Methodenartikel

Kwantificering van intracellulaire groei binnen macrofagen is een snel en betrouwbare methode voor de beoordeling van de virulentie van Leishmania parasieten

DOI:

10.3791/57486

⸱

16 maart 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle pathogene Leishmania soorten zich bevinden en repliceren in macrofagen van hun gewervelde gastheren. Hier presenteren we een protocol om te infecteren lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen in cultuur met Leishmania, gevolgd door precieze kwantificering van intracellulaire groei kinetiek. Deze methode is handig voor het bestuderen van de afzonderlijke factoren beïnvloeden host-pathogen interactions en Leishmania virulentie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De levenscyclus van Leishmania, de verwekker van leishmaniasis, afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen de insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk. Terwijl pathogene symptomen van leishmaniasis sterk, van goedaardige cutane letsels aan zeer dodelijke viscerale ziekte naar gelang van de infectieuze soorten, vormen variëren kunnen alle Leishmania soorten zich bevinden binnen de gastheer macrofagen in de gewervelde fase van hun levenscyclus. Leishmania infectiviteit is dus direct gerelateerd aan haar vermogen om vallen, overleven en repliceren binnen parasitophorous vacuolen (PVs) in macrofagen. Dus fungeert beoordelen of de parasiet de bekwaamheid om te repliceren intracellulair als een betrouwbare methode voor het bepalen van de virulentie. Bestuderen van leishmaniasis ontwikkelen met behulp van diermodellen is tijdrovend, vervelend en vaak moeilijk, met name met de pathogenically belangrijk viscerale vormen. Hier beschrijven we een methodologie om de intracellulaire ontwikkeling van Leishmania in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs) volgen. Intracellulaire parasiet aantallen zijn vastgesteld op 24u tijdstippen gedurende 72-96 uur na infectie. Deze methode zorgt voor een betrouwbare bepaling van de effecten van verschillende genetische factoren op Leishmania virulentie. Als voorbeeld, laten we zien hoe een één allel schrapping van de Leishmania mitochondriale ijzer Transporter gen (LMIT1) belemmert het vermogen van de Leishmania amazonensis gemuteerde stam LMIT1/ΔLmit1 om te groeien binnen de BMMs, Als gevolg van een drastische vermindering in virulentie in vergelijking met wild-type. Deze test maakt ook nauwkeurige controle van de proefomstandigheden, die individueel kan worden gemanipuleerd om het analyseren van de invloed van verschillende factoren (voedingsstoffen, reactieve zuurstof soorten, enz.) op de host-pathogen interactions. Daarom bieden de juiste uitvoering en kwantificering van BMM infectie studies een niet-invasieve, snel, voordelig, veilig en betrouwbaar alternatief voor conventionele diermodel studies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmaniasis verwijst naar een breed spectrum van ziekten bij de mens veroorzaakt door eencellige parasiet soorten van het geslacht Leishmania. Ongeveer 12 miljoen mensen zijn momenteel geïnfecteerd met Leishmania wereldwijd en meer dan 350 miljoen worden bedreigd. De pathologie ziekte hangt af van de soort Leishmania en gastheer factoren en symptomen variëren van onschuldige zelfhelend letsels van de huid tot dodelijke visceralizing vormen. Indien onbehandeld, viscerale leishmaniasis dodelijk is, ranking pas na malaria als de dodelijkste ziekten bij de mens veroorzaakt door infectie met een eencellige parasiet1. Ondanks de brede verschillen in ziekte pathologie en symptomen hebben alle Leishmania soorten een afwisselend promastigote en amastigoot fasen binnen insecten en gewervelde gastheren, respectievelijk digenic-levenscyclus. Binnenkant gewervelde dieren, Leishmania target host macrofagen voor invasie en de vorming van parasitophorous vacuolen (PVs), zure compartimenten met eigenschappen van de phagolysosomes waar de formulieren zeer virulente amastigoot repliceren veroorzaken. Amastigotes aanhouden in gastheer weefsel gedurende chronische infecties en doorsturen naar niet-geïnfecteerde zandvliegjes, kunnen worden doorgegeven als voltooiing van de cyclus van de transmissie. Daarom, in het kader van de ontwikkeling van ziekten bij de mens, amastigotes zijn de belangrijkste Leishmania lifecycle vorm2. Onderzoeken hoe amastigotes repliceren binnen macrofaag PVs is van cruciaal belang voor het begrip Leishmania virulentie3,4,5,6,7 en voor de ontwikkeling van nieuwe werkzame therapieën.

