Methodenartikel

De Lambda Selecteer cII mutatie detectiesysteem

DOI:

10.3791/57510

⸱

26 april 2018

 , 
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay in gekweekte cellen van transgene knaagdieren of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Deze aanpak heeft wijd gebruikt voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een aantal transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze zijn transgene muizen en de Lambda (λ) Selecteer cII mutatie detectiesysteem tewerkgesteld voor mutageniteit experimenten door veel onderzoeksgroepen wereldwijd. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de Lambda Selecteer cII mutatie assay, die kan worden toegepast op gekweekte cellen van transgene muizen/ratten of de overeenkomstige dieren behandeld met een chemische/fysieke agent van belang. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: (1) isolatie van genomic DNA van de cellen of organen/weefsels van transgene dieren behandeld in vitro of in vivo, respectievelijk een teststof; (2) herstel van de lambda shuttle vector uitvoering een vogelgriepvirus verslaggever-gen (dat wil zeggen, cII transgenic) uit de genomic DNA; (3) de verpakking van de geredde vectoren in infectieuze bacteriofagen; (4) een host bacteriën infecteren en kweken in selectieve omstandigheden dat verspreiding van de geïnduceerde cII mutaties; en (5) scoren de cII-mutanten en DNA-sequentie analyse om te bepalen van de cII mutantfrequentie en mutatie spectrum, respectievelijk.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een breed scala van transgene diermodellen en mutatie detectiesystemen zijn ontwikkeld voor het testen van de mutageniteit van kankerverwekkende stoffen in zoogdiercellen. Van deze hebben transgene muizen van de Big Blue (genoemd hierna BB) en de λ Select cII mutatie detectiesysteem gewerkt voor mutageniteit experimenten door deze groep en vele andere onderzoek groepen wereldwijd1,2, 3,4,5,6,7,8,9. Voor de afgelopen 16 jaar, hebben we onderzocht de mutagene effecten van verschillende chemische en/of fysische agentia met behulp van deze transgene dieren of hun overeenkomstige embryonale fibroblast celculturen behandeld met een teststof en vervolgens geanalyseerd de fenotype en genotype van de cII transgenic door de λ Select cII assay en DNA sequencing, respectievelijk10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. het genoom van deze transgene dieren bevat een bacteriofaag lambda shuttle vector (λLIZ) geïntegreerd op chromosoom 4 als een multicopy hoofd-tot-staart concatemer1,2,25. De vector λLIZ shuttle draagt twee vogelgriepvirus reporter genen, namelijk de lacI en cII transgenen1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. de λ Select cII bepaling is gebaseerd op het herstel van de λLIZ shuttle vectoren van de genomic DNA van cellen afgeleid van organen/weefsels van transgene dieren1,2,25 . De herstelde λLIZ shuttle vectoren worden vervolgens verpakt in lambda phage hoofden kunnen infecteren een indicator host Escherichia coli. Vervolgens worden de geïnfecteerde bacteriën gekweekt in selectieve omstandigheden kunnen scoren en analyse van mutaties in de cII transgenic1,3.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de λ Select cII assay, die uit de isolatie van genomic DNA uit cellen/organen van transgene dieren behandeld in vitro bestaat/in vivo met een samengestelde, ophalen van de test van de λLIZ shuttle vectoren van de genomic DNA, verpakking van de vectoren in infectieuze λ bacteriofagen, infectie van de gastheer E. coli met de bacteriofagen, identificatie van de cII-mutanten in selectieve omstandigheden om te bepalen van de mutantfrequentie cII , en DNA sequentieanalyse ervoor zorgen dat het spectrum van de mutatie cII . Het protocol kan worden toegepast op transgene muis/rat cel culturen behandeld in vitro met een chemische/fysieke agent van belang, of weefsels/organen van de overeenkomstige dieren behandeld in vivo met de test chemische/agent1, 2,4,48,49,50,51,52. Een schematische voorstelling van de λ Select cII assay is afgebeeld in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Genomisch DNA isolatie van muis embryonale fibroblasten

Opmerking: Primaire muis embryonale fibroblasten zijn geïsoleerd uit embryo's die zijn afgeleid van BB transgene muizen met C57BL/6 genetische achtergrond, volgens de gepubliceerde protocol53. De grondstof voor dit protocol bestaat uit 1 x 10,6 tot en met 1 x 107 embryonale fibroblast cellen met een test samengestelde versus controle behandeld. Het oogsten en tellen van deze cellen met standaardmethoden worden beschreven in verwijzingen10,54,55.

