Methodenartikel

Generatie van High-Throughput driedimensionale Tumor spheroïden voor Drug Screening

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57476

⸱

5 september 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oncology Drug Discovery: Molecular Pharmacology, Novartis Institutes for Biomedical Research, 2Chemical Biology and Therapeutics, Novartis Institutes for Biomedical Research

In dit artikel

Samenvatting

Over een breed scala van indicaties van de ziekte, meer fysiologisch relevante modellen worden ontwikkeld en uitgevoerd in drug discovery-programma's. Het nieuwe modelsysteem hier beschreven demonstreert hoe driedimensionale tumor spheroïden kunnen worden gekweekt en vertoond in een high-throughput 1536-well plaat-gebaseerd systeem om te zoeken naar nieuwe oncologie drugs.

Samenvatting

Kankercellen hebben routinematig zijn gekweekt in twee dimensies (2D) op een kunststof ondergrond. Deze techniek, mist echter de ware milieu een tumor massa wordt blootgesteld aan in vivo. Solide tumoren groeien niet als verbonden met kunststof blad, maar in plaats daarvan als een verzameling van klonen cellen in een driedimensionale (3D) ruimte interactie met hun buren en met verschillende ruimtelijke eigenschappen zoals de verstoring van de normale cellulaire polariteit. Deze interacties veroorzaken 3D-gekweekte cellen te verwerven van morfologische en cellulaire kenmerken die meer relevant voor in vivo tumoren zijn. Bovendien, een tumor massa is in direct contact met andere celtypes zoals stromale en immuun cellen, evenals de extracellulaire matrix van alle andere celtypes. De matrix gestort bestaat van macromoleculen zoals collageen en fibronectine.

In een poging om de vertaling van de onderzoeksresultaten in Oncologie van bench naar bed, zijn veel groepen begonnen met het gebruik van 3D-modelsystemen in hun drugsstrategieën ontwikkeling onderzoeken. Deze systemen worden verondersteld te zijn meer fysiologisch relevant omdat ze proberen te recapituleren van de complexe en heterogene omgeving van een tumor. Deze systemen, kunnen echter vrij complex en hoewel vatbaar voor groei in 96-Wells-formaten, en sommige nu zelfs in 384, ze weinig mogelijkheden voor grootschalige groei en screening. Dit waargenomen kloof heeft geleid tot de ontwikkeling van de methoden die hier worden beschreven in detail aan cultuur tumor spheroïden in een hoog-productie capaciteit in 1536-Wells-platen. Deze methoden vormen een compromis voor de zeer complexe matrix gebaseerde systemen, die moeilijk op scherm, en conventionele 2D testen. Een verscheidenheid van kanker cellijnen herbergen verschillende genetische mutaties zijn succesvol gescreend, samengestelde werkzaamheid te onderzoeken met behulp van een curator bibliotheek met verbindingen richten de Mitogen-Activated proteïne Kinase of MAPK-pathway. De sferoïde cultuur antwoorden worden dan vergeleken met de reactie van cellen gekweekt in 2D, en differentiële activiteiten worden gemeld. Deze methoden bieden een unieke protocol voor het testen van samengestelde activiteit in een 3D omgeving van hoge gegevensdoorvoer.

Inleiding

In het afgelopen decennium hebben meer en meer studies het gebruik van 3D cel cultuur modellen te begrijpen concepten die niet volledig door de groeiende cellen in 2D op plastic zijn gerecapituleerd geïmplementeerd. Voorbeelden van deze concepten zijn de afwisseling in normale epitheliale cel polariteit1 waar de ruimtelijke oriëntatie van apicale en basale lagen van cellen zijn verloren, evenals de rol van de extracellulaire matrix bij het reguleren van de overleving en het lot van de cel. Oncologie onderzoek, heeft in het bijzonder 3D-modellen gebruikt om te begrijpen van de fundamentele biologie van kankercellen en de verschillen tussen 2D en 3D cel cultuur systemen3,4. De ontwikkeling van meer geavanceerde cel cultuur technieken en hun verdere aanpassing aan multi goed formaten heeft de zoektocht naar nieuwe geneesmiddelen in 3D instellingen ingeschakeld. In tegenstelling tot cellen gegroeid onder 2D, 3D-modellen van tumoren variëren in complexiteit verschillen van gelaagde cellulaire systemen5 tot single-cell-type bollen van verschillende grootte, tot complexe multi-cell-type bollen6,7, 8. de ontdekking van nieuwe verbindingen of biologics die krachtig het induceren van celdood in deze 3D-model-systemen is daarom van groot belang in drug ontwikkeling campagnes. Eindpunten van deze tests zijn vaak identiek zijn aan die uitgevoerd in 2D culturen te beoordelen van wijzigingen in celproliferatie, maar wanneer uitgevoerd in een meer fysiologisch relevante omgeving, zij kunnen openbaren de ware niveau van afhankelijkheid van de target-gen of het traject wordt ondervraagd.

