Methodenartikel

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

12.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57506

⸱

27 juni 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular and Chemical Biology of Neurodegeneration, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL)

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een robuust en geoptimaliseerde protocol voor de productie van milligram hoeveelheden native, tag-vrije monomeren en fibrillen van de exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO).

Samenvatting

De ziekte van Huntington (HD) is een erfelijke fatale neurodegeneratieve ziekte veroorzaakt door een CAG uitbreiding (≥36) in de eerste exon van het HD-gen, resulterend in de expressie van het eiwit Huntingtin (Htt) of N-terminale fragmenten daarvan met een uitgebreide polyglutamine ( polyQ) stuk.

De exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) is de kleinste Htt-fragment dat veel van de functies van HD in mobiele recapituleert en dierlijke modellen en is een van de meest bestudeerde fragmenten van Htt. De kleine grootte van Httex1 maakt het experimenteel meer vatbaar voor biofysische karakterisering met behulp van standaard en hoge resolutie technieken in vergelijking met langere fragmenten of full-length Htt. Echter, de hoge aggregatie neiging van mutant Httex1 (mHttex1) met verhoogde polyQ inhoud (≥42) heeft het moeilijk gemaakt om efficiënte expressie en reinigingssystemen te produceren van deze eiwitten in voldoende hoeveelheden en toegankelijk te maken wetenschappers uit verschillende disciplines zonder het gebruik van fusie-eiwitten of andere strategieën die gevolgen hebben voor de oorspronkelijke volgorde van het eiwit. Wij presenteren hier een robuust en geoptimaliseerde methode voor de productie van milligram hoeveelheden voor native, tag-gratis Httex1 op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO). De eenvoud en efficiëntie van de strategie zal elimineren de noodzaak om het gebruik van uitheemse sequenties van Httex1, dus dit eiwit meer toegankelijk maken voor onderzoekers en het verbeteren van de reproduceerbaarheid van experimenten in verschillende laboratoria. Wij zijn van mening dat deze vooruitgang ook toekomstige studies gericht op het ophelderen van de structuur-functie relatie van Htt evenals ontwikkelende nieuwe diagnostische hulpprogramma's en therapieën te behandelen of te vertragen de progressie van HD zal vergemakkelijken.

Inleiding

Htt is een 348 kDa proteïne en is betrokken bij verschillende fysiologische functies1. Wanneer Htt een uitgebreide polyQ regio van meer dan 36 residuen in de N-terminus bevat, veroorzaakt het HD2,3. HD-pathologie wordt gekenmerkt door cellulaire inclusies in het striatum en cortex, wat tot neuronale dood en atrofie van de aangetaste weefsels4,5 leidt. Diverse N-terminale Htt fragmenten die de polyQ herhalen tractus bevatten in post mortem hersenen van HD patiënten zijn gedetecteerd en worden verondersteld te worden gegenereerd door Proteolytische verwerking van het eiwit huntingtin6. Recente studies suggereren dat Httex1 ook vanwege afwijkende mRNA-splicing kon worden gevormd. Httex1 bevat de pathologische polyQ mutatie en haar overexpressie bij dieren kan veel van de belangrijkste functies van HD7, dus het markeren van een mogelijke centrale rol van dit fragment in HD pathologie en ziekte progressie6, recapituleren 8,9.

Als gevolg van de hoge aggregatie neiging van mutant Httex1 (mHttex1) met uitgebreide polyQ-darmkanaal, het merendeel van de bestaande expressiesystemen zijn gebaseerd op de voorbijgaande fusie van Httex1 aan eiwitten (zoals de glutathion-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX) of maltose-bindend-proteïne (MBP) en/of peptiden (poly-histidine) die differentieel de expressie, stabiliteit, zuivering en/of oplosbaarheid10,11,12,13,14 verbeteren ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. De fusie partner is gekoppeld aan Httex1 met een korte opeenvolging met een breukzijde voor proteasen zoals trypsine, tabak etch virus (TEV) protease- of PreScission met het oog op het decolleté en de introductie van Httex1 vóór de inleiding van aggregatie of zuivering. Tekortkomingen van deze methoden omvatten de mogelijkheid van het verlaten van de extra residuen als gevolg van niet-spoorloze splijten en de oprichting van afgeknotte fragmenten als gevolg van de miscleavage binnen de volgorde van de Httex1, naast de heterogeniteit als gevolg van onvolledige splitsingsproducten ( Zie Vieweg, et al. voor meer diepgaande discussie over de voordelen en beperkingen van deze aanpak)10. Om aan deze beperkingen, strategie wij onlangs een expressie waarmee de generatie van inheemse tag-vrije Httex1 voor de eerste keer met behulp van een voorbijgaande N-terminale fusie van de Synechocystis sp. (Ssp) DnaB intein tot Httex110. Terwijl het intein splijten spoorloze en specifieke en mg hoeveelheid eiwitten levert, het nog steeds lijdt twee nadelen die de opbrengst verminderen kunnen: namelijk voorbarig splitsing van de intein die zich tijdens de expressie, en het feit dat splitsing vindt plaats voordoen kan via enkele uren, die tot verlies van eiwitten door aggregatie, vooral voor Httex1 met uitgebreide polyQ herhaalt leiden kunnen.

