Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking

7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57497

⸱

27 april 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, North Carolina State University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen voor het verzamelen en microinjecting precellular westelijke maïs rootworm embryo's bestemd voor de uitoefening van functionele-genomic assays zoals germline transformatie en CRISPR/Cas9-genoom bewerken.

Samenvatting

De westerse maïswortelboorder (WCR) is een belangrijke plaag van maïs en staat bekend om zijn vermogen om snel aanpassen aan de pest beheersstrategieën. RNA-interferentie (RNAi) is een krachtig hulpmiddel voor de studie van biologie van de WCR gebleken, heeft maar zijn beperkingen. Specifiek, RNAi zelf voorbijgaande aard is (d.w.z. niet leidt tot een langdurige Mendelian inheritance van het bijbehorende fenotype), en het vereist de opeenvolging van DNA van het doel-gen weten. De laatste kan worden beperkt als het fenotype van belang wordt gecontroleerd door slecht bewaard gebleven, of zelfs nieuwe genen, omdat identificeren nuttige doelen zou worden uitdagend, zo niet onmogelijk. Dus, het aantal gereedschappen in de WCR genomic gereedschapset moet worden uitgebreid door de ontwikkeling van methoden die gebruikt kunnen worden maken van stabiele gemuteerde stammen en schakelen sequence-onafhankelijke onderzoeken van de WCR-genoom. Hierin, detailleren wij de methoden voor het verzamelen en microinject van de precellular WCR embryo's met nucleic zuren. Terwijl de hierin beschreven protocollen zijn gericht op het creëren van transgene WCR, kan CRISPR/Cas9-genoom bewerken ook worden uitgevoerd met behulp van dezelfde protocollen, met het enige verschil is de samenstelling van de oplossing die is geïnjecteerd in de embryo's.

Inleiding

Westerse maïswortelboorder (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, is een belangrijke plaag van maïs1. Interessant, WCR lijkt te overwinnen van de controle maatregelen sneller dan meest agrarische plagen omdat ze niet alleen fysiologisch maar ook gedragsgestoorde2,3,4,5, passen 6. het afgelopen decennium, RNA-interferentie (RNAi), een krachtige functioneel genomisch tool, heeft onderzocht als een potentiële beheermethode voor WCR7,8, en is ook gebruikt als een middel om te studeren gene functie9. Terwijl RNAi wordt vaak uitgevoerd door microinjection van double-stranded RNA (dsRNA) bij andere diersoorten, is injectie gebaseerde RNAi echter zeldzaam in WCR. In feite zijn er slechts enkele rapporten van RNAi via microinjection van dsRNA in WCR9. De reden is dat WCR hoge niveaus van gene vechtpartij via ingestie van dsRNA7,10 bereiken kan, zelfs het toelaat van de studie van embryonale effecten door dsRNA vervoederen aan de moeder11. Terwijl deze methode WCR een uitstekend onderwerp voor functionele genoom analyse via RNAi maakt, is het vooruitgang op de ontwikkeling van methodologieën voor embryonale microinjection in deze soort vertraagd.

Ondanks de kracht van RNAi zijn er een paar nadelen. Niet alle genen reageren bijvoorbeeld even op RNAi. Deze variabiliteit kunnen interpreteren van de resultaten van een functionele genomica assay moeilijker. Ook RNAi voorbijgaande aard is en genereert geen erfelijke mutaties. Aan de andere kant, kan germline transformatie, een ander functioneel genomisch hulpmiddel, erfelijke mutaties via het invoegen van een gemarkeerde transposons element in het genoom12,13genereren. Dit maakt germline transformatie een uitstekend hulpmiddel voor het maken van gemuteerde stammen voor gebruik in genetische langetermijnstudies. Transformatie kan ook worden gebruikt om te redden van een mutatie door het leveren van een functionele kopie van het gen tot een mutant genoom14. Bovendien is germline transformatie de hoeksteen van een grote verscheidenheid van moleculaire genetische technieken. Naast uitsparen en/of redden van de genfunctie, kan germline transformatie worden gebruikt voor enhancer overlapping15, gene overlapping16, ectopische expressie Gal4 gebaseerde17en genoom-brede mutagenese18.