  1. Bereiden buffer een (0,3 M sacharose, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM spermidine, 0,15 mM spermine en 2 mM EDTA), B (150 mM NaCl en 5 mM EDTA, pH 7,8) buffer en buffer C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 20 mM NaCl, 20 mM EDTA en 1% SDS) in opmars, en behouden bij kamertemperatuur (RT) voor maximaal één jaar54,55.
  2. Resuspendeer de cellen in 2-4 mL buffer A in een 15 mL conische centrifugebuis door herhaaldelijk op en neer met behulp van een breed pipetteren droeg 1.000 µL pipette uiteinde.
  3. Toevoegen van een volume (2-4 mL) buffer A met 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (b.v.Nonidet P40) met behulp van een glazen serologische pipet.
  4. Incubeer de buis op ijs gedurende 5 minuten.
  5. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 5 min op RT.
  6. Verwijder het supernatant en wassen van de pellet met 10 – 15 mL buffer een met behulp van een glazen serologische pipet.
  7. Resuspendeer de pellet in 2-4 mL buffer B.
  8. Toevoegen van een volume (2-4 mL) buffer C met 600 µg/mL proteïnase K.
  9. Incubeer de buis gedurende 3 uur bij 37 ° C.
  10. RNase A toevoegen om een eindconcentratie van 100 µg/mL.
  11. Incubeer de buis gedurende een extra 1 uur bij 37 ° C.
  12. Toevoegen van een volume (2-4 mL) fenol (verzadigd in 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1 vol/vol).
    Opmerking: Fenol kan vormen een ernstig gezondheidsrisico en moet met extreme voorzichtigheid worden behandeld. Fenol is zeer corrosief voor de huid en gemakkelijk geabsorbeerd door het, en andere effecten vertoont. Behandeling van fenol, altijd gebruik maken van dubbele handschoenen, beschermende brillen dragen als werken in een chemische zuurkast.
  13. Meng goed door het omkeren van de buis gedurende 5 minuten op een buis rotator bij 4 ° C.
  14. Centrifugeer de buis bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
  15. Verwijder de waterige fase (toplaag) aan een nieuwe buis met behulp van een glazen serologische pipet.
  16. Herhaal fenol: chloroform: isoamyl alcohol extractie 1 tot 3 keer de waterfase is duidelijk en de interface is niet langer troebel.
  17. Voeg 1/10 volume (200-400 µL) 3M Natriumacetaat, pH 5.2.
  18. Voeg 2.5 volume (5-10 mL) 100% ethanol (gekoeld) en omkeren van de tube zachtjes met de hand voor 2-3 min.
  19. Het DNA met een glas haak in de wachtrij geplaatst en overbrengen naar een nieuwe buis met 1 – 5 mL 70% Ethanol en grondig wassen. Als alternatief, de buis op hoge snelheid (3.500 x g) Centrifugeer bij 4 ° C tot het DNA pellet en wassen het grondig met 1 – 5 mL 70% Ethanol.
  20. Centrifugeer de buis op hoge snelheid (3.500 x g) bij RT, verwijder het supernatant en het DNA voor 10-15 minuten drogen.
  21. Los van het DNA in 10 – 100 µL TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) en sla bij 4 ° C (voor korte-opslag van maximaal één maand) of bij-20 ° C (voor langere duur van de opslag). De optimale concentratie voor DNA voor de λ Select cII assay is 0.5 – 1.0 µg/µL (in TE de buffer)56.