Inspelen op deze beperkingen en verfijnen van onze strategie voor de productie van native, tag-vrije Httex1, wij een nieuwe expressie systeem ontwikkeld op basis van de voorbijgaande fusie van SUMO, meer precies de gist homolog Smt3 te Httex1. De toepassing van de SUMO-systeem voor de productie van recombinante eiwitten werd voor het eerst gepubliceerd in 200429, waar een verhoogd tarief van meningsuiting en de oplosbaarheid van SUMO fusieproteïne werd aangetoond. De SUMO-tag kan worden cleaved door de ubiquitin als eiwit-specifieke protease 1 (ULP1), die hoeft niet een erkenning site, maar herkent de tertiaire structuur van SUMO en vrijwel elimineert de mogelijkheid van miscleavage30. Bovendien, het ULP1-gemedieerde splijten is snel en spoorloze en laat geen extra residuen achter. Het voorbarig splijten van de fusion-tag, wordt zoals waargenomen met de autocatalytic intein10, volledig vermeden door de eis van een externe protease. Terwijl de SUMO-strategie tegenwoordig veel voor recombinant eiwit productie31,32,33 gebruikt wordt, we het in dit document laten zien dat het vooral nuttig voor het genereren van een intrinsiek ongeordende is, aggregatie-gevoelig, amyloidogenic eiwitten zoals Httex1. Wij zijn van mening dat de eenvoud, de efficiëntie en de degelijkheid van onze SUMO fusion-gebaseerde methode zal native, tag-vrije Httex1 meer toegankelijk voor onderzoekers uit verschillende disciplines maken en de noodzaak elimineren om het gebruik van uitheemse sequenties van Httex1 in vitro . Dit is een belangrijke stap vooruit dat toekomstige studies om te verhelderen van de structuur-functie relatie van Httex1 zal vergemakkelijken.

Het protocol beschrijft de zuivering van Httex1 van 12 L van bacteriële cultuur, maar het protocol zou kunnen gemakkelijk worden aangepast voor kleinere of grotere schaal producties. Het protocol beschrijft de productie van wild type Httex1 (wtHttex1) met een polyQ herhalen lengte hieronder (23Q) en mutant Httex1 (mHttex1) met een polyQ Herhaal lengte boven (43Q) de pathogene drempel (36Q).

Protocol

1. weergave van recombinante Httex1 23Q en 43Q

  1. De vereiste buffers en oplossingen voor te bereiden. Bereiden van 1000 x stockoplossing ampicilline (AMP, 100 mg/mL), filter (0,2 µm), hoeveelheid en winkel bij-20 ° C. Bereiden van lysogenie Bouillon (LB) medium (25 g LB Miller per 1 L H2O), autoclaaf. Bereiden 1 M Isopropyl ß-D-1thiogalactopyranoside (IPTG)-stockoplossing, filter (0,2 µm), aliquot en winkel bij-20 ° C.
  2. Transformeren van chemische bevoegde E. coli B ER 2566 met een pTWIN1 vector, met menselijke Httex1, gesmolten tot een N-terminal His6-SUMO-tag met de warmte schok methode34.
    Opmerking: De E. coli BL21 DE3 stam is ook gebruikt. Echter, in dit geval een verhoogde hoeveelheid opschoningen werd waargenomen.
  3. Inoculeer 200 mL voor LB-medium met 1 x AMP in een erlenmeyer van 1 L door toevoeging van een enkele kolonie van de agarplaat met een steriele pipette uiteinde. Incubeer de cultuur bij 30 ° C en 180 rpm voor 20u ('s nachts) in een bacteriële incubator.
  4. Neemt een monster van 1 mL van de cultuur met een steriele pipet. Meten van de extinctie op 600 nm (OD600) van het monster met een disposable plastic Cuvet en een fotometer (respect de meting variëren tussen 0,1 en 1, verdund met LB-medium indien nodig). Berekenen van de hoeveelheid preculture die in een startende OD600 van 0,05 in een cultuur van 3 L resulteren zullen (= 3, dat dat 50 mL betekenen zou met een preculture van OD600 ).
  5. Inoculeer vier culturen (elke 3 L voor LB-medium met 1 x AMP in een maatkolf van 5 L), door het toevoegen van het berekende bedrag van preculture met een steriele pipet. Incubeer bij 37 ° C en 180 rpm in een bacteriële incubator culturen.
  6. Elke 30 min, neemt een monster van 1 mL van de cultuur met een steriele pipet. De OD-600 van het monster met een disposable plastic Cuvet en een fotometer meten. Wanneer OD600 heeft bereikt 0.1 (meestal na 1-2 h), de temperatuur van de bacteriële incubator tot 14 ° C en blijven de incubatie onder afkoeling. Elke 30 min, neemt een monster van 1 mL van de cultuur met een steriele pipet. De OD-600 van het monster met een disposable plastic Cuvet en een fotometer meten.
    Opmerking: De tijd om af te koelen van de culturen kan verschillen met de incubator gebruikt, dus de tijd om te beginnen koeling wellicht worden aangepast afhankelijk van het type van incubator gebruikt. Echter moet wijzigen de temperatuurgradiënt alleen een klein effect op de opbrengst als de SUMO fusieproteïne lijkt vrij stabiel te zijn.
  7. Wanneer OD600 heeft bereikt 0,3-0,4 (meestal na 1-2 h), neemt u een monster van de pre-inductie van de cultuur van de overexpressie p.a. SDS-pagina. Berekenen van de grootte van de steekproef, dat een vergelijkbare hoeveelheid cellen geeft en een goed signaal op Coomassie gekleurd SDS-pagina: goed voor een 10-gel: volume = 0,2 mL/OD600; Neem de helft voor een 15 goed gel.
    1. Voor een bacteriële cultuur met een OD600= 0.4, nemen 500 µL. Neem de berekende hoeveelheid bacteriële cultuur met een steriele pipet. Draai naar beneden van het monster (18000 x g, 4 ° C, 2 min) en de vloeistof wordt weggeworpen. Houd de pellet op-20 ° C tot klaar om te gebruiken voor analyse (stap 1.11).
  8. Induceren van eiwit expressie door pipetting 1.2 mL van een 1 M IPTG-stockoplossing aan de oplossing van elk 3 L-cultuur (eindconcentratie 0,4 mM). Blijven het broeden van de cultuur bij 14 ° C gedurende 16 uur ('s nachts).
    Opmerking: De temperatuur zal meestal hebben bereikt ~ 20 ° C tegen de tijd dat IPTG wordt toegevoegd, afhankelijk van de prestaties van de incubator.
  9. Neemt een monster na inductie van de cultuur voor SDS-pagina analyse van de overexpressie, volgens de procedure die is beschreven in stap 1.7.
  10. Het oogsten van de cellen door centrifugeren in 1 L buizen (3993 x g, 4 ° C, 10 min). Verwijder het supernatant, houden de cel pellet op ijs en gaan rechtstreeks naar de zuivering.
  11. De overexpressie analyseren door SDS-pagina35,36. Resuspendeer de pre- en post inductie monsters in 20 µL van het runnen van buffer en 20 µL van 2 x laden kleurstof. Verwarm de monsters gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een blok van de warmte en laden 20 µL op een 15% gel terwijl nog warm. De gel voor 90 min op 180 V. vlek de gel met Coomassie kleurstof volgens de instructies van de fabrikant uitgevoerd. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 1C.
    Opmerking: Het protocol hier kan worden gestopt, de cel pellet kan worden bevroren en opgeslagen bij-80 ° C voor enkele weken. Voor een optimaal resultaat is het raadzaam de verse bacteriële pellet gebruik te voorkomen van bevriezing. Bevriezen-ontdooien kan leiden tot lysis van de cellen en de afbraak van Httex1. Hierdoor kan de opbrengst en de kwaliteit van het eiwit.