Zoals hierboven geïntroduceerde, allerlei modelsystemen zijn ontwikkeld om te studeren drug reacties in 3D cultuur systemen, maar de meeste gebruiken beide 96 of 384-well microtiterplaat platen en zijn niet gemakkelijk aan te passen aan de high-throughput screening (HTS) formaten vaak gebruikt in Drug discovery screening campagnes. Dergelijke systemen omvatten het gebruik van opknoping druppel technologieën, sferoïde culturen, pulserende cellen met magnetische deeltjes ertoe levitatie, en culturen waarin natuurlijke of synthetische gels zoals collageen, Matrigel of polyethyleenglycol (PEG)2 . Hier presenteren we de gedetailleerde methoden van een eerder ontwikkelde techniek om het produceren van 3D sferoïde culturen van gevestigde kanker cellijnen in een formaat van 1536-well plaat. In dit protocol wordt een zeer beschreven medium gebruikt waardoor de bevestiging van normaal aanhangend cel lijnen9. Dit systeem heeft beperkingen (dat wil zeggen, het kan niet volledig recapituleren een complex modelsysteem van kanker), maar toch deze testen een high-throughput screening van grote verzamelingen van kleine moleculen en kruiselings vergelijkingen van drug antwoord inschakelen tussen 2D en 3D culturen tegen allerlei soorten cellijnen en verbindingen.

De cellijnen geselecteerd om aan te tonen van de methoden in dit artikel alle harbor mutaties in de genen aan de MAPK weg, een weg die zeer dysregulated in kanker, signalering gerelateerde en voor welke veel therapieën beschikbaar zijn. Veel van de lijnen hebben activeren oncogene mutaties in het Kirsten Rat Sarcoom virus ook wel genoemd de KRAS, de neuroblastoom RAS of NRI's de Harvey Rat Sarcoom virus oncogen of HRAS en de bijbehorende kinases snel versnelde fibrosarcomen, ook bekend als RAFs. Recente literatuur suggereert dat de inhibitors van verschillende knooppunten van dit traject uniek doeltreffender in een subset van de cellijnen zijn als volwassen onder 3D voorwaarden9,10. Één studie vond toen kankercellen met actieve RAS werden gekweekt in 3D, dat zij een verhoogde gevoeligheid voor MAPK remmers aangetoond, en verder, dat deze aanpak kon identificeren trajecten en gerichte remmers die zou kunnen worden gemist in de traditionele 2D instelling. Het doel van deze studie is om te presenteren van de methoden die voor de cultuur van deze cellijnen en verder, om aan te tonen het verschil reacties op deze remmers die kunnen worden waargenomen, alleen bij het gebruik van 3D cel cultuur systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. het kweken van 1536-well 3D Tumor spheroïden

  1. Voorbereiding van een verse 3D tumor sferoïde middellange stam (cel medium + knock-out serum vervanging insuline-transferrine-selenium) door de volgende reagentia toe te voegen aan 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagles Medium (DMEM/F12): 1 x penicilline/streptomycine, 10 ng/mL van de mens fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF), 20 ng/mL van menselijke epidermale groeifactor (EGF), 0,4% bovien serumalbumine (BSA) (deel V), 1 x insuline-transferrine-selenium, en 1% knock-out (KO) serum vervanging (doen niet bevriezen-ontdooien).
  2. Filter-steriliseren het gehele medium met de supplementen via een 0.4 µm fles-top-filtersysteem.
  3. Loskoppelen van de cellijnen van kanker, die zijn gegroeid volgens aanbevolen routine kweekomstandigheden, van de traditionele cultuur van de cel kolven door wassen ze 3 x met 1 x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het toevoegen van een geschikte hoeveelheid van een 0,25% trypsine (1 mL per 5 cm2) gedurende 5 minuten om te maken van een dun laagje over de gewenste cellen. Neutraliseren van de trypsine met 5 x het bedrag van het medium met het serum en overgaan tot de cellen tellen. Gebruik bijvoorbeeld 25 mL voedingsbodem voor 5 mL trypsine.
  4. De concentratie van de oplossing van de cel voor 62,5 x 104 cellen/mL aanpassen om zaad van een totaal van 500 cellen per putje in 8 µL van sferoïde medium in de 1536-well weefsel-cultuur-testgroep platen.
  5. Seed in een biologische veiligheid kabinet, de cellen een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette met een peristaltische pomp gebaseerde systeem. Tussen verschillende cellijnen, spoel de slang van de cassette met 1 x PBS en 70% Ethanol voor 10 s.
  6. U kunt ook zaad de cellen met behulp van een vloeibare handler gelegen binnen een HEPA-gefilterd kamer met behulp van een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette en een peristaltische pomp of een bijgevoegde-spuitpomp, afhankelijk van het aantal platen per cellijn nodig.
  7. Het zegel van de platen met behulp van een ademend zelfklevende plaat zegel ofwel handmatig of met behulp van een plaat sealer.
  8. Plaats de platen in een draaiende incubator vastgesteldop 10 rpm en 37 ° C met 5% kooldioxide (CO2) en 95% relatieve vochtigheid. Toestaan dat de spheroïden naar formulier voor 3 d.

