De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem

Summary

Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Deze aanpak heeft wijd gebruikt voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen.

Abstract

Een aantal transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze zijn transgene muizen en de Lambda (λ) Selecteer cII mutatie detectiesysteem tewerkgesteld voor mutageniteit experimenten door veel onderzoeksgroepen wereldwijd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay, die kan worden toegepast op gekweekte cellen van transgene muizen/ratten of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: (1) isolatie van genomic DNA van de cellen of organen/weefsels van transgene dieren behandeld in vitro of in vivo, respectievelijk een teststof; (2) herstel van de lambda shuttle vector uitvoering een vogelgriepvirus verslaggever-gen (dat wil zeggen, cII transgenic) uit de genomic DNA; (3) de verpakking van de geredde vectoren in infectieuze bacteriofagen; (4) een host bacteriën infecteren en kweken in selectieve omstandigheden dat verspreiding van de geïnduceerde cII mutaties; en (5) scoren de cII-mutanten en DNA-sequentie analyse om te bepalen van de cII mutantfrequentie en mutatie spectrum, respectievelijk.

Introduction

Een breed scala van transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze hebben transgene muizen van de Big Blue (genoemd hierna BB) en de λ Select cII mutatie detectiesysteem gewerkt voor mutageniteit experimenten door deze groep en vele andere onderzoek groepen wereldwijd^{1,2, 3,4,5,6,7,8}

Protocol

1. Genomisch DNA isolatie van muis embryonale fibroblasten

Opmerking: Primaire muis embryonale fibroblasten zijn geïsoleerd uit embryo's die zijn afgeleid van BB transgene muizen met C57BL/6 genetische achtergrond, volgens de gepubliceerde protocol⁵³. De grondstof voor dit protocol bestaat uit 1 x 10,⁶ tot en met 1 x 10⁷ embryonale fibroblast cellen met een test samengestelde versus controle behandeld. Het oogsten en tellen van deze cellen met standaardmethoden worden beschreven in verwijzingen^10,54,55....

Results

Afhankelijk van de Gegevensdistributie, worden parametrische of niet-parametrische tests gebruikt om te bepalen van de significantie van het verschil in de cII -mutantfrequentie tussen behandeling en controlegroepen (d.w.z., geïnduceerde versus spontane mutant frequenties) . Vergelijking van de frequenties geïnduceerde cII mutant over verschillende behandelgroepen is gemaakt door diverse (paarsgewijze) statistische toetsen, naargelang van toepassing. De hypergeo.......

Discussion

De λ Select cII bepaling wordt gebruikt voor de detectie van mutaties in de cII transgenic verhaald aan de genomic DNA van cellen uit organen/weefsels van BB knaagdieren³verkregen. Het genoom van deze transgene dieren bevat meerdere exemplaren van de tandem van de shuttle-vector inplanten geïntegreerde λLIZ, die de cII draagt (294 bp) en lacI (1.080 bp) transgenen, als het vogelgriepvirus reporter genen^{1, 2}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	MO Bio Laboratories, Inc.	12112-05	Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Thermo Fisher Scientific	4337455	None
Casein Peptone	Alfa Aesar	H26557	None
Gelatine	J. T. Baker	2124-01	Powder
Glycerol	Fisher Scientific	BP 229-1 / M-13750	None
LB Agar	Fisher Scientific	BP 9724-500	None
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	8104	50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate	Fisher Scientific	M-15756	None
Taq5000 DNA Polymerase	Qiagen	201207	None
Thiamine Hydrochloride	Macron Fine Chemicals	2722-57	None
Transpack Packaging Extract	Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.	200223	50 packaging reactions
Tris Base	Fisher Scientific	BP 152-1 / EC 201-064-4	None
Trypton	Biosciences	RC-110	None