel waarin adequaat gelabelde buizen (12 × 75 mm ronde onderkant polystyreen) en hen te beschermen tegen licht. Zorg ervoor dat ze zijn klaar om te worden geladen op de cytometer van de stroom voor analyse, samen met niet-geïnduceerde en niet-gekleurde cellen.
3. De sonde van de oxidatieve stress (bijv CellROX Deep Red) toevoegen aan elk monster op een eindconcentratie van 5 µM en Incubeer de cellen bij 30 ° C gedurende 30 minuten in het donker.
4. Na incubatie, wassen van de cellen 3 keer met 1 x PBS en resuspendeer hen in dezelfde hoeveelheid buffer vóór hun analyse door FC.

3. Stroom Cytometry analyse

Opmerking: Gebruik een FC-installatie met passende lasers en filters om GFP en oxidatieve stress sonde fluorescentie signaal te detecteren. Een cytometer van de stroom voorzien van een 488 nm blauwe laser voor het opsporen van GFP en een 635 nm rode laser voor het opsporen van oxidatieve stress sonde fluorescentie kan worden gebruikt. Verwerving van emissie fluorescentie van GFP en oxidatieve stress sonde wordt uitgevoerd met een 530/30 nm BP filter en een 660/20 BP filter, respectievelijk (tabel 1).

1. Klik op Open nieuwe werkblad paneel en maak de volgende overname dot percelen.
   1. Selecteer het Scatter Plot gereedschap in de werkbalk en maak een perceel met de variabelen kant Scatter-gebied (WS-A) op de y-as vs. vooruit Scatter-gebied (FSC-A) in een lineaire schaal op de x-as.
   2. Klik op de Scatter Plot gereedschap op de werkbalk en het maken van een perceel met de variabelen FL1-gebied (FITC) op de x-as vs. FL3-gebied (APC) in een logaritmische schaal op de y-as.
2. Klik op het pictogram van Montages van de instrumenten . Klik op het tabblad compensatie en stel alle niveaus van de compensatie. Klik op het tabblad overname en selecteer een totaal aantal van 20.000 gebeurtenissen worden geregistreerd.
3. Klik op het pictogram van de Stroomsnelheid om over te schakelen van het debiet te laag.
4. Klik op het tabblad verwerven om te beginnen met het uitvoeren van de niet-geïnduceerde, onbevlekt cellen en aanpassen van de spanning in de Instrumentele instellingen voor het doorsturen en kant scatter totdat de bevolking wordt verdeeld in het midden-links-Kwadrant.
   1. Klik op het pictogram van de veelhoek te stellen een regio R1 rond de celpopulatie exclusief cel puin, en gebruik deze gated bevolking P1 = R1 voor alle fluorescerende dot plots en histogram vertegenwoordigingen (Figuur 3).
5. Om aan te passen de spanning van de bet van de fluorescentie-signaal, de onbevlekt cellen in de FL1-FL3 dot plot, afstemming van de winst in het tabblad Instrument instelling totdat de cellen zich in het lagere linker Kwadrant bevinden worden uitgevoerd.
6. Wijzig het monster in de geïnduceerde cellen te meten GFP fluorescentie. Stel de winst in de FSC-A vs. FL1 (FITC) wanneer de bevolking worden gedistribueerd in het kwadrant rechtsonder in het tabblad Instellingen van het Instrument . Definieer de positieve cel bevolking met een hek (Gate P2).
7. Wijziging van het monster, tot de niet-geïnduceerde gekleurd cellen weer te geven van oxidatieve stress door de fluorescentie op een FSC-A vs. FL3 (APC) stip perceel. Tune de winst totdat de celpopulatie wordt verspreid in de kwadrant links-upper. Poort de positieve celpopulatie in P3.
8. Maak twee histogram Staanplaatsen met het pictogram van het histogram te vertegenwoordigen de fluorescentie van de cel. Om aan te geven de intensiteit van de fluorescentie, Controleer of FL1 (FITC) vertegenwoordigen de GFP-fluorescentie is in de x-as, en FL3 (APC) vertegenwoordigen de fluorescentie in de y-as, P2 en P3 populaties op een logaritmische schaal, respectievelijk toe te passen.
   Opmerking: Histogram overlays zijn een goede manier om te illustreren de verschillen tussen de profielen van de fluorescentie van cellen uiten van verschillende Aβ varianten.