Hier beschrijven we een methode regelmatig gebruikt door ons laboratorium Leishmania infectie en replicatie in beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs), waarbij kwantitatieve beoordeling van het aantal intracellulaire Leishmania na verloop van tijd te studeren. Het proces bestaat uit het verzamelen van monocyten van muis beenmerg en differentiatie macrofagen in cultuur, in vitro besmetting met infectieuze formulieren (metacyclische promastigoten of amastigotes) van Leishmania en kwantificering van de aantal intracellulaire parasieten op elk interval van 24 uur gedurende een periode van 72-96 uur na infectie. Deze test is gebruikt in ons laboratorium om te bepalen van het effect van verscheidene milieufactoren en parasiet genen, met inbegrip van identificatie van de kritische rol van ijzer bij de bevordering van L. amazonensis virulentie verder werd gevalideerd door de struikrover laesie ontwikkelingsstudies in muizen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Aangezien alle pathogene Leishmania soorten hun Dr. niche binnen host macrofagen stellen, kan deze test universeel worden gebruikt voor de analyse van de virulentie in alle Leishmania soorten.

Uitvoeren van BMM infecties kan analyse van gastheer-parasiet interacties op het niveau van eencellige, en dus een uitgebreider begrip van de wisselwerking tussen Leishmania parasieten en hun voorkeur host-communicatie, de PVs van macrofagen. Macrophage infectie testen zijn met succes gebruikt door meerdere groepen16,17,18,19,20,21,22 te verkennen functies van zowel de host macrofaag Leishmania specifieke genen en hun mogelijke betrokkenheid bij de complexe wisselwerking die kenmerkend intracellulaire infectie. BMM infecties toestaan kwantificering van de groei van de parasiet als een uitlezing van de invloed van gastheer factoren die van invloed zijn intracellulair overleven, zoals microbicidal stikstofmonoxide productie, generatie van reactieve zuurstof soorten en andere ongunstige omstandigheden opgetreden binnen het lysosoom-achtige PVs23. Macrophage infectie testen hebben ook gebruikt ter identificatie van potentiële anti-Leishmania drug leads voor therapeutische ontwikkeling13,24.

De in vitro -aard van de BMM infecties biedt diverse voordelen ten opzichte van andere methoden voor het beoordelen van Leishmania virulentie. Verscheidene vorige studies onderzoeken mechanismen van intracellulaire parasiet overleven na verloop van tijd heeft echter niet kwantificeren infectie als een tarief20,21,24. Bovendien, vele studies gericht op de volgende in vivo infecties na verloop van tijd gedaan door het meten van de grootte van de cutane laesie en andere fysiologische symptomen die slechts indirect gerelateerd zijn aan de parasiet replicatie25,26 , 27. in vivo infectie is een strenge aanpak om te beoordelen van de virulentie van de parasiet, maar laesie grootte metingen gebaseerd op struikrover alleen zwelling zijn vaak ontoereikend, omdat ze de inflammatoire respons in geïnfecteerde weefsels weerspiegelen en niet de absolute aantal parasieten. Om deze reden, struikrover laesie ontwikkeling testen moeten worden gevolgd door de kwantificering van de parasiet belasting in geïnfecteerde weefsels, testen een procedure waarvoor langdurige beperkende verdunning28. Daarnaast betrekken in vivo studies vaak offeren meerdere dieren op verschillende punten in de tijd om uit te pakken van weefsels van belang6,8,9,10, 11 , 13. daarentegen grote aantallen BMMs van slechts één dier kan worden verkregen, en deze cellen kunnen verguld worden onder voorwaarden die het mogelijk maken van beoordeling van infectie op verschillende momenten in de tijd. Voorts staat ten opzichte van in vivo studies, uitvoeren van in vitro BMM infecties meer controle over de proefomstandigheden. Kwantificeren van de macrofagen besmet samen met de parasieten zich maakt nauwkeurige controle van de veelheid van infectie (MOI) en kweekomstandigheden. Fijne controle over deze factoren kunnen zijn belangrijk bij het identificeren van de kenmerken van discrete cellulaire routes en in het begrip van hun effect op het verloop van de infectie.