Meer recentelijk, gereedschappen waarmee geavanceerde genoom bewerken zijn ontwikkeld. Deze tools omvatten transcriptie Activator-Like Effector nucleasen (TALEN) en de CRISPR/Cas9-nuclease systeem19,20. Het voordeel van deze nieuwe instrumenten is dat ze onderzoekers de mogelijkheid bieden voor het opwekken van een double-stranded DNA pauze op bijna elke plek binnen bijna elke genoom. Zodra geïnduceerde, deze onderbrekingen kunnen worden gerepareerd via niet-homologe weerszijden toe te treden, die kan introduceren verwijderingen of inserties in het beoogde gen, of via homologie geleide reparatie, die in het bijzijn van een gemodificeerde constructie, kan katalyseren de vervanging van de gehele genen of de genetische gebieden21,22. Echter, deze methoden vereisen microinjection van DNA, RNA en/of eiwit in zeer jonge embryo's.

Nog belangrijker is, in tegenstelling tot de dsRNAs gebruikt voor RNAi, nucleïnezuren en proteïnen gebruikt voor germline kruisen transformatie en genoom bewerken niet gemakkelijk celmembranen. Daarom, microinjection van de ANI van de plasmide, mRNAs, en/of eiwitten moet plaatsvinden tijdens de syncytieel blastoderm fase (dat wil zeggen voordat het insect embryo cellularizes). Dit maakt de timing van injecties een kritieke factor. Bijvoorbeeld bij Drosophila melanogastermoeten embryo's binnen twee uur na ei12 leggenworden geïnjecteerd. Daarom moet de ontwikkeling van een succesvolle embryonale microinjection protocol voor WCR rekening houden met de beste voorwaarden voor vrouwelijke leggen van eieren, evenals de beste methode voor het verzamelen van voldoende hoeveelheden van precellular embryo's.

Een poging om een breed scala aan moleculaire genetische hulpmiddelen te oefenen op WCR biologie vereist de ontwikkeling van methoden voor het verzamelen en microinjecting van de precellular WCR embryo's. Hier voorzien wij gedetailleerde instructies, samen met tips en trucs, om anderen transformatie gebaseerde technieken gebruiken in WCR onderzoek te helpen. Naast uitbreiding van transgene technologieën tot WCR voor gebruik in functionele genomic studies, deze technieken ook in staat stellen krachtige nieuwe pest controlestrategieën zoals gen station23,24 te worden getest in dit economisch belangrijke Pest.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. kolonie-niveau fokken van WCR volwassenen

  1. Verkrijgen van een voldoende hoeveelheid WCR volwassenen (500-1000) van een betrouwbare bedrijf of research laboratory (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld) en in een kooi van 30 cm3 plaatsen.
    Opmerking: Gebruik van een niet-diapausing-stam wordt sterk aanbevolen.
  2. Bereiden van kunstmatige voeding WCR volgens protocol van de fabrikant en giet een 1 cm dikke laag in een 38 oz-container (Zie Tabel van materialen). Na het mengen, opslaan van ongebruikte dieet bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.
  3. Zet een petrischaal (100 x 15 mm) met volwassen dieet (10-15 g) in een 30 cm3 kooi. Voeg meer dieet als het eten lage of droog is.
  4. Zet een kolf (300 mL) met water, bedekt met een katoenen bal, die wordt gebruikt om het op zijn plaats houden een katoen-roll (6 "x 3/8"), om te dienen als een waterbron. Het water veranderen wanneer het draait laag.
  5. WCR bij 26 ° C met 60% vochtigheid te handhaven en een 14:10-lichte fietsen in een insect fokken incubator.