2. kweken van 1536-well 2D kanker lijnen

Opmerking: De 1536-well 2D kanker lijnen moeten worden gekweekt 24 h vóór de toevoeging van de stof aan de 3D platen.

  1. Een 2D kanker cel medium voor te bereiden door de volgende reagentia tot 500 mL van een geschikte groeimedium voor de geselecteerde regels toe te voegen: 1 x penicilline/streptomycine en 10% foetale runderserum (FBS).
  2. Filter-steriliseren het gehele medium met de supplementen via een 0.4 µm fles-top-filtersysteem.
  3. Loskoppelen van de cellijnen van kanker, die zijn gegroeid volgens aanbevolen routine kweekomstandigheden, van de traditionele cultuur van de cel kolven door wassen ze 3 x met 1 x PBS en het toevoegen van een geschikte hoeveelheid van een 0,25% trypsine (1 mL per 5 cm2) gedurende 5 minuten aan Maak een dunne laag over de gewenste cellen. Neutraliseren van de trypsine met 5 x het bedrag van het medium met het serum en overgaan tot de cellen tellen. Gebruik bijvoorbeeld 25 mL voedingsbodem voor 5 mL trypsine.
  4. De concentratie van de oplossing van de cel voor 62,5 x 104 cellen/mL aanpassen om zaad van een totaal van 500 cellen per putje in 8 µL van volledige medium in 1536-well weefsel-cultuur-testgroep platen.
  5. Seed in een biologische veiligheid kabinet, de cellen een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette met een peristaltische pomp gebaseerde systeem. Tussen de verschillende cellijnen, spoel de slang van de cassette met 1 x steriele PBS en 70% Ethanol voor 10 s.
  6. U kunt ook zaad de cellen met behulp van een vloeibare handler gelegen binnen een HEPA-gefilterd robotica-kamer met behulp van een gesteriliseerde, kleine roestvrij-staal-tipped cassette en een peristaltische pomp of de bijgevoegde-spuitpomp, afhankelijk van het volume van de platen per cel lijn nodig.
  7. Het zegel van de platen met behulp van een ademend zelfklevende plaat zegel ofwel handmatig of met behulp van een plaat sealer.
  8. Plaats de platen in een draaiende incubator vastgesteldop 10 rpm en 37 ° C gedurende 24 uur vóór de samengestelde toevoeging, met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.

3. samengestelde toevoeging

  1. Maak 8-punts, 3 katernen seriële verdunningen van MAPK remmers in 100% dimethylsulfoxide (DMSO) op een vloeistof-handling robot met de hoogste concentratie van een 10 mM. Het proteasoom-remmers Bortezomib wordt gebruikt als positieve controle voor een volledige cel doden om te bepalen van het dynamisch bereik van de bepaling.
  2. Quick-spin all assay platen en samengestelde platen op 100 x-g te verzamelen condensatie. De Zelfklevende zegel uit elke plaat verwijderen en plaatsen van een plaat op een akoestische dispenser set-up om toe te voegen voor een totaal van 8 nL van elke stof/verdunning vertegenwoordigen een eindconcentratie van 0,1% DMSO per putje en een top samengestelde dosis van 10 µM.
  3. Nadat de toevoeging van de verbinding is voltooid, plaats de deksel van een op maat gemaakte, roestvrij stalen cel-cultuur die voorkomt verdamping op de plaat en plaats van de plaat in een incubator van de spinnen bij 37 ° C voor 5 d, met 5% CO2 en 95% relatieve vochtigheid.

4. detectie reagens toevoeging en de verwerving van Raw-gegevens

  1. Vooraf warm een voldoende volume van lysis van de cel reagens met luciferine om te detecteren veranderingen in adenine adenosinetrifosfaat (ATP) en, dus, veranderingen in de celproliferatie bij kamertemperatuur of in een waterbad 37 ° C. Een totaal van 3 µL van het detectie-reagens toevoegen aan elk putje gebruik een peristaltische pomp en Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten.
  2. Het vastleggen van de luminescentie op een plaat luminometer.