Gezien deze voordelen, is het enigszins verrassend dat zeer weinig groepen bestuderen van Leishmania virulentie volledig voordeel van de kwantitatieve beoordeling van intracellulaire replicatie tot nu toe hebben genomen in macrofagen. In dit artikel bespreken we gemeenschappelijke valkuilen die kunnen worden belemmert het uitgebreider gebruik van deze bepaling, en een stapsgewijze protocol om de juiste uitvoering te vergemakkelijken. Gezien haar precisie en veelzijdigheid, de BMM infectie assay we hier beschrijven kan niet alleen worden gebruikt om te verkennen van de gastheer-pathogeen interacties Leishmania virulentie te beïnvloeden, maar ook om te studeren van andere micro-organismen die repliceren binnen macrofagen29. Nog belangrijker is, kan deze bepaling ook worden ontwikkeld als een snelle en voordelige preklinische screeningsmethode voor anti-Leishmania Geneesmiddelenontwikkeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden door de National Institutes of Health uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en zijn goedgekeurd door de IACUC van de Universiteit van Maryland. Alle stappen die worden beschreven in de punten 1 tot en met 4 mag aseptisch worden uitgevoerd binnen biologische laminaire flow kasten. Persoonlijke beschermingsmiddelen moet worden gebruikt, en voorzichtigheid moet worden betracht bij de verwerking van levende Leishmania parasieten in alle stadia van de experimenten.