2. de embryo's worden verzameld en uitlijning

  1. Maak een ei inzamelingskamer 1% agar in water met een steriel 100 x 15 mm2 petrischaal. Bewaren bij 4 ° C na de agar stolt.
  2. Nieuw vastgestelde eieren te verzamelen, plaats een enkellaags filtreerpapier, gevolgd door 4 lagen van kaasdoek (elke cut formaat) op het oppervlak van de agar (figuur 1A).
    Opmerking: Kaasdoek kan worden hergebruikt, nadat hij gewassen in bleekmiddel en gesteriliseerde met autoclaaf, maar het is niet nodig om dit te doen voor het eerste gebruik. Filtreerpapier mogen niet worden hergebruikt en hoeft niet te worden gesteriliseerd.
  3. Plaats van ei collectie plaat in WCR kooi zo laat in de dag mogelijk (einde van de werkdag) en bedek met een zilverpapier tent. Laat 's nachts.
    Opmerking: Met de lichten op van 10.00 tot 12 uur (14u) vertragingen ei leggen, waardoor de collectie van jongere eieren voor microinjection zonder lab personeel inzamelingskamer in kooi 's avonds laat plaatsen.
  4. Verwijder de inzamelingskamer ei rond de 8 of 9 uur
  5. Gebruik pincet te halen 1 laag kaasdoek op een tijd en plaats in een bekerglas (500 mL) water. Het wassen van eieren af kaasdoek door zachtjes roeren (figuur 1B en 1 C).
  6. Gebruik een pipet lamp eieren overbrengen naar een andere bekerglas (500 mL) water. Herhaal 2-3 x om de eieren schoon te maken.
  7. Gebruik de pipet lamp overdracht van eieren op filterpapier (Figuur 1 d) terwijl het minimaliseren van de hoeveelheid water "Carry-over".
  8. Zwarte filtreerpapier snijd in reepjes zo breed als een glasplaatje en de tape stevig aan de dia om te controleren of legt het papier plat (figuur 2A).
    Opmerking: Zwarte filtreerpapier verbetert zichtbaarheid onder de Microscoop door het verminderen van de hoeveelheid gereflecteerd licht.
  9. Niet-toxisch lijmen (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld) om het koffiefilter in fijne lijntjes (figuur 2B). Houd de lijm lijnen dunner beeldscherm mogelijk dan de diameter van een ei te voorkomen dat je de eieren bedekt met lijm.
  10. Gebruik een fijne borstel zachtjes overstappen WCR eieren één voor één hun filtreerpapier op de lijn van de lijm. Probeer de om eieren te leggen op de lijm voordat het droogt uit en houden van ten minste één ei de afstand tussen elk ei.
  11. Injectie efficiëntie maximaliseren door het plaatsen van meerdere tekstregels eieren op een filtreerpapier dia (Figuur 3).
  12. Nadat alle eieren zijn neergelegd op het filtreerpapier, wacht u totdat alle de lijm voordat microinjection droogt.
    Opmerking: Voor germline transformatie en voor CRISPR/Cas9-gemedieerde genoom bewerken, injecteren alle embryo's tegen de middag (12 uur) zodat de oudste embryo niet meer dan 19 uur oud is. Voor RNAi is er echter geen tijdslimiet omdat, in WCR, dsRNA kan verplaatsen tussen cellen. In feite, voor RNAi, zou kunnen veroudering embryo's resulteren in betere overlevingskans van de patiënt.

