Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen: een combinatie van cel-gebaseerde strategie versneld perfusie met directe Paracrine levering

6.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57472

⸱

16 mei 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

In dit artikel

Samenvatting

Voor sommige patiënten is de enige optie voor behoud van de vruchtbaarheid cryopreservatie van eierstokweefsel. Helaas ondermijnt vertraagde revascularisatie folliculaire levensvatbaarheid. Hier presenteren we een protocol om mede de transplantatie van menselijke eierstokweefsel met endotheliale cellen voor gebruik als een cel-gebaseerde strategie combineren versnelde perfusie met een directe paracrine levering van biologische actieve moleculen.

Samenvatting

Onvruchtbaarheid is een frequente bijwerking van chemotherapie en/of radiotherapie en voor sommige patiënten, cryopreservatie van eicellen of embryo's is geen optie. Als alternatief, een groeiend aantal van deze patiënten kiezen om te cryopreserve van eierstokweefsel voor autograft na invordering en kwijtschelding. Ondanks verbeteringen in de resultaten onder patiënten die een auto-transplantatie cryopreserved eierstokweefsel, blijft efficiënte revascularisatie geënte weefsel een obstakel. Om te verzachten ischemie en dus resultaten in patiënten die een auto-transplantatie te verbeteren, ontwikkelden we een vasculaire cel-gebaseerde strategie om perfusie van eierstokweefsel te versnellen. Met cryopreserved ovariaal weefsel in een muismodel van xenograft beschrijven we een methode voor co transplantatie van exogene endotheliale cellen (ExECs). We breiden deze aanpak om ExECs die zijn ontworpen om te constitutively express Anti-Mullerian hormone (AMH), waardoor de aanhoudende paracrine signalering input voor ovariële transplantaten tewerk te stellen. Co transplantatie met ExECs verhoogd folliculaire volume en verbeterde follikelgroei follikel ontwikkeling en AMH-uiten ExECs bevorderd eigendomsvoorbehoud rustige primordiale follikels. Deze gecombineerde strategie kan een nuttig instrument voor beperkende ischemie en modulerende folliculaire activering in het kader van het behoud van de vruchtbaarheid en/of onvruchtbaarheid bij groot worden.

Inleiding

Kanker blijft een van de belangrijkste doodsoorzaken in de ontwikkelde wereld, maar tientallen jaren onderzoek hebben aanzienlijke vooruitgang voor de meeste soorten van kanker, en in sommige gevallen bijna verdubbelde survival tarieven1opgeleverd. Helaas, chemotherapeutische agenten zijn vaak gonadotoxic, uitputting van de reserve van primordiale follikels in de eierstokken en een vermindering van de vruchtbaarheid2. Deze groeiende bevolking kan profiteren van de verschillende methoden voor het behoud van de vruchtbaarheid met inbegrip van de oöcyt en/of embryo cryopreservatie, patiënten vereisen snelle opening van kankertherapie en vooraf pubertijd patiënten zijn echter niet in aanmerking voor deze opties. Als alternatief, hebben sommige patiënten gekozen voor het cryopreserve van eierstokweefsel alvorens hun therapeutische regime, en bij herstel en vergeving, auto-verplanten weefsel herstellen vruchtbaarheid3. Echter tot op heden, blijven graft overleving en folliculaire uitvoer na auto-transplantatie relatief lage4, voornamelijk als gevolg van weefsel ischemie en hypoxie5,6,7. Ondanks de vele inspanningen ter verbetering van de levensvatbaarheid van ovariële corticale transplantaties met behulp van anti-oxidanten8,9, pro-angiogenic cytokines10,11,12,1 3, of mechanische manipulaties14, graft ischemie in een dag van 5 tot en met 7 venster na transplantatie ondermijnt de levensvatbaarheid en de overleving van de graft-7. Om aan te pakken dit, ontwikkelden we een cel-gebaseerde strategie om te vergemakkelijken wapendrager van host- en graft vaartuigen en dus haast reperfusie van eierstokweefsel.