1. isolatie en differentiatie van beenmerg-afgeleide macrofagen (BMMs)8,30,31

  1. Dag 0: 4 - 6 weken oude vrouwelijke C57BL/6 of BALB/c muis in een CO2 kamer opofferen en bevestig dood via cervicale dislocatie. Sterilisatie van schaar en pincet zorgen doordat ze gedrenkt in 70% ethanol. Spray handschoenen met 70% ethanol toe steriele behandeling gedurende het beenmerg proces voor de isolatie van de cel.
  2. Veilige geofferde muis naar dissectie boord door pinning zijn voorpoten en desinfecteer door spuiten aangenomen met 70% ethanol.
  3. Maken een kleine snede (ongeveer 1 cm) met een schaar in de buurt van het heupgewricht. Steek voorzichtig scharen onder de huid te scheiden van de onderliggende spier en het knippen van de huid al manier rond het heupgewricht.
    Opmerking: De dissectie van bestuur kan worden gedraaid zodat betere toegang hebben tot het heupgewricht.
  4. Zorgvuldig deglove huid van het been door te trekken naar de enkel en verwijderen. De voet afsnijden op de enkel, zeer voorzichtig te snijden op of onder de enkel gezamenlijk aan het scheenbeen volledig intact laten.
    Opmerking: De broche in dit stadium is losjes gekoppeld en gemakkelijk kan worden gescheiden met het pincet.
  5. Handmatig zoeken van het heupgewricht door het manipuleren van het dijbeen ter identificatie van het punt van rotatie. Zorgvuldig gebruik schaar te verbreken van het been boven het heupgewricht naar de proximale kop van het dijbeen intact laten.
  6. Verwijder zo veel spier- en bindweefsel mogelijk van het been met een schaar. Verwijder eventuele resterende huid van de enkel en eventuele overtollige beendermateriaal boven het heupgewricht.
  7. Plaats de schoongemaakte been botten in steriele RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine (1% eindconcentratie) in een petrischaal op ijs.
  8. Herhaal stap 1.4 via 1.6 te isoleren scheenbeen en het dijbeen van de andere achterpoot.
  9. Verwijder eventuele resterende spier- en bindweefsel uit de botten onderdompelen in RPMI met behulp van gesteriliseerde pincet en steriele #10 blade.
  10. Plaats de botten op de deksel van de petrischaal. Snij het scheenbeen zorgvuldig met het mes onmiddellijk boven het enkelgewricht tot het beenmerg. Verwijder de tibia van de rest van het been door het afsnijden direct onder het kniegewricht.
  11. Tekenen van 10 mL steriele RPMI aangevuld met penicilline/streptomycine (1% eindconcentratie) in een 10 mL spuit en bevestig een 25G naald.
  12. Houd het onderbeen stevig met een tang, verticaal boven een conische buis van 50 mL op ijs. Gebruik de spuit te injecteren zachtjes ongeveer 5 mL RPMI in het einde van de bot voor het spoelen van het beenmerg uit het andere uiteinde in de conische buis. Spoel het beenmerg met een totaal van 10 mL RPMI totdat het bot wit wordt.
    Opmerking: Na het grondig spoelen, het bot moet wenden wit. Als dat niet het geval is, blijven spoelen om te verwijderen van beenmerg. De distale einde van de tibia wellicht bijgesneden terug met het mes als het is te smal om in te voegen van de naald.
  13. Snijd het dijbeen onmiddellijk boven het kniegewricht en onmiddellijk onder het heupgewricht aan beide uiteinden van het bot voor toegang tot het merg bloot. Spoel het beenmerg uit het dijbeen met een totaal van 10 mL RPMI op dezelfde manier als het scheenbeen.
  14. Herhaal reinigen en spoelen stappen 1.6 via 1.13 met de resterende botten en beenmerg leeggemaakte cellen in een conische buis van één 50 mL verzamelen
    Opmerking: Als een bot op elk gewenst moment tijdens de dissectie voorafgaand aan bot spoelen breekt, gebruik niet het merg uit dit bot.
  15. De conische buis gebruikt voor het verzamelen van beenmerg gespoeld uit alle vier botten gedurende 10 minuten bij 4 ° C bij 300 x g centrifugeren.
  16. Plaats van 60 mL steriele BMM voedingsbodem (RPMI met een eindconcentratie van 20% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1.2 mM nb-pyruvaat, 25 µg Mo/mL menselijke M-CSF) in een maatkolf van 175 cm2 cel cultuur met filter dop.
  17. Verwijder het supernatant volgende centrifugeren en resuspendeer de pellet cel door zachte op en neer pipetteren met 5 mL van BMM medium uit de kolf.
  18. Celsuspensie in de erlenmeyer van de cultuur en spoel de conische buis tweemaal met BMM medium uit de cultuur kolf maximale cel invordering te waarborgen. Zorgen voor celsuspensie grondig wordt gemengd tot medium en distribueren van 30 mL van de eerste 175 cm2 cel cultuur kolf in een tweede 175 cm2 cel cultuur kolf met filter GLB.
  19. Incubeer beide kolven met 30 mL celsuspensie elke overnachting bij 37 ° C, 5% CO2 dat scheiding van eventuele contaminerende fibroblasten, resident macrofagen en andere Adherente cellen.
  20. Dag 1: Overdracht van de bovendrijvende substantie met ongedifferentieerde beenmergcellen van kolven aan 100 x 15 mm niet-TC-behandelde polystyreen petrischalen bij ongeveer 10 mL/schotel en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Gooi de kolven.
  21. Dag 3 of 4: Toevoegen van een extra 5 mL BMM medium (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) aan elke petrischaal en blijven incubatie bij 37 ° C, 5% CO2.