3. voorbereiding van de ANI van de plasmide en injectie naalden

  1. Bereiden van kwalitatief hoogwaardige supercoiled plasmide DNA met behulp van een endotoxine-vrije commerciële kit (Zie Tabel van materialen voor een voorbeeld).
  2. Ter voorbereiding van de oplossing voor injectie, de concentratie van elke plasmide controleren en deze vervolgens combineren helper plasmide (eindconcentratie is 250 ng/µL), donor plasmide (eindconcentratie is 750 ng/µL) en fenol red buffer (20% eindconcentratie). Vortex de oplossing kort en Centrifugeer gedurende 3 minuten op maximale snelheid te precipiteren deeltjes die de naald verstoppen kunnen.
  3. Trekken van borosilicaatglas naalden (od 1 mm, I.D. 0.58 mm, lengte 10 cm) met een trekker van de micropipet van het type van Flaming/bruin. Voor opslag, veilige getrokken naalden op dubbelzijdige plakband in een petrischaal of andere duidelijke container.
    Opmerking: Voor de micropipet trekker systeem, de instellingen die worden gebruikt zijn: warmte = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.
  4. Aanvulling funderingsput de naald van de injectie met behulp van een micro-loader tip (Zie Tabel van materialen) Pipetteer 0,5 - 1,0 µL neer binnen de naald, in de buurt van het tapse einde. Bubbels uit het topje van de naald verwijderen als een optreedt.
  5. Plaats de injectie naald in de kaarthouder van de naald.
  6. Open het puntje van de naald door zachtjes breken met een fijn paar pincet, of zachtjes raken/te slepen de tip op de dia dekglaasje aan of glas.
    Opmerking: Het doel is om de kleinste opening waarmee nog de mix van de injectie te komen (kleinere openingen in het algemeen vereisen hogere druk van de injectie). Schuine naalden nodig niet deze stap omdat ze al open.

4. microinjection en na injectie zorg

  1. Met behulp van een fijn penseel, zorgvuldig nat van het oppervlak van 1-3 eieren met steriel water, invoegen de naald en het injecteren van de oplossing. Injecteren elk ei voordat het oppervlak droogt. Kijk voor de verschijning een kleine hoeveelheid rood in eieren tijdens injectie om aan te geven van de succesvolle microinjection. Crush of verwijderen van alle eieren die kijken beschadigd, leeg, of anders niet kunnen worden geïnjecteerd.
    Opmerking: Hoewel injectie druk op basis van boring breinaalden varieert, 10-13 psi is een goed uitgangspunt.
  2. Nadat alle eieren worden geïnjecteerd, verwijder het koffiefilter uit het glasplaatje.
  3. Breng het filter op het oppervlak van een 1% agar schotel (zie hierboven).
  4. Gebruik plastic paraffine film te verzegelen van de schotel, en in een insect van de 26 ° C incubator fokken voor 12 dagen.
    Opmerking: De paraffine film voorkomt kruisbesmetting van schimmel tussen gerechten. Iedere andere behandeling om te voorkomen dat schimmel en bacteriële groei kan echter het voortbestaan van de geïnjecteerde embryo's verminderen.