2. cel Lysis en zuivering van zijn6-SUMO Httex1 fusieproteïne geïmmobiliseerd door Metal affiniteitchromatografie (IMAC)

  1. Bereiden van 2 L voor buffer A in een glazen flesje (50 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), 500 mM NaCl, 15 mM imidazol). Bereiden 1 L voor buffer B (50 mM Tris, 500 mM NaCl, 500 mM imidazool pH 7.4) in een glazen fles. Na de ontbinding van de zouten, breng de pH met 10 N HCl en filtreer de oplossingen in verse flessen met een fles top filter (0.65 µm). Bereiden van een 1000 x phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, 0,3 M) stockoplossing, aliquoot om 100 µL en sla bij-20 ° C.
    Opmerking: Het protocol is bedoeld om de voltooiing van alle stappen vanaf lysis van de bacteriële pellets reversed-phase hoge prestatie vloeibare chromatografie (RP-HPLC) zuivering en lyofilisatie binnen 8-9 uur. Als u wilt beperken aggregatie en proteolyse, is het aanbevolen om snel werken zonder pauzes en voer alle stappen uit bij 4 ° C of op ijs.
  2. Voeg 100 µL van de stockoplossing PMSF en vijf tabletten (1 per 30 mL eindvolume) van proteaseinhibitor tot 100 mL van vooraf gekoeld buffer A. toevoegen de bacterietelling pellet aan de buffer en meng de opschorting door roeren met een magnetische roer bar en pipetteren op en neer wi th een steriele 10 mL Pipet (~ 30 min).
  3. Verdeel de entsuspensie in aliquots van 40 mL in 50 mL wegwerp plastic buizen. Bewerk ultrasone trillingen ten elk aliquot in een batch water/ijs voor lysis van de cel (70% amplitude, totale ultrasoonapparaat tijd 5 min, intervallen van 30 s ultrasoonapparaat, 30 s pauze).
    Opmerking: Het is belangrijk dat het monster niet tijdens de ultrasoonapparaat stap doet opwarmen. Het is aanbevolen om wat water toevoegen aan het ijsbad te verbeteren warmteafgifte tijdens ultrasoonapparaat. De ultrasoonapparaat procedure misschien moet worden aangepast als er een ander instrument wordt gebruikt. Andere lysis methodes zoals een Franse pers of een microfluidizer zo goed zou moeten werken en misschien wel gunstig om te voorkomen dat de verwarming van het monster en eiwit aggregatie. Deze apparaten zijn niet beschikbaar in ons laboratorium en we goede resultaten verkregen met onze ultrasoonapparaat protocol.
  4. Neem een steekproef van 50 µL van de lysate p.a. natrium dodecyl sulfaat polyacrylamide-gel elektroforese (SDS-pagina). Centrifugeer het monster (18000 x g, 4 ° C, 2 min) en de oplosbare fractie in een nieuwe reageerbuis Pipetteer. Resuspendeer de onoplosbare breuk in 50 µL van buffer A met een pipet. Houd de monsters op ijs tot SDS-pagina-analyse (stap 2.6).
  5. Verhelder de lysate door centrifugeren (39191 x g, 4 ° C, 60 min).
  6. Analyseren tijdens het centrifugeren stap, de stap van de lysis van de cel door SDS-PAGE. Voeg 50 µL van 2 x laden kleurstof op de oplosbare en onoplosbare breuk van de lysate respectievelijk. Verwarm voor 5 min bij 95 ° C en laden 2 µL op een 15% gel terwijl nog warm. De gel voor 90 min op 180 V. vlek de gel met Coomassie kleurstof volgens de instructies van de fabrikant uitgevoerd. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 1C.
  7. Filter het supernatant (0,45 µm, spuit filters). Neem een steekproef van 20 µL van het gefilterde supernatans voor SDS-pagina-analyse (stap 2.11).
    Opmerking: Meestal een volume van 90 tot 100 mL van het supernatans dat verduidelijkt en gefilterd is bereikt. 3 spuit filters zijn meestal voldoende. Als de filtratie omslachtig is, trachten te verhogen van de snelheid van centrifugeren en/of tijd.
  8. De His6-SUMO Httex1 fusieproteïne uit de geklaarde bacteriële lysate isoleren door geïmmobiliseerdet metal affiniteitchromatografie (IMAC) op een systeem voor snelle prestatie vloeistofchromatografie (FPLC) bij 4 ° C37.
    1. Vul de geklaarde lysate in een superloop en de belasting op de Ni-NTA kolom (ontdaan, schoongemaakt en opnieuw geladen volgens de handleiding van de fabrikant, is een eerdere leeg lopen aanbevolen) bij 2 mL/min. 10 Pass kolom volumes (CV, 200 mL) van buffer A op 10 mL/min te wassen uit de niet-afhankelijke eiwitten.
    2. Elueer de fusieproteïne met 2.5 CV (50 mL) van 100% van de buffer B op 2 mL/min. gebruik een fractie grootte van 50 mL voor het laden en wassen en 5 mL voor de elutie. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 1D.
  9. Neem een monster van iedere breuk voor SDS-pagina-analyse (20 µL) en bundelen van de breuken met de fusieproteïne volgens het hoogtepunt van het chromatogram IMAC. Toevoegen (2S, 3S) - 1,4 - Bis (sulfanyl) butaan-2,3-diol (DTT) en L-cysteïne (eindconcentratie elke 100 mM) als een poeder en los door zachtjes het omkeren van de buis.
    Opmerking: In onze ervaring de zuiverheid van het fusie-eiwit in de verschillende fracties is vergelijkbaar. Als voorzorgsmaatregel moeten de fracties van de gezuiverde fusieproteïne snel na IMAC om te voorkomen dat de samenvoeging van de sterk geconcentreerde breuken worden samengevoegd. Daarnaast is het aanbevolen om het gaan rechtstreeks naar het splijten van de SUMO tag en HPLC zuivering. Indien nodig, kan het protocol hier gestopt worden. De verdunde oplossing van de fusieproteïne werd ingevroren in vloeibare stikstof, opgeslagen bij-80 ° C en gezuiverd na het ontdooien zonder een significante afname van de opbrengst. Opslag van de verdunde oplossing van de fusieproteïne bij 4 ° C gedurende 24 uur geeft ook vergelijkbare resultaten.
  10. Analyseer de IMAC door SDS-PAGE. Voeg 20 µL van het laden van de kleurstof aan elk monster. Laden 2 µL van het ruwe materiaal (2.7), de ongebonden Fractie, de Fractie wassen en elke breuk van de elutie piek op een 15% gel. De gel voor 90 min op 180 V. vlek de gel met Coomassie kleurstof volgens de instructies van de fabrikant uitgevoerd. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 1D.