2. plating BMMs op Coverslips voor infectie (dag 7 of 8)

  1. 6-well weefselkweek platen door het plaatsen van vier (4) steriel 12 mm glas coverslips (gesteriliseerde met autoclaaf en opgeslagen in een gesloten glazen container) in de bodem van elke lege goed voor te bereiden.
    Opmerking: Halen elke steriele 12 mm dekglaasje aan met een zuigen tip gemonteerd op een vacuüm lijn. Plaats coverslips in de putjes zonder overlapping, vrijgeven op de gewenste positie door het knijpen van de buis vacuüm worden onderbroken.
  2. Aspirate media (en alle niet-aanhanger cellen) van petrischalen bekleed met aanhangend beenmerg afgeleid macrofagen en voorzichtig spoelen aanhanger cellen 2 x met de steriele Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium chloride (PBS- / -) vooraf opgewarmd tot 37 ° C.
  3. Voeg ontkleuring, 5 mL steriele 1 x PBS- / - met een eindconcentratie van 1 mM EDTA tot elke petrischaal en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 ° C loskoppelen van de aanhanger BMMs. Controleer dat de cellen zijn vrijstaand met behulp van een microscoop.
  4. Verzamel alle vrijstaande cellen gesuspendeerd in 1 x PBS- / - aangevuld met 1 mM EDTA in een conische tube van 50 mL. Spoel elke schotel 2 x met 5 mL PBS- / - en voeg toe aan cel schorsing zwembad.
    Opmerking: Celsuspensie kan worden verdund met extra PBS- / - ter bescherming van macrofagen van EDTA toxiciteit tijdens het proces van het verzamelen.
  5. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer macrofagen in 5-10 mL BMM medium door pipetteren. Geresuspendeerde plaats cellen op ijs ter voorkoming van gehechtheid aan buizen en samendoen.
  6. Levensvatbare cellen tellen met behulp van Trypan blauwe uitsluiting in de hemocytometer.
    Opmerking: Als u wilt tellen BMM cellen geresuspendeerde in 5 mL medium, een verdunning-mix van 25 µL celsuspensie in 445 µL PBS- /- en 30 µL 0,4% Trypan blauwe oplossing meestal maakt het mogelijk gemakkelijk kwantificering in een hemocytometer (rekening houdend met een 20 x verdunningsfactor voor de definitieve berekening ). Tellen alleen de cellen die niet ging krijgen gekleurd met Trypan blauw (levensvatbare cellen). Het volume van de celsuspensie kan worden gewijzigd als dit mengsel is te geconcentreerd of verdund. In het algemeen, varieert de opbrengst van de BMM per voorbereiding tussen 2 x 107 en 5 x 107 cellen uit een simpele muisklik.
  7. Voorbereiden van de celsuspensie in BMM medium bij gewenste plating concentratie (5 x 105/mL) en verspreiden van schorsing aan 6 goed platen in 2 mL medium per putje, zodat elk goed 1 x 106 macrofagen ontvangt.
    Opmerking: Dit is een kritieke stap die zorgt voor elke goed krijgt de voldoende aantal macrofagen ter dekking van de coverslips uniform. Controleer of de coverslips in putten niet overlappende of drijvend in het medium. Zo ja, voorzichtig aanpassen met een steriele pipette uiteinde.
  8. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C, 5% CO2.

3. de zuivering van besmettelijke vormen van L. amazonensis

Opmerking: Leishmania bereiden voor infecties - zuiveren van metacyclische promastigoten van stationaire promastigote culturen8,13, of onderscheiden van promastigoten in cultuur in amastigoot formulier met behulp van standaard L. amazonensis een differentiatie protocol6,8.