5. het kweken en broedeieren van embryo 's

  1. Starten van de controle van embryo's twaalf dagen na injectie voor de pas uitgekomen larven en blijven dagelijks voor de komende 2 weken.
  2. Overdracht van larven, met een fijne borstel, met een steigerend doos met gekiemde maïs en de bodem.
    Opmerking: Schimmel kan groeien in de agar schotel, maar larven nog steeds in de meeste gevallen zal uitkomen. Kijk voor larven zorgvuldig binnen de mal om ze alle te vangen. Sommige larven kunnen bewegen om het deksel van de schotel en zou komen te zitten in de condensatie.
  3. Larven bij 26 ° C na standaard WCR fokken methoden25aan de achterkant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een belangrijke overweging bij het ontwikkelen van dit protocol werd het stadium van de embryonale ontwikkeling ten tijde van microinjection. In het bijzonder vereist germline omzetting microinjection van ANI voorafgaand aan embryonale cellularization. Dit is omdat het DNAS-systeem niet gemakkelijk kruisen celmembranen. Pogingen om te visualiseren van de stadia van embryonale ontwikkeling WCR met behulp van een nucleaire vlek mislukten omdat dechorionation van WCR embryo's in wezen alle v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel microinjection van WCR met dsRNAs met het oog op RNAi gerapporteerde9, dit is het eerste protocol bij het vaststellen van beste praktijken voor het microinjecting van de precellular WCR embryo's, een kritische proces voor het uitvoeren van germline transformatie en/of CRISPR/Cas9 genoom bewerken in deze soort. Succesvolle microinjection van WCR embryo's is afhankelijk van vele factoren, zoals transformatie efficiëntie. Hieronder besproken zijn enkele van de belangrijke kwesties invloed op h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Monsanto mais Rootworm kennis Research Program, nummer AG/1005 (aan MDL en YC) en start-up middelen verlenen aan MDL van NCSU. FC werd gesteund door subsidies van Monsanto's maïs Rootworm kennis Research Program (AG/1005) en de National Science Foundation, toekennen nummer MCB-1244772 (MDL). De auteurs verklaren geen concurrerende belangen. FC en MDL bedacht en ontworpen van de experimenten; FC, PW en SP uitgevoerd de experimenten; FC en MDL geanalyseerd de resultaten; en FC, NG en MDL schreef het manuscript. Wij danken Teresa O'Leary en William Klobasa Stephanie Gorski voor hun deskundige hulp bij bevolkingsonderzoek WCR. Wij danken ook Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) voor de overbrenging van eieren lab kolonies en verstrekken van fokken protocollen vast te stellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Qualitative Filter Paper (Black)Ahlstrom8613-0900Voor ei-micro-injectie
1 oz Containers Anny's Plastic TablewareASET101Eicontainer
Drosophila Agar Type IIApex66-103Substraat voor WCR eierlegschaal
Featherweight Forceps Bioquip4748Handelen van larven en poppen 
Clorox Regular-Bleach1Clorox44600-30770Maïs en gerechten wassen
Trucker's Favorite YellowCoor Farm Supply502Maïs voor het voeren van WCR
Microinjection System (Homemade)NAOnderdelen & instructies op aanvraag beschikbaarControleert injectiedruk (0-20 psi)
Elmer's Non-toxic GlueElmer's Products, Inc.E304Lijm eieren op filterpapier
epTIPS Microloader TipsEppendorfC2554691Aanvullen van naaldbelasting tips
Falcon Tissue Culture DishesFalcon25383-103Spruiten maïs /150 x 25 mm
Fisherbrand Quantitative-Grade Filter Paper CirclesFisher ScientificS47576CAgarschaal maken voor eierleg/9cm
SparkleenFisher Scientific04-320-4Vaatwerk wassen
Plain Microscope SlidesFisher Scientific12-549-3Houd filterpapier en eieren voor micro-injectie
Western Corn Rootworm w/o Pollen SubstituteFrontier Agricultural Sciences F9766BKunstmatige voeding voor volwassen WCR
Cotton Balls, LargeGenesee Scientific51-101Fles sluiten
Globe Scientific 3.0 mL Small Bulb Transfer PipettesGlobe Scientific137035Verzamel en breng eieren over
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope LeicaM165 FC WCR screening
DsRed Filter Set for Fluorescence StereomicroscopeLeicaDSRExcitatiever: 510-560 nm, emissiever: 590-650 nm
EGFP filterLeicaGFP2Excitatiever: 440–520 nm, emissiever: 510 nm
BugDormMegaView ScienceDP1000_5PKooi voor volwassen kolonie
Miniature Paint BrushMyArtscapeMAS-102-MINILiner 2/0 
Joystick MicromanipulatorNarishigeMN-151Micromanipulator en naaldhouder
Microscope XY StageOlympus265515Microscoopstandaard (aanpassing voor gebruik met stereoscoop)
Grade 90 CheeseclothOnline Fabric StoreCHEE90Voor eierleg
Plastic paraffin film Pechiney Plastic PackagingPM-996Agardisch afsluiten na micro-injectie/Rolgrootte 4 in. x 125 ft
Percival IncubatorPercival I41VLH3C8WCR groeiende kamer (incubator voor insectenkweek)
Narrow Mouth Erlenmeyer FlasksVWR4980-300-PKWatercontainer voor volwassen kolonie 
Griffin Low Form BeakersVWR1000-600-PKVoor eiwas
Braided Cotton RollsRichmond Dental Cotton Co.605-3599Gebruik in watervoorziening voor volwassen kolonie 
Petri Dishes (35x10mm)SIGMACLS430588-500EAVoor dieetplaten
Phenol RedSigma143-78-8Micro-injectiebuffer
Laser-based Micropipiette PullerSutter InstrumentP-2000/GNaaldtrekker/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100
Premium TopsoilThe Scotts Company71130758Grond voor cron groei
Reloc Zippit 2 Mil Zipper BagsUnited States Plastic Corporation48342Agardisch in zak na micro-injectie/5x7
Petri Dishes (100x15m)VWR89038-968Agardisch maken voor eierleg/ 100 x 15 mm
6 oz ContainersWebstaurantstore128E506WCR enkele paar paringskamer 
38 oz ContainersWebstaurantstore128NC888Kweekbak voor larven/38 oz
ChoiceHD 16 oz. Microwavable Translucent Plastic Deli ContainerWebstaurantstore128HRD16Kweekbak voor larven/16 oz
Microinjection Scope Wild HeerbruggWILD-M8Micro-injectiescoop uitgerust met een XY-stand
Standard Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4Micro-injectienaalden
Adult Western Corn RootwormsNorth Centeral Aqricultural reasearch LaboratoryNon-diapase strainAanvraag van Dr. Bryan Wade French's lab
Plasmid DNA Midi KitQiagen12143Zuivering van injectieklare plasmide-DNA's