Naast de ischemische belediging voor geënte ovariaal weefsel in het venster na transplantatie, kan de verstoring van Inter folliculaire signalering bijdragen aan de uitputting van de zwembad15,16. Omdat exogene endotheliale cellen (ExECs) tot een stabiele en goed functionerende vaartuigen in de periferie van de prothese bijdragen, presenteren ze een unieke kans om het overbrengen van een gedefinieerde moleculaire input aan getransplanteerde weefsel. Als een bewijs van beginsel, werden ExECs ontworpen om uitdrukkelijke Super fysiologische niveaus van Anti-Mullerian hormoon (AMH), een lid van de transformerende groeifactor bèta (TGFβ) superfamilie dat is aangetoond dat het beperken van de folliculaire groei17. Vergelijking van de folliculaire distributie in transplantaten samen met controle en AMH-uiten cellen getransplanteerd controleert de biologische activiteit en de potentie van gemanipuleerde exECs.

Kortom, door verbetering van de graft levensvatbaarheid en onderdrukken van vroegtijdige mobilisatie van de folliculaire pool, deze aanpak kan de productiviteit te verhogen van auto-getransplanteerde eierstokweefsel in patiënten die een behoud van de vruchtbaarheid. Bovendien kan de ExEC-gebaseerd platform experimentele ondervraging van moleculaire regelgevende instanties die zijn betrokken bij de ontwikkeling van de folliculaire.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) aan Weill Cornell Medical College. Alle xenotransplantatie experimenten met behulp van eierstokweefsel werden uitgevoerd volgens de relevante richtlijnen en verordeningen. Menselijke eierstokweefsel werd bijeengezocht uit patiënten gepland voor chemotherapie of radiotherapie voor behandeling van kanker of voorafgaande beenmergtransplantatie. De institutionele review board (IRB) Comité van Weill Cornell Medical College keurt de collectie van weefsel voor potentiële autoloog gebruik, en bij de patiënt geïnformeerde toestemming die een donatie van maximaal 10% van hun eierstokweefsel voor gebruik in onderzoek werd uitgevoerd.

1. verzameling van menselijke eierstokweefsel

Opmerking: Wanneer een ovariaal weefsel wordt getransporteerd van de doorvoer van een externe faciliteit, tijd mag niet meer dan 5 h18,19.

  1. Verzamel de ovariaal weefsel en spoel met een steriele zoutoplossing.
  2. De eierstok plaats in een steriele container.
  3. Giet de Leibovitz L-15 medium tot het vruchtbeginsel is volledig ondergedompeld in het medium.
  4. Sluit en verzegel de container.
  5. Transport van de container in de ijskast.

2. het verwerken van de verkregen eierstokweefsel, aangepast van Schmidt et al. 18