3. de splitsing van de zijn6-SUMO-tag en HPLC zuivering

Let op: Trifluorazijnzuur (TFA) is een vluchtige vloeistof en kunnen ernstige brandwonden veroorzaken dus voorzichtig behandelen. Verricht alle behandeling in een zuurkast en adequate persoonlijke beschermingsmiddelen (d.w.z., wegwerp nitril handschoenen, veiligheidsbril en een laboratoriumjas) dragen.

  1. In een 5 L fles, voeg 5 mL TFA met een plastic injectiespuit tot 5 L water (oplosmiddel A: H2O, 0,1% (TFA). Voeg 2,5 mL TFA met een plastic injectiespuit tot een 2.5 L fles acetonitril (oplosmiddel B: acetonitril, 0,1% TFA).
  2. Voorbereiding van het HPLC-systeem zoals voorgesteld door de fabrikant. Een lege uitvoeren om te zorgen voor een schone kolom uit te voeren.
  3. Neem een steekproef van 100 µL van de fusieproteïne vóór de toevoeging van ULP1 om te controleren de splitsingsproducten reactie door UPLC (stap 3.5).
  4. Breng 20 mL van de fusieproteïne een nieuwe tube van 50 mL en Voeg 0.4 mL van de stockoplossing ULP1, incubeer op ijs. Houd de resterende fusieproteïne op ijs.
    Opmerking: Het zijn-gelabeld katalytische fragment 403-621 van de Ubiquitin-achtige-specifieke protease 1 (hier aangeduid als "ULP1") werd gebruikt om het klieven van de SUMO-tag. De fusieproteïne is stabieler dan de gekloofd Httex1. Het is raadzaam niet te klieven van de SUMO-tag van de hele partij. In plaats daarvan voortzetten aliquots van een grootte die rechtstreeks en volledig naar de HPLC-kolom kan worden toegepast.
  5. Elke 10 minuten, neem een steekproef van 100 µL van de reactie van de splitsing voor het bewaken van de voortgang door ultra-prestatie vloeistofchromatografie (UPLC). Centrifugeer de monsters (18000 rpm, 4 ° C, 2 min) en analyseren van 2 µL van het supernatans dat door UPLC (kleurovergang van 10% tot 90% oplosmiddel B in A voor 0,25 tot en met 3 min, 10% B voor 1 min, Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het instrument gebruik). Vergelijk de chromatogrammen verkregen voor het monster vóór toevoeging van de ULP1 en de monsters na. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 2B.
  6. Zodra de SUMO-decolleté voltooid is (de piek van de fusieproteïne verdwenen in het chromatogram UPLC en wordt volledig geconverteerd naar de nieuw verschijnende SUMO en Httex1 piek), het filteren van het monster met een spuit filter (0,22 µm).
    Opmerking: Het splijten van SUMO is meestal erg snel (10-20 min bij 4 ° C) Daarom UPLC analyse met een bewerkingstijd van 4 min is een waardevol hulpmiddel voor de monitoring van de reactie. Filteren van het monster vóór HPLC is zuivering vooral een preventieve maatregel te verhogen de levensduur van de kolom. Het monster moet niet troebel wenden.
  7. Zuiveren van het gefilterde monster door RP-HPLC (hellingsgradiënt van 25-35% oplosmiddel B in oplosmiddel A, meer dan 40 min op 15 mL/min. (0-10 min: 5%, 10-12,5 min: 5 tot 25%; 12,5-52,5 min: 25 tot 35%; 52,5-57,5 min 35 tot en met 95%; Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het instrument gebruik). Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 2C.
    Opmerking: Httex1 en zijn6-SUMO aparte goed door RP-HPLC. Er kan echter kleine hoeveelheden afgeknotte Httex1 in het begin en einde van de piek. Kleine breuken om op te halen van de maximale hoeveelheid zuiver materiaal te verzamelen.
    Let op: Gebruik de juiste veiligheidsuitrusting (d.w.z., laboratoriumjas, geïsoleerde handschoenen en een gelaatsscherm) wanneer behandeling van cryogene vloeistoffen.
  8. Analyseren van de HPLC-breuken door electro-spray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS, autosampler, injecteren 10 µL, stromen van 0,6 mL/min, oplosmiddel: 20% B in A, geen kolom, Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het instrument gebruik) en UPLC (gradiënt van 10% tot 90% oplosmiddel B in A voor 0,25 tot en met 3 min, 10% B voor 1 min, Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor het instrument gebruik). Bundelen van breuken conductometrisch in 50 mL plastic buizen, bevriezen in vloeibare stikstof en lyophilize. Wegen en breng het gelyofiliseerd eiwit in 2 mL plastic buizen en opslaan bij-20 ° C.
  9. Karakteriseren het gezuiverde materiaal door UPLC, ESI-MS en SDS-pagina. Los 100 µg gelyofiliseerd Httex1 in 8 µL van nette TFA in een tube van 1,5 mL en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in de gesloten reageerbuis. Zorgvuldig verdampen de TFA onder een zuurkast met een stream argon of stikstof. Gebruik lage druk van stikstof/argon om te voorkomen dat het verlies van het monster.
    1. Los van het eiwit in 100 µL van H2O. analyseren 2 µL door UPLC en 5 µL van ESI-MS zoals in stap 3.8. Mix 20 µL van eiwit oplossing met 20 µL van 2 x laden kleurstof.
    2. Hoeveelheden van 1 microgram naar 10 µg door SDS-PAGE te analyseren. De gel voor 90 min op 180 V. vlek de gel met Coomassie kleurstof volgens de instructies van de fabrikant uitgevoerd. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 2D.