Referenties

  1. Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
  2. Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm. PLoS One. 6 (7), e22629(2011).
  3. Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice. Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).
  4. Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides. Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).
  5. Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).
  6. Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).
  7. Baum, J. A., et al. Control of coleopteran insect pests through RNA interference. Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).
  8. Velez, A. M., et al. Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Genes (Basel). 8 (1), (2016).
  9. Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. J Insect Sci. 10, 162(2010).
  10. Rangasamy, M., Siegfried, B. D. Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults. Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).
  11. Khajuria, C., et al. Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte. Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).
  12. Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements. Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).
  13. Robertson, H. M., et al. A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).
  14. Spradling, A. C., Rubin, G. M. Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes. Science. 218 (4570), 341-347 (1982).
  15. O'Kane, C. J., Gehring, W. J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).
  16. Lukacsovich, T., et al. Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster. Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).
  17. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  18. Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics. Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).
  19. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  20. Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science. 326 (5959), 1501(2009).
  21. Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases. Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).
  22. Jeggo, P. A. DNA breakage and repair. Adv Genet. 38, 185-218 (1998).
  23. Gantz, V. M., Bier, E. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science. 348 (6233), 442-444 (2015).
  24. Windbichler, N., et al. A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito. Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).
  25. Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae). Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).
  26. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).
  27. Chu, F., et al. Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera. Insect Mol Biol. , (2017).
  28. Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions. Cell. 21 (3), 669-679 (1980).
  29. Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. A universal marker for transgenic insects. Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).
  30. Branson, T. The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae). Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).
  31. Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure. Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).
  32. Handler, A. M., James, A. A. Insect transgenesis: methods and applications. , CRC Press. (2000).
  33. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids. Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).
  34. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).
  35. Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biol. 5, 11(2007).
  36. Horn, C., Wimmer, E. A. A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management. Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Micro injectie van embryo splasmidinjectieborosilicaatnaaldenmicromanipulatietechniekprotocol voor eiverzamelingembryo preparatiekweek van larven
Microinjection van Western maïswortelboorder, Diabrotica virgifera virgifera, embryo's voor Germline transformatie of CRISPR/Cas9 genoom bewerking
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.