  1. Voorbereidingen voor ovariële verwerking en bevriezing
    1. 100 mL medium voorbereiden verwerking: Leibovitz van L-15 middellange 99 mL + 1 mL antibioticum-antimycotic oplossing. Filtermedia met 0,2 µm filter. Houd het medium gekoeld.
    2. 100 mL bevriezing oplossing met behulp van DMSO als een cryo-protectant voor te bereiden. Voeg 69.64 mL Leibovitz de L-15 gemiddeld, 17.66 mL foetale runderserum (FBS), 3,42 g van sacharose (voor het maken van een uiteindelijke concentratie van 0,1 mol/L), 10.65 mL DMSO (voor het maken van een eindconcentratie van 1,5 mol/L), en 1 mL antibioticum-antimycotic oplossing. Filteren van het medium met behulp van een 150 mL filter eenheid, 0,2 µm. winkel het medium bij 4 ° C.
    3. Het steriliseren van de chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf geprogrammeerd voor een verpakte vaste stoffen sterilisatie cyclus.
  2. Bij aankomst van het weefsel
    1. Instellen van de steriele chirurgische instrumenten in het biosafety kabinet: scalpel met mes nummer 21, scherp prima gebogen schaar en pincet bij uiteenlopende maten: lange (ongeveer 150 mm lengte) en 2 middelgrote (ongeveer 110 mm lengte).
    2. Steriele handschoenen dragen, open de container binnen het biosafety kabinet. Nemen van het ovarium en plaatst u deze in een 150 mm petrischaal en giet koud medium bereid in stap 2.1.1 bovenop de eierstok om uitdroging van de ovariaal weefsel te voorkomen.
    3. Isoleren van het ovarium van eventuele resterende weefsel en spoel het met koud medium totdat het is verstoken van weefsel en bloed.
    4. Breng de eierstok in een schone 150 mm petrischaal en voeg koud medium, bereid in stap 2.1.1 totdat het vruchtbeginsel ondergedompeld in het de helft is.
  3. Dissectie van de eierstokweefsel
    1. Bisect het ovarium en de medulla eerst verwijderen door scherpe dissectie, met behulp van gebogen fijne schaar. Dan Schraap de medulla weg, gebruik een steriel scalpel met een mes het nummer 21. Voorafgaan aan totdat de corticale weefsel 1-1,5 mm in dikte is.
    2. Snijd de corticale weefsel in reepjes van 2-3 mm in de breedte, zal de lengte van de strip de gehele lengte van de ovariële stuk dat is verwerkt.

3. ovarieel weefsel traag bevriezing, aangepast van Newton et al. en Oktay et al. 6 , 20

  1. Voorbereiding voor bevriezing
    1. Label cryovials (1.8 mL).
    2. Voeg 1,5 mL van de ijskoude oplossing bereid in stap 2.1.2 aan elke flacon.
    3. Breng één corticale strip per cryogene flacon met de ijskoude oplossing.
    4. De corticale strip voor 20 min op een roterende plaat equilibreer, toepassing van zachte agitatie bij 4 ° C.
  2. Langzaam bevriezing van eierstokweefsel
    1. Laden van de cryovials in een programmeerbare planer vriezer begint bij 0 ° C.
    2. Cool op 2 ° C/min. tot-7 ° C.
    3. Houd de weefsels op deze constante temperatuur gedurende 10 minuten.
    4. Uitvoeren van handmatige zaaien voor ice crystal nucleatie inductie, door elke cryovial aan te raken met een katoen-tip ondergedompeld in vloeibare stikstof (LN2).
    5. Blijven om te koelen op 0,3 ° C/min. tot monster temperatuur-40 ° C. bereikt
    6. Cool in een sneller tempo van 10 ° C/min. tot-140 ° C.
    7. Cryovials overbrengen naar de dewar voor opslag in LN2 (196 ° c.).

4. voorbereidende werkzaamheden voor de operaties (bilaterale oöforectomie en co transplantatie)

  1. Voorbereiding van platen
    1. Een dag voorafgaand aan de eierstokweefsel voor transplantatie ontdooien
      1. Plaats een stukje van een film van kunststof paraffine aan de onderkant van een 50 mm petrischaal, spuiten met 70% Ethanol totdat het volledig zullen worden gedekt.
      2. Laat de petrischaaltjes 's nachts in het biosafety kabinet. 2 petrischalen per muis voor te bereiden.
    2. Op de dag van chirurgische ingrepen
      1. De ethanol uit de petrischaal met de plastic paraffine film binnen het kabinet biosafety gecombineerd.
      2. Laat de petrischaal leiding half open tot ethanol volledig verdampt is.
      3. Sluit het deksel van de petrischaal wanneer de kunststof paraffine-film helemaal droog is. Houd het binnen het biosafety kabinet.
      4. Label putjes van een 6 plaat goed dienovereenkomstig, 0,1 mol/L sacharose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacharose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sacharose, Basic ontdooien oplossing (BTS), Medium.
  2. Bereiding van de oplossingen
    1. 100 mL BTS bereiden: Leibovitz van L-15 middellange 79 mL + FBS 20 mL + antibioticum-Antimycotic oplossing 1 mL. Filteren met een 0,22 µm filtersysteem.
    2. 10 mL van BTS met 0,1 mol/L sacharose te bereiden. Schaal 0.342 g van sacharose en voeg 10 mL van BTS bereid in stap 4.2.1, schudden zachtjes totdat de Sucrose volledig is opgelost. De oplossing met behulp van een injectiespuit filter 0,22 µm.
    3. Het bereiden van de oplossingen volgens tabel 1. Dekking van buizen met DMSO met aluminiumfolie. Gekoelde houden tot gebruik.