4. aggregatieniveau en Resolubilization van Httex1 eiwitten

Let op: TFA is een vluchtige vloeistof en kunnen ernstige brandwonden veroorzaken dus voorzichtig behandelen. Verricht alle behandeling in een zuurkast en adequate persoonlijke beschermingsmiddelen (d.w.z. wegwerp nitril handschoenen, veiligheidsbril en een laboratoriumjas) dragen.

  1. Bereiden van 10 mL de Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) uit de voorgemengde poeder in een tube van 50 mL. Filtreer de oplossing van de DPBS door een 0,2 µm filter vóór elk gebruik.
  2. Los 150 µg gelyofiliseerd Httex1 in 12 µL van nette TFA in een tube van 1,5 mL en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in de gesloten reageerbuis. Zorgvuldig verdampen de TFA onder een zuurkast met een stream argon of stikstof. Lage druk van stikstof/argon gebruiken om te voorkomen dat het verlies van de monster-38.
    Opmerking: gebruik In het algemeen 4 µL TFA gedesag 50 µg eiwit te ontbinden. Deze procedure zal het maken van een film van eiwitten aan de binnenkant de muren van de proefbuis. Om te voorkomen dat onmiddellijke samenvoeging van Httex1 in de volgende stappen, werken met vooraf gekoelde buffers, houden het eiwit altijd op ijs en hoge concentraties voorkomen.
  3. Los van de gedesaggregeerde proteïne in 1 mL pre gekoelde DPBS en breng de pH op 7,2-7.4 met 1 M NaOH. Filtreer de oplossing van de eiwitten door een 100 kDa centrifugaal filter in 1,5 mL plastic buizen (20000 x g, 4 ° C, 20 minuten).
    N.B. De berekende theoretische concentratie van Httex1 is hoger dan de gewenste eindconcentratie ter compensatie mogelijk verlies. De filtratie-stap is nodig om te verwijderen elke aggregaten die zou hebben gevormd tijdens de ontbinding van het eiwit.
  4. Bepaal de concentratie van Httex1 met behulp van een ijkcurve van UPLC gebaseerd op de aminozuur analyse (detectie op λ214) en 2 µg van het eiwit verzenden aminozuur analyse voor het valideren van de concentratie10. Berekenen van de hoeveelheid DPBS die moet worden toegevoegd tot een concentratie van 3 µM aan Httex1.
  5. Verdun de eiwitten aan 3 µM door toevoeging van het berekende bedrag van DPBS aan de reageerbuis. Houd de buis op ijs tot de inleiding van de aggregatie-protocol.
    Opmerking: Httex1 43Q niet in oplossing moeten worden opgeslagen. Altijd bereid een vers eiwit-oplossing op basis van het bovenstaande protocol. Httex1 eiwitten worden het best opgeslagen als een gelyofiliseerd poeder bij-20 ° C.

5. monitoring van de aggregatie kinetiek van Httex1 43Q met UPLC en circulair dichroïsme (CD) spectroscopie en karakterisering van de aggregaten door Transmissie Electronenmicroscopie (TEM)

  1. Uranyl formate oplossing voorbereiden door TEM als eerder gemeld39.
  2. Starten van de samenvoeging van Httex1 43Q door een oplossing van de 3 µM in DPBS bij 37 ° C (gebruik 1 mL van oplossing bereid zoals hierboven beschreven in het aggregatieniveau protocol) aan het broeden.
    Opmerking: De samenvoeging van Httex1 kan worden uitgevoerd bij hogere concentraties afhankelijk van de behoeften en doelstellingen van het experiment.
  3. Kwantificeren van het bedrag van de oplosbaar eiwit met UPLC op aangegeven tijd punten (op 0, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 en 120 h). Om dat te doen, neem een aliquoot deel van 35 µL en het verwijderen van de onoplosbare aggregaten door middel van centrifugeren (20000 x g, 4 ° C, 20 min). 4 µL van de bovendrijvende substantie te injecteren in de UPLC. Bereken het percentage oplosbaar monomeer gebaseerd op de verandering van de piekoppervlakte met behulp van het instrument software 40. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 3A.
  4. Kenmerkend zijn de wijzigingen in de secundaire structuur met behulp van CD spectroscopie bij 0 en 48 uur. Neem een aliquoot gedeelte van 100 µL en meet van de ellipsiteit (1 mm quartz cuvette, 195 nm tot 250 nm, 20 ° C, gegevens wijst elke 0,2 nm snelheid 10 nm/min, digitale integratie tijd 2 s, bandbreedte van 1.0 nm). Verwerven van 6 spectra van het monster en de gemiddelde en glad met behulp van een binomiale filter met convolutie breedte van 99. De spectra worden uitgezet als de gemiddelde residu molaire ellipsiteit (thetaMRE)41. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 3B.
  5. Kenmerkend zijn de structurele en morfologische eigenschappen van de aggregaten door TEM. Zet 3 µL van de eiwit-oplossing op een Formvar/carbon-gecoate 200-mesh, gloed-geloosd koperen raster voor 1 min. wassen het raster tweemaal met 15 μL water, eenmaal met 15 μL van 0,7% (m/v) uranyl formate en vlek voor 30 s met 15 μL van 0,7% w/v uranyl formate. Een TEM analyses van de rasters uit te voeren. Vergelijk de resultaten met representatieve resultaten in Figuur 3C.