  1. Zuivering van Leishmania metacyclische promastigoten gebruiken dichtheid verlopende media(Materials) 33
    1. Stockoplossing van het 40% van de kleurovergang media dichtheid in steriele, endotoxine-gratis water voor te bereiden.
    2. Verdun de kleurovergang oplossing dichtheid in 10 x M199 medium (zonder serum) ter voorbereiding van 10% concentratie in het M199 medium.
    3. Filtreer alle oplossingen door 0,22 µm filter.
      Opmerking: Voorraad oplossingen kunnen worden achtergelaten bij 4 oC in het donker niet langer dan 1 maand.
    4. Voeg 2 mL van 40% dichtheid kleurovergang media-oplossing in de bodem van een conische centrifugebuis van 15 mL.
    5. Laag 2 mL 10% dichtheid kleurovergang media oplossing in M199 op de top van de laag van 40% dichtheid kleurovergang media zorgvuldig, met behulp van een pipet van Pasteur om te voorkomen dat elke vermenging tussen de twee lagen.
    6. 1 x 109 parasieten van stationaire-fase cultuur verzamelen door centrifugeren bij 1.900 x g gedurende 10 minuten.
    7. Resuspendeer de cellen in de 6 mL Dulbecco bewerkt essentiële Medium (DMEM).
    8. Laag 2 mL van de celsuspensie direct bovenop de 10% dichtheid kleurovergang media layer, zacht, met behulp van een pipet van Pasteur te vermijden mengen tussen lagen.
    9. Centrifugeer het verloop gedurende 10 minuten bij 1300 x g bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Als gevolg van verschillen in fysische eigenschappen tussen Leishmania soorten, CENTRIFUGEEROMSTANDIGHEDEN voor elk wellicht enigszins worden aangepast om ervoor te zorgen maximale opbrengst.
    10. Verzamelen parasieten (verrijkt in metacyclische promastigote vorm) van de band gevormd op de bovenste 10% dichtheid kleurovergang media grens (interface tussen de 0 en 10% dichtheid kleurovergang media lagen).
    11. Verdun parasieten met een volume van DMEM en verzamelen door middel van centrifugeren (1.900 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur).
    12. Resuspendeer in 500 µL DMEM medium en tellen in een hemocytometer te kwantificeren van de opbrengst.
  2. Generatie van L. amazonensis amastigotes onder een kweekomstandigheden (lage pH / verhoogde temperatuur)6,8,13
    1. Meng 5 mL van de log-fase promastigote cultuur (pH 7.4 bij 26 oC) met een gelijke hoeveelheid amastigoot medium (pH 4.5), met behulp van 25 cm2 flacons (totaal 10 mL medium) en na een nacht bebroeden bij 26 ° C.
    2. Verschuiving van de kolf van 26 ° C tot 32 ° C.
    3. Na 3 of 4 dagen split cultuur 1:5 in amastigoot media bij 32 ° C.
    4. Controleer de parasieten in de komende 3-4 dagen (max. 7 dagen) om te zien als ze klaar voor gebruik in infecties zijn.
      Opmerking: Gezonde een amastigotes moet hebben een ovale vorm, zonder zichtbare flagellen. Gedeeltelijk gedifferentieerde amastigotes hebben een grote ovale vorm met korte flagellen. De cultuur moet niet een heleboel bosjes - veel klontjes zijn een indicatie van het niet-groeiende, stervende parasieten. De amastigoot cultuur kan worden gesplitst van 1:5 en onderhouden voor een maximum van 3 weken.

4. infectie met L. amazonensis

  1. Verdun parasiet schorsingen volgens gewenste MOI (3-5 meestal metacyclische promastigoten per macrofaag [MOI van 1:3 of 1:5]) en 1 amastigoot per macrofaag [MOI 1:1]. In PBS- / - in een volume van 50-100 µL Leishmania toevoegen aan elk putje al met 2 mL medium.
  2. Incubeer BMMs voor 1 h met amastigotes en 3 h met metacyclische promastigoten bij 34 oC voor infectie.
    Opmerking: Optimale infectie temperatuur kan verschillen per soort.
  3. Na incubatie, grondig te wassen weg gratis parasieten in elke goed 3 x met 2 mL PBS- / - voorverwarmde tot 37 ° C.
    Opmerking: Dispergeren PBS voorzichtig om ervoor te zorgen dat coverslips niet over elkaar heen doen drijven. Zachtjes swirl de plaat en dan uit de vloeistof worden gecombineerd. Gebruik aparte zuigen tip als met meerdere stammen van parasieten te voorkomen van kruisbesmetting.
  4. Positiebepaling 1 h of 3 h-tijdstip monsters door broeden elk goed met 1,5-2 mL 2% PFA in PBS- / - 10 min. 3 x met PBS- / - wassen. Niet gecombineerd laatste wassen en koelen platen met coverslips in PBS tot vlekken.
  5. Voeg 2 mL verse BMM medium aan elk putje op platen voor verdere tijd-punten en Incubeer bij 34 ° C.
  6. Fix resterende tijd-punten als gewenste zoals beschreven in stap 4.3 en koelkast platen tot vlekken.