5. eierstokweefsel snel ontdooien

  1. Neem uit de LN2 dewar een flacon met bevroren eierstokweefsel en houd het bij kamertemperatuur voor 30 s.
  2. Veeg de flacon schoon met behulp van een papieren zakdoekje.
  3. Dompel de ampul in een waterbad van 30 ° C gedurende 1-2 min. tot de ' inhoud is ontdooid.
  4. Open de flacon en plaats van de corticale strip in de eerste put waarin 3ml van de eerste oplossing (0,1 mol/L sacharose + 1 mol/L DMSO, bereid in stap 4.2.3).
    Opmerking: Alle stappen, waarbij het deksel van de plaat te openen zal gebeuren onder laminaire flow.
  5. Incubeer de 6 goed plaat op een roterende plaat bij 4 ° C gedurende 5 min. Houd de plaat bedekt met aluminiumfolie voor deze stap.
  6. Breng de corticale strip in de tweede goed met 3 mL van de tweede oplossing (0,1 mol/L sacharose + 0,5 mol/L DMSO, bereid in stap 4.2.3).
  7. Incubeer de 6 goed plaat op een roterende plaat voor zachte agitatie bij 4 ° C voor 5 min. Houd de plaat bedekt met aluminiumfolie voor deze stap.
  8. Breng de corticale strip in het derde goed, met 4 mL van oplossing (BTS met 0,1 mol/L sacharose, bereid in stap 4.2.2).
  9. Incubeer op een roterende plaat voor zachte agitatie bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  10. Breng de corticale strip in de vierde goed met 4 mL van oplossing (BTS, bereid in stap 4.2.1).
  11. Incubeer op een roterende plaat voor zachte agitatie bij 4 ° C gedurende 5 minuten.
  12. Breng de corticale strip in de laatste goed met 4 mL koud medium (bereid in stap 2.1.1). Houd ontdooide eierstokweefsel op ijs tot het uitvoeren van de transplantatie.