4. recombinant eiwit Immunodetection

1. Om te bepalen eiwitniveaus expressie, oogsten van de culturen van de gist voor 16 h geïnduceerd door centrifugeren bij 4000 x g gedurende 6 min, en op te slaan de cel pellets bij-80 ° C.
   1. Resuspendeer de verzamelde cellen uiten van recombinante eiwitten voor 16u in PBS. Bereiden 200 µL cel schorsingen van elk Aβ42-GFP mutant aan een OD-₅₉₀ van 20.
2. Voor de analyse van de Fractie van de totale proteïne, oogsten 100 µL van elke mutant door centrifugeren bij 14.000 x g gedurende 20 min en resuspendeer de cel pellets in dezelfde hoeveelheid gist lysis-buffermengsel Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA met 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl sulfobetaine) aangevuld met 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)).
   1. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur onder milde agitatie.
3. Bepalen de eiwitconcentratie extract met behulp van de analyse van Bradford. Laden van maximaal 5 µg voor eiwit extract van elk monster op een 15% acrylamide SDS-pagina de Elektroforese van gel en vlek op een Polyvinylideenfluoride (PVDF) difluoride membraan bij 100 V voor 60 min.
   1. Een Bradford reagens met 100 mg Coomassie briljant blauw G-250 opgelost in 50 mL ethanol 95% en voeg 100 mL 85% (m/v) fosforzuur te bereiden. Vervolgens, wanneer de kleurstof volledig is opgelost, het mengsel met ddH₂O tot 1 L verdunnen en filteren door filterpapier cellulose vlak voor gebruik.
      Opmerking: De Bradford-reagens moet worden lichtbruin.
   2. Een norm van bovien serumalbumine (BSA) variërend van 5-100 µg eiwit in 1000 µL van het Bradford reagens te bereiden.
   3. Voeg 1-10 µL van eiwit extract tot 1 mL van het reagens Bradford en Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   4. Meet de extinctie van de normen en de eiwitsteekproeven extract bij OD₅₉₅.
   5. Bij de analyse, een perceel met de waarden van de extinctie verkregen voor de normen vste maken. µg voor eiwit. Op basis van de standaard curve, bepalen de concentraties van de originele exemplaren van de hoeveelheid eiwit, gezien de omvang en de verdunning, indien van toepassing.
4. Spoel het membraan met 1 x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS), 0,1% Tween-20 (TTBS), en met behulp van 5% (m/v) nonfat droge melk in 1 x TTBS te blokkeren.
   1. Los 24 g van Tris basis en 88 g NaCl in 900 mL H₂O_dd om te bereiden 1 L van 10 x TBS, en breng de pH op 7.6. DdH₂O toevoegen aan een eindvolume van 1 L. Voor een oplossing van 1 x, meng 1 deel van 10 x voorraad met 9 delen van ddH₂O.
5. Het membraan voor 1 h met een primair antilichaam van β-amyloid 6E10 verdund 1:1,000 broeden en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een secundair antilichaam geit anti-muis IgG-HRP-geconjugeerde verdund 1:10, 000.
6. Ontwikkelen van membranen met 1 mL van Luminata fluorescerende reagens en kwantificeren van bands door densitometric analyse, zoals beschreven in stap 5.2.

5. de gegevensanalyse

1. Voor het analyseren van de gegevens die zijn verkregen door FC, een tabel weergeven van de gemiddelde TL intensiteit (MFI's) maken en mediaan fluorescentie met de bijbehorende standaardafwijking en/of de coëfficiënt van de AVK (afwijking) voor GFP fluorescentie en oxidatieve stress niveaus.
   1. Klik op het tabblad van de inspecteur en het pictogram van de Statistieken voor het aanpassen van de statistische gegevens die nodig voor elk kanaal zijn.
      Opmerking: Bij het vergelijken van eiwit varianten, fluorescentie waarden gegevens kunnen converteren naar een achtergrond van de fold-over of resolutie metrisch (RD):
      