5. de DAPI kleuring en dekglaasje aan montage

  1. Gecombineerd PBS uit putten met coverslips en voeg 1,5 mL PBS- / - met 0,1% niet-ionogene wasmiddel. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 3 x wassen met 2 mL PBS- / -.
  2. Voeg 1 mL PBS- / - met 2 µg/mL DAPI (verdund van 5 mg/mL voorraadoplossing in water) aan putjes met coverslips en incubeer gedurende een ander 1 uur bij kamertemperatuur.
    Opmerking: De incubatietijd met DAPI is essentieel voor goede visualisatie van intracellulaire Leishmania parasieten. Macrophage kernen vlek snel, als gevolg van hun grotere omvang en DNA inhoud maar de verkleuring van de kernen van de intracellulaire parasieten is trager. Uitbreiding van de incubatietijd voorbij wat er nodig is om te visualiseren van de BMM kernen is dus nodig dat DAPI te doordringen via en het plasmamembraan parasiet, en de parasiet kernmembraan. Met de juiste DAPI vlek, kan de mitochondriale kinetoplast DNA in de buurt van de flagellar zak van de parasiet ook worden gevisualiseerd, naast de nucleaire DNA.
  3. Wash elk putje met coverslips 3 x met 2 mL PBS- / - en vervolgens lift en flip coverslips met pincet plaats neer de kant van de cel te monteren op glas Microscoop dia's met een commercieel verkrijgbare antifade montage reagens.
    Opmerking: Coverslips zijn bijzonder kwetsbaar en moeten voorzichtig omgaan. Vermijd druk op hen, met name tegen de zijwand van de putten bij het tillen. Het toevoegen van een paar druppels van PBS- / - vermindert de oppervlaktespanning tussen het dekglaasje aan en goed en vergemakkelijkt de hijs. Een fijne gauge naald kan worden gebruikt om te helpen bij de prying van de coverslips van de bodem van de put. Na het plaatsen van een dekglaasje aan op de dia, zachtjes druk naar beneden met een tang aan alle luchtbellen in de montage media uitduwen. Als een dekglaasje aan gebroken is of eventueel tijdens het tillen is gespiegeld, niet remount; gewoon gebruik maken van de reserve vierde dekglaasje aan.
  4. Koelkast dia's tot kwantificering.