6. de inkapseling van de eierstokweefsel

  1. Voorbereiding van de volgende oplossingen
    1. 25 mL 20 mmol/L HEPES-buffer in een zoutoplossing 0,9% voor te bereiden. Filter en winkel bij 4 ° C.
    2. 1 mL van CaCl2 op de concentratie van 1 mol/L. Filter voor te bereiden en bewaren bij 4 ° C.
  2. Bereiden van een stamoplossing van fibrinogeen 50 mg/mL
    1. Voeg 1 g fibrinogeen in 20 mL 20 mmol/L HEPES-buffer in de zoutoplossing 0,9% door het langzaam mengen van fibrinogeen in de HEPES gebufferde zoutoplossing over enkele uren bij 37 ° C.
    2. Label 1,7 mL micro-centrifuge buizen.
    3. Filtreer de oplossing door een 0,45 µm spuit filter en vervolgens door een 0,2 µm spuit filter.
    4. Aliquot de oplossing in 200 µL in micro-centrifuge buis en winkel bij-20 ° C.
  3. Bereiden van een stamoplossing van trombine 100 U/mL
    Opmerking: Trombine oplossingen adsorberen aan glas, aliquoot de oplossing in kunststof buizen/flesjes.
    1. Toevoegen van 2.5 mL steriele zoutoplossing 0,9% tot 250 U van trombine.
    2. Zacht schudden tot de oplossing voor het volledig los.
    3. Label 1,7 mL micro-centrifuge buizen.
    4. Filtreer door een 0,2 µm spuit filter, aliquoot 50 µL in micro-centrifuge buizen en winkel bij-80 ° C.
  4. Maak een fibrine clot van 70 µL, verkrijgen een eindconcentratie van 10 mg/mL fibrinogeen en 5 U/mL trombine
    Opmerking: Zorg ervoor dat het werk snel, de oplossing stolsels in een paar seconden. Vermijd ook de toevoeging van bubbels aan het mengsel.
    1. Bereid een fibrinogeen oplossing in een tube van 1,7 mL micro-centrifuge.
      1. Toevoegen van 360 µL van 20 mmol/L HEPES-Buffer in de zoutoplossing 0,9% tot de aliquoted 200 µL van de voorraad van fibrinogeen, bereid in stap 6.2.4.
      2. Meng door zachte pipetteren.
      3. Houd het op ijs.
    2. Bereid een trombine oplossing in een tweede micro-centrifuge buis.
      1. Toevoegen van 148.7 µL van DMEM aan de aliquoted 50 µL van de voorraad van trombine, bereid in stap 6.3.4.
      2. Meng door zachte pipetteren.
      3. Voeg 1.3 µL van 1 mol/L CaCl2.
      4. Meng door zachte pipetteren.
      5. Houd het op ijs.
    3. Maak een suspensie van eencellige, In een derde micro-centrifuge buis.
      1. Loskoppelen van de gemanipuleerde endotheliale cellen van de plaat met behulp van een enzym cel detachement medium.
      2. Spin down de en tellen van de cellen met behulp van een hemocytometer met een glazen cover.
      3. 20.000 cellen per elke 1 mm2 van eierstokweefsel gebruiken. Berekenen van 20.000 x oppervlakte van eierstokweefsel in mm2.
      4. Spin down de gemanipuleerde endotheliale cellen en resuspendeer het in voedingsbodem (DMEM) tot een totaal volume van 16,8 µL.
      5. Houd het op ijs.
    4. Plaats een stukje weefsel van de eierstokken op een steriel gaas spons het drogen voor een paar seconden.
    5. Plaats het stuk van eierstokweefsel bovenop de kunststof paraffine film binnen de 50 mm petrischaal.
    6. Voeg 39.2 µL van de oplossing van fibrinogeen, bereid in stap 6.4.1.2, in de celsuspensie bereid in stap 6.4.3.4, Meng door zachte pipetteren. Houd het op ijs.
    7. Voeg 14 µL van de trombine oplossing bereid in stap 6.4.2.4. Meng zachtjes door pipetteren eens. Werk snel.
    8. Plaats het mengsel op de top van de eierstokweefsel, Pipetteer in de vorm van een langwerpige druppel.
    9. Plaats de petrischaal met de stollen in de incubator bij 37 ° C.

7. bilaterale oöforectomie en co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen NSG muizen

Opmerking: Tien tot veertien weken oude vrouwelijke NSG muizen21 werden gebruikt (Jackson Labs).