Resultaten

Httex1 wordt uitgedrukt in E. coli met een N-terminal zijn-6-SUMO label. De representatieve resultaten van de expressie en de zuivering van de fusieproteïne worden samengevat in Figuur 1. De volgorde van de Httex1 bestaat uit 2-90 residuen van Htt en begint met Ala2, omdat Met1 volledig gekloofd in vivo42 is. De nummering van de aminozuren verwijst naar de 23Q-variant, de volledige sequentie van de geuite fusieproteïne is getoond in Figuur 1A. De plasmiden worden gestort op Addgene in de nabije toekomst te delen met de Gemeenschap. Een schematische voorstelling van de plasmide en de geuite fusieproteïne is afgebeeld in Figuur 1B. His6-SUMO Httex1 spreekt op een gemiddeld beveiligingsniveau (Figuur 1C) en de meeste van de fusieproteïne is aanwezig in de oplosbare fractie na lysis, zowel voor de 23Q en de 43Q variant. De fusieproteïne migreert hoger dan verwacht, op basis van het molecuulgewicht. Dit is deels te wijten aan de sterke vouw van SUMO maar vooral te wijten aan de samenstelling van de ongebruikelijke volgorde van Httex1, die voornamelijk glutamine en proline residuen bevatten. Zowel de wildtype (23Q) en de mutant (43Q) fusieproteïne ~ 80% zuiverheid kan worden verrijkt door IMAC (Figuur 1D) de aanwezigheid van co zuiveren host eiwit kan worden verklaard door het relatief lage expressie niveau van Httex1 en de grote steekproef het volume wordt toegepast op de kolom.

Het splijten van het zijn6-SUMO tag en de zuivering van Httex1 wordt getoond in Figuur 2. UPLC is een efficiënt hulpmiddel voor de monitoring van de splitsing van de zijn6-SUMO label (Figuur 2B). De oorspronkelijke piek van het fusie-eiwit wordt verbruikt en twee nieuwe en goed gescheiden bergtoppen overeenkomt de zijn6-SUMO tag en Httex1 verschijnen. De splijting reactie is afgewerkt in 10-20 min. De Western Blot (WB) is te traag om te controleren de splitsingsproducten reactie efficiënt, maar het is opgenomen in de afbeelding ter referentie en om aan te tonen van de volledigheid van het SUMO splijten. Beide Httex1 23Q en 43Q kunnen worden gescheiden van het zijn goed6-SUMO tag door RP-HPLC (Figuur 2C) en werden verkregen in hoge zuiverheid, zoals blijkt uit de UPLC, MS en SDS-pagina analyse (Figuur 2D).

Om te illustreren dat de proteïnen van de Httex1 bereid door deze methode blijven de eigenschappen van de verwachte aggregatie van Httex1, we de kinetiek van de fibrillization van mutant Httex1 bij 37 ° C beoordeeld door een sedimentatie assay, bewaakt de wijzigingen in de secundaire structuur door CD spectroscopie, en de morfologie van de aggregaten door TEM gekenmerkt. Een representatieve gegevensset van de kinetiek van de aggregatie van de vorming van de fibril van de mHttex1 zoals bepaald door een sedimentatie assay is afgebeeld inFiguur 3A. Het verlies van oplosbare Httex1 43Q na verloop van tijd ontstaan door de vorming van de fibril werd gekwantificeerd door UPLC. We zien een volledige uitputting van oplosbaar eiwit na 48 uur incubatie. Daarnaast vastgesteld we de secundaire structuur van de eiwitten door CD spectroscopie (Figuur 3B). Httex1 43Q verschuivingen van ongestructureerde (λmin 205 nm) naar voornamelijk β-sheet rijke conformatie (λmin 215 nm) na 48 uur incubatie. Deze structurele wijziging gaat gepaard met de vorming van de lange fibrillar aggregaten als waarneembare door TEM 48 uur (Figuur 3C).

figure-results-1
Figuur 1 . Meningsuiting en zuivering van de zijn6-SUMO Httex1 fusieproteïne. 
(A) de volgorde van de aminozuur van het zijn6-SUMO-Httex1-QN fusion constructies (zijn6-SUMO in groen en Httex1-QN in oranje); (B) schematisch overzicht van de expressie en de zuivering van de fusieproteïne; (C) SDS-pagina-analyse van de expressie en de oplosbaarheid van de fusieproteïne na lysis; (D) Chromatogram van de IMAC zuivering van de fusieproteïne en analyse van de breuken door SDS-PAGE (rode balk: niet-afhankelijke, blauwe deelteken: wassen breuk, zwarte bar: breuken met de elutie piek); Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2 . Splitsing van het zijn6 SUMO tag en zuivering van label-gratis Httex1-QN eiwitten.
(A) schematisch overzicht; (B) analyse van de splitsing van de SUMO-tag met ULP1 door UPLC (blauwe: vóór toevoeging van ULP1; zwart: 20 min (23Q), respectievelijk 10 min (43Q) na toevoeging van ULP1) en WB (MAB5492 1:2000, secundaire geit anti muis antilichaam 1:5000); (C) Chromatogram van de voorbereidende RP-HPLC zuivering van Httex1; D: analyse van het gezuiverde Httex1 door UPLC, SDS-pagina en ESI-MS; de verwachte molecuulgewicht is respectievelijk 9943 Da (23Q) en 12506 Da (43Q). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3 . Samenvoeging van Httex1-43Q: (A) sedimentatie assay gebaseerd op UPLC. (B) CD spectra van de secundaire structuur bij 0 uur en 48 h. (C) TEM microfoto van de aggregaten in 48 h (schaal bars zijn 200 nm). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussie

In dit protocol, we hebben geschetst een efficiënte procedure voor verkrijging milligram hoeveelheden native, gecodeerde Httex1 23 of 43 glutamine residuen bevatten. Dit werd bereikt door het uiten van Httex1 als een fusie van de C-terminal een zijn6-SUMO tag, die wordt gebruikt voor het isoleren van de fusieproteïne uit de cel lysate door IMAC en gekloofd is vóór HPLC zuivering van Httex1. Terwijl de SUMO-strategie is gebruikt in de productie van verschillende andere eiwitten, onze methode laat zien dat de unieke eigenschappen die Sumo kan ook worden gebruikt voor het genereren van intrinsiek ontregelde, aggregatie-gevoelig, amyloidogenic eiwit dat reeds eerder is aangetoond te worden moeilijk te hanteren en43,44te produceren. We presenteren een protocol dat is ongecompliceerd, makkelijk te gebruiken en vergelijkbaar met een protocol voor het genereren van een "goedgedragende" eiwit. De SUMO fusion Lost en stabiliseert Httex1 tijdens de expressie en de zuivering van de IMAC. Voortijdige splijten van de tag, zoals waargenomen met de intein strategie10 en aggregatie waren niet langer een probleem.

Intrinsiek ongeordende eiwitten zijn bijzonder kwetsbaar voor afbraak. Terwijl de aantasting van het N-terminaal N17 regio niet een probleem met behulp van dit protocol is, kunnen opschoningen in de PRD van Httex1 optreden. Als de afgekapte eiwitten zijn zeer gelijkaardig aan de Httex1 in hydrophobicity, lading en grootte, ze te verwijderen met chromatografische middelen is uitdagend, dus het is best om te voorkomen dat hun vorming in de eerste plaats. Steken nauw bij het protocol, altijd bezig met ijs en met behulp van een voldoende hoeveelheid proteaseinhibitor moeten helpen het niveau van waargenomen afkappen zeer laag houden. Toepassing van een fusie-tag in het C-terminus van Httex1 kon verwijderen opschoningen in de PRD gemakkelijk als de afgekapte proteïne evenals de affiniteit tag zou verliezen. Echter, als de oorspronkelijke volgorde worden gehandhaafd dat met deze optie kan niet worden toegepast moet als Httex1 met proline en tot de beste van onze kennis eindigt er zijn geen C-terminal fusion labels waarvan bekend is dat het induceren van spoorloze en efficiënte decolleté na proline.

Het meest kritische deel van het protocol is de behandeling van de Httex1 bevrijd na de splitsing van de SUMO-tag door ULP1. Het eiwit moet onmiddellijk worden gezuiverd door RP-HPLC. Gelukkig is dit een efficiënte en snelle reactie, dat is meestal voltooid in 10-20 min bij 4 ° C. De intein strategie vereist daarentegen enkele uren voor volledige splitsing van de intein, waarvoor derhalve een trade-off tussen onvolledig decollete en begin aggregatie te maximaliseren van het rendement. Een snelle workup is vereist voor mutant Httex1, zoals op zal voorsprong bijeen te voegen op de relatief hoge concentratie aanwezig in de reactie van het decollete, overwegende dat de 23Q variant voor een langere tijd stabiel is. Tijdens de RP-HPLC-zuivering, een ander voordeel van SUMO wordt duidelijk: terwijl de Ssp DnaB intein hydrofoob is en sterk naar de kolom stokken, SUMO is meer hydrofiele en GC volledig uit de C4 reversed-phase kolom. Commerciële ULP1 weliswaar vrij kostbaar is, kan het eiwit gemakkelijk worden geproduceerd in hoog rendement na eerder gepubliceerde protocollen29.

Het cruciale belang van de toepassing van een protocol aggregatieniveau voorafgaand aan het gebruiken van de Httex1 kan niet genoeg benadrukt. Gelyofiliseerd polyQ eiwitten zoals Httex1 kunnen zijn stabiel en opgeslagen lange periodes, maar zijn niet volledig oplosbaar zijn in water en buffers. De aanwezigheid van voorgevormde oligomeren of fibrillen kan een belangrijke impact hebben op aggregatie kinetiek en biofysische eigenschappen van de eiwit-45. Het aggregatieniveau protocol hier beschreven kan het aggregatieniveau van het eiwit, verwijdering van voorgevormde aggregaten en generatie van een oplossing van de monomeer Httex1 uit een gelyofiliseerd monster. We waargenomen soortgelijke aggregatie kinetiek en fibril morfologie voor Httex1 verkregen met de SUMO en de strategie van de intein.