      In deze statistiek, het gemiddelde monster is de gemiddelde fluorescentie van probleem monsters, de gemiddelde controle is de gemiddelde fluorescentie cellen die worden gebruikt als een besturingselement en de SD is de standaarddeviatie van de gemiddelde fluorescentie. RD factor is een nauwkeuriger index dan MFI waarde omdat het niet alleen het verschil tussen monsters maar ook rekeningen berekent voor het verspreiden van de gegevens. Deze berekening is specifiek relevant is als het vergelijken van gegevens afkomstig uit verschillende experimenten uitgevoerd na verloop van tijd. Zodra het RDs zijn berekend, verdient het gebruik van een statistische toets om te bevestigen het belang van de waargenomen verschillen tussen eiwit varianten.
2. Voor proteïne immunodetection, de recombinante eiwitniveaus door westelijke vlek ImageJ softwarematig te kwantificeren.
   1. Vóór de analyse densitometrie door de oorspronkelijke raw-beelden van het ontwikkelde membraan te converteren in JPEG formaat en greyscale modus file.
   2. Pas de Set metingen sectie van het menu van de analyseren op Grijs-waarde betekenen.
   3. Klik op het gereedschap rechthoek van ImageJ en definieer een regio van belang (ROI) met een consistent formaat voor de band densitometrie analyse. Elke band op het membraan beeld binnen het gemaakte rechthoekig frame te centreren en opnemen van de meting één voor één met behulp van Ctrl + M (de meting opdracht).
   4. Het meten van de lokale achtergrond grenzend aan elke band, hetzelfde ROI gebied toe te passen. Na meting, aftrekken van de overeenkomstige lokale achtergrond van elke individuele band.

Resultaten

Dit protocol wordt beschreven hoe een collectie van 20 varianten van de Aβ42 peptide waar Phe19 heeft is gemuteerd tot en met alle natuurlijke Proteïnogeen aminozuren²⁸in dienst. De theoretische aggregatie neigingen van deze proteïnen kunnen worden geanalyseerd met behulp van twee verschillende bioinformatic algoritmen (AGGRESCAN en TANGO^31,32). In beide gevallen maakt deze analyse een progressieve gradatie...

Discussie

Een breed scala van ziekten is gekoppeld aan de accumulatie van misfolded eiwitten in cellulaire deposito's^6,,^7,,^8,33. Veel inspanningen zijn verricht om te ontrafelen van de moleculaire mechanismen die leiden het begin van deze ziekten met behulp van computationele benaderingen, die niet rekening account eiwit concentraties tot, of in vitro nadert, waarin de eiwitconcentratie blijft c...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Gistcellen BY4741	ATCC	201388	Genotype: MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0
pESC(-Ura) plasmid	Agilent Genomics	217454	Gistexpressieplasmide met een Gal promotor. Selecteerbare marker URA3
Gist Synthetische Drop-out Medium Supplementen	Sigma	Y1501	Poeder
Giststikstofbasis Zonder Aminozuren	Sigma	Y0626	Poeder
Raffinose	Sigma	R7630	Poeder
Glucose	Sigma	G7021	Poeder
Galactose	Sigma	G0750	Poeder
Fosfaat Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	BP3991	Oplossing 10X
CellROX Deep Red Reagens	Life Technologies	C10422	Vrije radicaal cel-doorlatende fluorescente sensor, niet-fluorescerend terwijl in een gereduceerde toestand, en vertoont heldere fluorescentie bij oxidatie door reactieve zuurstofsoorten (ROS), met absorptie/emissie maxima bij 644/665 nm.
Y-PER eiwitextractie reagens	Thermo Scientific	78990	Vloeibare cel lysbuffer
Acrylamid/Bis-acrylamide	Sigma	A6050	Oplossing
Bradford kleurstof reagens	Bio-Rad	5000205	Kleurstof reagens voor eenstaps bepaling van eiwitconcentratie
β-amyloïde antilichaam 6E10	BioLegend	803001	Muis IgG1. Het epitoop ligt binnen aminozuren 3-8 van beta amyloïde (EFRHDS).
Geit anti-muis IgG-HRP-conjugaat	Bio-Rad	1721011
Membrane Immobilon-P, PVDF	Millipore	IPVH00010
Luminata forte	Merk	WBLUF0100	Voorgemixte, gebruiksklare chemiluminescentie HRP detectie reagens
Fenylmethaansulfonylfluoride oplossing (PMSF)	Sigma	93482	Proteaseremmer. Opgelost bij 0,1 M in ethanol
FACSCanto flow cytometer	BD Biosciences	657338	Uitgerust met een 488 nm blauwe laser voor de detectie van GFP, en 635 nm rode laser / 530/30 nm BP filter en 660/20 BP filter
Mini Trans-Blot Electrophoresis Transfer cell	Bio-Rad	1703930	Eiwittransfersysteem
Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systemen	Bio-Rad	1658000FC	Elektroforese systeem