  1. Alle chirurgische tools, zoals uitgewerkt in stap 2.1.3 voorbereiden, zorg ervoor dat u alle hechtingen, pads en chirurgische banden handig.
  2. Anesthetize de muis een verdoving systeem met Isofluraan.
    1. Plaatst u de muisaanwijzer in de zaal van inductie, sluit deksel en open de juiste afsluiter.
    2. Open debietmeter aan 1000 mL/min. Zet de vaporizer en selecteer het te leveren 2-3,5%.
    3. Observeren van de effecten van de verdoving; verlies van bewustzijn, traag en regelmatige adem.
    4. Overbrengen naar de neus te handhaven van de verdoving. Zet de vaporizer om te verlossen 1-3%, afhankelijk van de vitale functies.
    5. Controleer of de afwezigheid van pedaal of staart reflex. Als de reflex aanwezig is, verhoog Isofluraan totdat het is afwezig.
  3. Knippen van de muis terug haar, van de staart tot de sleutelbeenderen lijn, met behulp van een elektrische tondeuse.
  4. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggend op de chirurgische platform.
  5. De neus aan het chirurgische platform met behulp van een chirurgische tape vast te stellen.
  6. De ledematen van de muis voorzichtig aan het chirurgische platform met behulp van een 1,25 cm-breed chirurgische papier tape tape.
  7. Gebruik van een steriele smeermiddel gelei en voeg een thermometer PR. Fix de thermometer door het aan het chirurgische platform met behulp van een 1,25 cm breed geperforeerde kunststof chirurgische tape vast te binden.
  8. Tape de staart naar de chirurgische platform met behulp van een 2,5 cm breed chirurgische papieren rompslomp.
  9. Warmte, met behulp van een infrarood- of een verwarming pad, warmwater en controleren van de muis lichaamstemperatuur tijdens de gehele procedure. Houden van lichaamstemperatuur binnen het bereik van 35-37 ° C.
  10. Reinig het bijgesneden gebied met een steriele Povidon-jodium oplossing wattenstokje stok en veeg met behulp van steriele alcohol prep.
  11. Herhaal stap 6,9 tweemaal meer.
  12. Breng een druppel van steriele oogbeschadigingen en/of glijmiddel dierenarts zalf over elk van de muis de ogen te beschermen tegen uitdroging en beschadiging van het hoornvlies.
  13. Dekking van de muis met behulp van een steriele chirurgische draperen.
  14. Injecteren van buprenorfine (1 mg/Kg) sub cutane (S/C).
  15. Het uitvoeren van een longitudinaal mediale dorsale incisie met behulp van een scalpel (mes #21).
  16. Een bilaterale oöforectomie uitvoeren, gebruikt u een dorsale aanpak.
    1. Gratis het onderhuids bindweefsel door botte dissectie met behulp van de schaar.
    2. Knijp de fascia lateraal aan de middellijn make een incisie en bereiken de peritoneale holte met behulp van de scherpe schaar.
    3. Pak de ovariële vet pad en het vruchtbeginsel voorzichtig met een pincet en trek hem uit de buikholte.
    4. Pak het ovarium en het vet pad met een vasculaire klem.
    5. Het afbinden van de eierstok en de vet pad met behulp van een 4/0 monofilamenten absorbeerbare Sutuur (geologie) aan de voet van de eierstok, distale naar de eileider.
    6. Clip van de eierstok distale tot het gelijkspel. Zorg ervoor dat er geen bloeden uit de basis van de stomp.
    7. Plaats het weefsel terug in de buikholte en de fascia met behulp van een gevlochten absorbeerbare hechtdraad 6/0 suture.
    8. Herhaal de fasen 7.15.1-7.15.7 aan de contralaterale zijde.
  17. Co transplantatie de eierstokweefsel.
    1. Uitvoeren van een horizontale snede in de fascia boven de Gluteus Maximus, op de lengte die de stolsels afmetingen past. Maak een zak binnen deze virtuele ruimte door het openen van de schaar onder de fascia.
    2. Pick-up een stukje ingekapselde corticale weefsel, zoals voorbereid in stap 6.4.8 en plaats het in deze zak.
    3. Sutuur (geologie) de fascia met behulp van een 6/0 gevlochten absorbeerbare hechtdraad.
  18. Herhaal de fasen 7.16.1-7.16.3 aan de contralaterale zijde ook.
  19. Sluit de dorsale muur met behulp van eenvoudige onderbroken steken met een 4/0 monofilamenten absorbeerbare hechtdraad.
  20. Lidocaïne injecteren 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C op de site van de snede.
  21. Gebruik een steriele alcohol prep te reinigen van de huid.
  22. De Isofluraan uitschakelen terwijl de muis de temperatuur te bewaken.
  23. 1-2 min van O2, zonder Isofluraan bieden. Houden aan opwarming van de aarde de muis totdat het begint te bewegen en terug te keren naar bewustzijn.
  24. Plaatst u de muisaanwijzer in een schone herstel kooi en later het huis van de muis in een aparte kooi tot de volledige genezing van de chirurgische wond.
  25. Injecteren buprenorfine (1 mg/Kg) S/C desgewenst elke 8-12 h, gedurende 24 uur postoperatief.
  26. Houd de muizen in aparte kooien wanneer alle voedsel, water, beddengoed en kooien gesteriliseerde met autoclaaf, tot het eindpunt van het experiment zijn. Houd de kooien in een hydrofoor geventileerde kamer. Gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen wanneer de behandeling van de muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te bepalen of mede transplantatie van ExECs voorziet in een uitkering aan patiënten weefsel, werden ontdooide ovariële corticale strips verdeeld in gelijke grootte stukken en bilateraal geaccepteerd in immuno-gecompromitteerd, knik scid gamma (NSG), muizen. Met één kant ingebed in een fibrine clot alleen (geen ECs) en de andere met ExECs (Figuur 1a), diende elke muis als haar eigen controle. ExECs werden verkregen via isolatie van primaire endotheel van me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier tonen we dat mede transplantatie van exECs biedt een aanzienlijk voordeel eierstokweefsel levensvatbaarheid en functie na xenograft in muizen. Normen voor klinische toepassing van eierstokweefsel auto-transplantatie voor behoud van de vruchtbaarheid geweest niet set en de optimale parameters (grootte, transplantatie site, duur van de graft, enz.) 32 , 33 , 34 voor verbeterde herstel van het folliculaire zwembad bli...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Michael Ginsberg is een vaste medewerker van Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Verenigde Staten, die geïsoleerd, transfected met E4-ORF-1 en het label van de endotheliale cellen die we gebruikten.