6. infectie kwantificering

  1. DAPI gebeitste dia's onder een fluorescentie Microscoop onderzoeken door te focussen op de macrofagen 100 X objectief met immersie-olie (excitatie op 358 nm; optimale emissie bij 461 nm).
    Zorg ervoor dat de focus ligt op de laag van de macrofagen tussen het glasplaatje en dekglaasje aan.
  2. Kwantificeren van het aantal macrofagen (grote kernen gekleurd met DAPI) en het aantal kleinere amastigoot kernen geclusterd rond de kern van elke macrofaag (Zie figuur 2A, DAPI) voor elke gezichtsveld, met behulp van een handmatige counter.
    Opmerking: Amastigoot kernen kunnen niet allemaal zichtbaar zijn in een vlak van de focus vanwege hun kleine omvang. Die zichtbaar zijn wanneer gericht op macrophage kernen tellen en vervolgens het gebruik van fijne focus om te controleren of parasiet kernen in vliegtuigen boven en onder de macrofaag-kernen.
  3. Verplaatsen naar een ander gezichtsveld te herhalen kwantificering. Een aparte teller-sleutel wordt gebruikt voor het bijhouden van het aantal velden geteld. Visual velden in parallelle rijen doorlopen over elke dekglaasje aan, om te voorkomen dat overlapping tellen.
  4. Kwantificeren van een minimum van 200 macrofagen per dekglaasje aan. Kwantificeren van elk tijdstip van infectie in drievoud (3 coverslips). De vierde dekglaasje aan tellen als een van de vorige niet geschikt is voor het tellen van wegens dekglaasje aan overlapping, slechte montage, Glasbreuk, enz.
    Opmerking: Als 200 macrofagen kunnen niet worden geteld op elk een dekglaasje aan, tellen de reserve vierde.
  5. Berekenen van infectie tarieven als amastigotes/macrofaag of amastigotes/100 macrofagen en bepalen percentage geïnfecteerde macrofagen van de kwantificering van de ruwe gegevens.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania heeft twee besmettelijk vormen - metacyclische promastigoten die onderscheiden van procyclische promastigoten in stationaire fase van cultuur en amastigotes, die de intracellulaire stadia (Figuur 1). In sommige Leishmania soorten zoals L. amazonensis, kan amastigotes ook worden onderscheiden in een cultuur door het verschuiven van de promastigote cellen lagere pH (4.5) en verhoogde temperatuur (32 ° C), voorwaarden die ve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kwantitatieve gegevens geproduceerd door de BMM infectie assay hierboven beschreven, kunnen onderzoekers te verkrijgen van de tarieven van de infectie en een betrouwbare bepaling van de veranderingen in virulentie eigenschappen in een relatief korte periode (maximaal 2 weken, in vergelijking met de 2 maanden vereist voor in vivo experimenten). Deze methode is gebaseerd op de DNA-specifieke kleurstof DAPI, die specifiek vlekken macrophage en parasiet kernen, en maakt snelle identificatie en kwantificering van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben,

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health subsidie RO1 AI067979 NWA.
YK is ontvanger van undergraduate fellowship van de Howard Hughes Medical Institute/Universiteit van Maryland College Park.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
6 well cell culture plateCellstar657160
AdenineAcros OrganicsAC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL)Fisherbrand02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL)Fisherbrand02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL)Fisherbrand02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10Aspen Surgical371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL SyringeBecton Dickinson (BD)309604
BD Precisionglide Needle, 25G Becton Dickinson (BD)305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mmCellstar627 160
Cell Culture FlaskCellstar660175
Cover Glasses: 12 mm circlesFisherbrand12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306
D-BiotinJ.T. BakerC272-00
EDTASigma AldrichEDS
Ethyl alcohol 200 proofPharmco-AAPER111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dishCorning351029
Fetal Bovine SerumSeradigm1500-500
Ficoll400Sigma AldrichF8016
Fluorescence MicroscopeNikonE200
Goat anti-mouse IgG Texas redInvitrogenT-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488InvitrogenA-11034
HeminTokyo Chemical Industry Co. LTDH0008
HEPES (1M)Gibco15630-080
Isoton II DiluentBeckman Coulter8546719
L-GlutamineGemini400-106
Medium 199 (10X)Gibco11825-015
Na pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
ParaformaldehydeAlfa Aesar43368
Penicillin/StreptomycinGemini400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-)ThermoFisher14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mLCellstar188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mLCellstar227 261
ProLong Gold antifade reagentThermoFisherP36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibodyDevelopmental Studies Hybridoma Bank1D4B
Recombinant Human M-CSFPeproTech300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer Hausser Scientific1492
RPMI Medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Triton X-100 SurfactantMillipore SigmaTX1568-1
Trypan BlueSigma AldrichT8154
Delicate Scissors, 4 1/2"VWR82027-582
Dissecting Forceps, Fine TipVWR82027-386
Microscope SlidesVWR16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual ThresholdBeckman Coulter6605699

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888(2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340(2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901(2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804(2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022(2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084(2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671(2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12(2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469(2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Leishmania virulentieuit beenmerg afgeleide macrofagenparasietkwantificeringmitochondriale ijzertransporteurfluorescentiemicroscopieDAPI kleuringparasitofore vacuolenamastigootkernengastheer pathogeeninteractie

Gerelateerde artikelen