5. de verwerking van de gegevens

  1. Pak de onbewerkte gegevens van het instrument en normaliseren van alle velden die bevatten test verbindingen met het gemiddelde van alle putjes met DMSO alleen als het neutrale besturingselement. Van deze waarde, berekenen de percentage groeiremming van elke stof. Dit is voltooid met behulp van de formule functie in Microsoft Excel waar f (x) = {(genieten van de relatieve waarde licht eenheden (RLUs) / (gemiddelde DMSO waarde RLUs) * 100)}.
  2. Het genereren van de dosis / respons-curven en remmende IC50s door de waarden van de genormaliseerde gegevens uit stap 5.1 tegen de samengestelde concentratie met behulp van een grafische programma graphing.
    Opmerking: We analyseerde de gegevens met behulp van Helios, een interne NIBR softwaretool. Om deze functie te voeren, wij de niet-parametrische kromme Analysetool geselecteerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een verscheidenheid van gevestigde kankercel lijnen bekend groeien goed onder 2D kweekomstandigheden werden getest met behulp van de methoden hier. Representatieve beelden uit een verscheidenheid van MAPK mutant kanker cellijnen (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS en KNS-62:HRAS) zijn te zien in Figuur 1. Deze beelden tonen aan dat hoewel de cellijnen verschillende morphologies hebben, elk gevormd 3D structuren in de 1536-well assay-platen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier gepresenteerde methoden aantonen een gedetailleerd protocol over het produceren van tumor spheroïden in 1536-Wells-platen voor grootschalige samengestelde screenings. Deze methoden zijn in eerste instantie aangepast vanaf werk aan het National Cancer Institute, waar de tumor spheroïden werden geteeld in lage-throughput assays in 6-well en 96-wells-platen om vragen te stellen over genetische afhankelijkheden en samengestelde gevoeligheid13, 14 ,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs zijn werknemers van Novartis, en sommige werknemers zijn ook aandeelhouders.

Dankbetuigingen

De auteurs wil erkennen Marc Ferrer aan het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institutes of Health voor zijn steun en begeleiding op de initiële ontwikkeling van deze tests. Daarnaast zouden we graag bedanken Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling en Vesselina Cooke voor hun wetenschappelijke inbreng en discussie als project teamleden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagents
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12ATCC30-2006Aangeschaft als een voorbereide oplossing. Dit recept werd als beter bevonden in vergelijking met andere leveranciers.
DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12Lonza12-604FAangeschaft als een voorbereide oplossing.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Lonza12-115QAangeschaft als een voorbereide oplossing.
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-500Aangeschaft als een voorbereide oplossing.
1x 0.25% Trypsin met Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)HycloneSH30042.01Aangeschaft als een voorbereide oplossing.
1x Penicillin/StreptomycinGibco15140Aangeschaft als een voorbereide oplossing.
10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF)SigmaF0291Opnieuw gesuspendeerd in steriel water.
20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF)SigmaE9644Opnieuw gesuspendeerd in steriel water.
0.4% Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA9418Opnieuw gesuspendeerd in steriel PBS en gefilterd.
1x Insulin Transferrin Selenium (ITS)Gibco51500056
1% KnockOut (KO) Serum ReplacementGibco10828-028Voeg vers toe vlak voor gebruik.
100% Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma276855-100ML
CellTiter-GloPromegaG7573Aangeschaft als een voorbereide oplossing.
Consumables
Small Combi CassetteThermoFisher24073295
Small Multiflow CassetteBioTek294085
1536-well sterile TC plates (white)Corning3727
1536-well sterile TC plates (black)Corning3893
Scivax PlatesMBL InternationalNCP-LH384-10
Equipment
Adhesives sealsThermoFisherAB0718
Spinning IncubatorLiCONiC
Stainless Steel LidsThe Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF)
ATS Acoustic DispensorEDS Biosystems
Echo Acoustic DispensorLabcyte
LuminometerEnvision-Perkin Elmer
Peristaltic Pump- Multidrop CombiThermoFisher
Liquid Handler-Multiflow FXBioTek

Referenties

  1. Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
  2. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  3. Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
  4. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
  5. Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
  6. Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
  7. Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
  8. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  9. Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).
  10. Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786(2010).
  11. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  12. Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976(2016).
  13. Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267(2010).
  14. Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
  15. Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
  16. Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
  17. Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
  18. Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
  19. Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
  20. Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
  21. Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High throughputscreening1536 wellsplaten3D celkweekkankercellijnenMAPK padspinnende incubatorakoestische dispenserATP luminescentie

Gerelateerde artikelen