Dankbetuigingen

Omar Alexander Man voor de illustraties.
L.M. werd gesteund door een Pilot-Award van de Cornell klinische en Translational Science Center en een ASRM onderzoek subsidie.
De auteurs bedank James lab leden voor de kritische lezing van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Leibovitz’s L-15 mediumGibco11415064
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062Anti-Anti X100
SucroseSigmaS 1888
FibrinogenSigmaF 8630from bovine plasma
ThrombinSigmaT 1063from human plasma
DMSOSigmaD 2650
DMEMGibco12491015
Enzyme Cell Detachment MediumInvitrogen00-4555-56Accutase
Plastic paraffin filmBemis NAParafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm3M1530-1Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm3M1530-0Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm3M1527-0Transpore
Monofilament Absorbable SutureCovidienUM-203Biosyn
Braided Absorbable SutureCovidienGL-889Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10%Purdue Products67618-153-01Betadine Solution Swab Stick
CryovialesNunc377267CryoTube
sterile ocular lubricantDechra17033-211-38Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tubeDenvilleC-2172Eppendorf
Anasthesia systemVetEquipV-1 table top system with scavenging
Endothelial cellsAngiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USAIsolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stainSigmaHT15-1ktTrichrome Stain (Masson) Kit
IsolectinInvitrogenI32450isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

Referenties

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475(2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003(2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162(2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Co transplantatie van eierstofweefselengineering van endotheelcellenfibrinestolvormingmuis xenograft modelanalyse van folliculaire ontwikkelinglevering van paracriene signaleringstrategie voor ischemiereductiemodulatie van folliculaire activatielevensvatbaarheid van cryopreserveerd weefselexpressie van het anti M llerse hormoon
Co transplantatie van menselijke eierstokweefsel met gemanipuleerde endotheliale cellen: een combinatie van cel-gebaseerde strategie versneld perfusie met directe Paracrine levering
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.