Vergeleken met vorige methoden voor de productie van Httex1, de SUMO-strategie zoals hier beschreven biedt verschillende voordelen en breidt het bereik van mogelijke studies te onderzoeken van de structuur en functionele eigenschappen van dit eiwit in gezondheid en ziekte. De fusieproteïne SUMO-Httex1 is gemakkelijk te hanteren, kan worden ingevroren en opgeslagen of bewaard in de oplossing gedurende 24 uur bij omgevingstemperatuur, terwijl de vrije mHttex1 snel zou aggregaat. De stabiliteit en de hoge oplosbaarheid van de SUMO-Httex1 fusion eiwitten bieden meer flexibiliteit te manipuleren van de eiwitten en/of enzymatische en chemische wijzigingen in mHttex1 die anders niet mogelijk na splitsing zijn zou invoeren. Dit omvat de invoering van posttranslationele modificaties, fluorophores, spin etiketten, Biotine tags, etc. moeten de vooruitgang hier gepresenteerd 1) vergemakkelijken van toekomstige studies om te verhelderen structuur-functie relaties van Httex1; 2) het genereren van nieuwe hulpmiddelen om te onderzoeken Htt aggregatie en pathologie zich kan verspreiden; 3) stellen de ontwikkeling van nieuwe testen te identificeren van moleculen die mutant Httex1 te stabiliseren en te voorkomen dat de samenvoeging; en 4) moedigen wetenschappers uit andere velden om te werken aan dit eiwit en Word lid van onze zoektocht naar behandelingen voor de ziekte van Huntington.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse met de inhoud van dit artikel hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de CHDI-Stichting en de Zwitserse National Science Foundation. Wij danken Dr. Sophie Vieweg voor nuttige discussies tijdens de ontwikkeling van dit nieuwe systeem van de expressie en andere leden van de groep van de Lashuel voor het delen van hun ervaringen met dit systeem van expressie en voor hun input en waardevolle feedback. Wij danken ook Prof. Oliver Hantschel voor het verstrekken van de ULP1-plasmide. De auteurs bedanken Dr. John B. Warner en Dr. Senthil K. Thangaraj voor de kritische evaluatie van het manuscript

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uranyl formate (UO2(CHO2)2)EMS22450
Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 gridsEMSFCF200-Cu-50
High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm light path from Hellma AnalyticsHellmaAnalytics110-1-40
Buffer Substance Dulbecco's (PBS w/o Ca and Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVAWitechSVA4730203
AmpicillinAxonLabA0839.0100
Luria Broth (Miller's LB Broth) Chemie Brunschwig1551.05
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)AxonLabA1008.0025
E. coli B ER2566NEBNEB# E4130
ImidazoleSigma56750-500G
cOmplete Protease Inhibitor CocktailRoche4693116001
Anti-Huntingtin Antibody, a.a. 1-82Merck Millipore CorporationMAB5492
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H + L)Licor925-68070
PMSFAxonLabA0999.0005
HisPrep 16/10 column GE Healthcare28936551
C4 HPLC columnPhenomenex00G-4168.P0    10 µm C4 300 Å, LC Column 250 x 21.2 mm, Phenomenex, 19x10 mm guard column, not temperature jacketed
Acetonitrile HPLCMachereyNagelC2502
Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterileSarstedt AG83.1826
Spectrophotometer semi-micro cuvetteReactolab S.A.2534
Superloop, 1/16" fittings (ÄKTAdesign), 50 mlGE Healthcare18111382
Trifluoroacetic acidSigma302031
GREINER Tubes fo FPLC 16 x 100 mm, cap. 12.0 mlGreiner Bio-One7.160 102
 100 kD Microcon  fast flow filtersMerck Millipore CorporationMRCF0R100
Vibra-cell VCX130 ultrasonic liquid processorSonics
Äkta 900 equipped with a fraction collector GE Healthcare
Jasco J-815 Circular DichroismJasco
Waters UPLC system WatersC8 BEH acquity 2.1x100 mm 1.7 micron column , preheated column (40 °C), flow rate of 0.6 mL/min, injection volume of 4 μL
waters HPLC systemWaters2489 UV detector and 2535 quaternary gradient module, 20 mL loop in a FlexInject housing
ESI-MS: Finnigan LTQThermo Fisher Scientific
lyophylizer instrumentFreeZone 2.5 Plus
Tecnai Spirit BioTWIN FEIelectron microscope equipped with a LaB6 gun and a 4K x 4K FEI Eagle CCD camera (FEI) and operated at 80 kV
37 °C shaking  incubatorInfors HT multitron Standard
Biophotometer plusEppendorf

Referenties

  1. Saudou, F., Humbert, S. The Biology of Huntingtin. Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).
  2. MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. Huntington's disease. Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).
  3. Li, S., Li, X. J. Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease. Molecular Neurodegeneration. 1, 19(2006).
  4. DiFiglia, M. Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain. Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).
  5. Atwal, R. S., et al. Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity. Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).
  6. Sathasivam, K., et al. Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).
  7. Mangiarini, L., et al. Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell. 87 (3), 493-506 (1996).
  8. El-Daher, M. T., et al. Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation. EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).
  9. Lunkes, A., et al. Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).
  10. Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation. Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).
  11. Georgalis, Y., et al. Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).
  12. Scherzinger, E., et al. Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo. Cell. 90 (3), 549-558 (1997).
  13. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  14. Muchowski, P. J., et al. Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).
  15. Heiser, V., et al. Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).
  16. Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation. Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).
  17. Tam, S., et al. The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).
  18. Nekooki-Machida, Y., et al. Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).
  19. Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer. Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).
  20. Legleiter, J., et al. Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).
  21. Legleiter, J., et al. Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo. Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).
  22. Nucifora, L. G., et al. Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).
  23. Dahlgren, P. R., et al. Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation. Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).
  24. Poirier, M. A., et al. Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization. Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).
  25. Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy. Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).
  26. Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells. Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).
  27. Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation. Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).
  28. Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils. Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).
  29. Malakhov, M. P., et al. SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins. Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).
  30. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  31. Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility. Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).
  32. Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System. Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).
  33. Reif, A., et al. Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6. Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).
  34. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).
  35. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).
  36. Lawrence, A. M., Besir, H. U. Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
  37. Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).
  38. Chen, S. M., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).
  39. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  40. O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).
  41. Greenfield, N. J. Analysis of circular dichroism data. Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).
  42. Aiken, C. T., et al. Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).
  43. Satakarni, M., Curtis, R. Production of recombinant peptides as fusions with SUMO. Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).
  44. Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin. Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).
  45. Chen, S., Wetzel, R. Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides. Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Eiwitzuiveringge mmobiliseerde metaalaffiniteitschromatografiereversed phase HPLCUPLC analyseSDS PAGE analysefibrilvormingaggregatiekinetiektag vrij eiwit
Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.