2. in Vitro de reactie van de verpakking

  1. Per één verpakking reactie toevoegen ~ 5 µg genomic DNA (eindvolume: 8-12 µL, genomic DNA werd geïsoleerd in sectie 1 van muis embryonale fibroblasten behandeld in vitro met een teststof of besturingselement) tot een koker van de microcentrifuge met de eerste reactie mix (~ 10 µL).
    Opmerking: In-house bereid of verkrijgbare λ verpakking extracten worden gebruikt in verschillende laboratoria. In de commerciële verpakking extract kit gebruikt hier56 (Zie de Tabel van materialen), rode buizen bevatte de eerste reactie mix (~ 10 µL) en blauwe buizen bevatte de tweede reactie mix (~ 70 µL voor ten minste 5 reacties).
  2. Incubeer de buis gedurende 90 minuten bij 30 ° C.
  3. Voeg het vereiste volume (~ 12 µL) van de tweede reactie mix aan de buis.
  4. Incubeer de buis voor een extra 90 min bij 30 ° C.
  5. 1.1 aantal milliliters SM buffer toevoegen aan de buis.
    Opmerking: 1 mL van deze oplossing (dat wil zeggen, verpakking reactiemengsel) zal worden gebruikt voor het screenen van λ cII-mutanten. De rest zal worden gebruikt voor titering.
    1. Bereid SM buffer door het mengen van 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL 1 M Tris-HCl (pH 7.5) en 5 mL 2% (g/v) gelatine. DH2O toevoegen aan een eindvolume van 1 liter, autoclaaf voor 30 min. winkel bij kamertemperatuur voor tot 1 jaar.
  6. Vortex de buis met de verpakte DNA-monster voor 10 s bij RT (krachtige vortexing).
  7. Pols draaien de buis in een microcentrifuge en winkel op ijs tot klaar voor gebruik. Als het monster niet worden gebruikt binnen dezelfde dag van verpakking gaat, voeg 50 µL van chloroform per mL verpakt DNA monster, vortex zachtjes, en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.

3. voorbereiding van de E. coli G1250 bacteriecultuur

  1. Ten minste twee dagen vóór de beplating, maak een paar platen van bacteriële streak van Escherichia coli (E. coli) G1250 op TB1-kanamycine agar platen.
    1. TB1-kanamycine agar platen als volgt voorbereiden. Meng 5.0 g 12.0 g NaCl en 10,0 g caseïne-pepton-agar. 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride toevoegen. Breng pH op 7.0 met NaOH of HCl. toevoegen dH2O tot een eindvolume van 1 liter.
    2. Meng goed en autoclaaf voor 30 min. toestaan afkoelen tot 55 ° C. Voeg 50.0 mg kanamycine en meng. Giet in petrischalen steriel 100 mm (20-25 mL per schotel). Opslaan platen bij 4 ° C voor maximaal twee weken.
  2. Incubeer de platen van de bacteriële streak in een incubator stationaire 30 ° C gedurende ten minste 24 uur.
  3. Een dag voordat plating, combineren TB1 vloeistof 10 mL met 100 µL van 20% (m/v) maltose-1 M MgSO4 -oplossing in een steriele 50 mL schroefdop conische buis.
    1. TB1 opgietvloeistof als volgt voorbereiden. Mix 5.0 g NaCl en 10,0 g caseïne pepton, dan toevoegen van 800 mL dH2O, 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride, en breng de pH op 7.0 met NaOH of HCl. Voegt u dH2O tot een eindvolume van 1 liter, meng goed, en de autoclaaf voor 30 min. winkel het medium op RT voor maximaal drie maanden.
    2. 20% (m/v) Maltose-1 M MgSO4 als volgt voorbereiden. Meng 20,0 g Maltose en 24.6 g MgSO4. DH2O toevoegen 7H2O, vervolgens aan een eindvolume van 100 mL. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 6 maanden.
  4. Beënt de vloeistof met verschillende kolonies van de bacteriële streak plaat met behulp van een steriele inoculating lus56.
  5. Incubeer de vloeibare cultuur overnachting in een 30 ° C incubator schudden met krachtig schudden (250-300 rpm).
  6. Centrifugeer op de dag van de beplating, de conische buis met de G1250 vloeibare cultuur bij 1.500 x g gedurende 10 minuten op RT om de bacteriecellen pellet.
  7. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL 10 mM MgSO4.
  8. Meet de extinctie van een 1:10 verdunning van de celsuspensie op golflengte 600 nm met behulp van een UV-Vis spectrofotometer (bijvoorbeeld, 100 µL celsuspensie + 900 µL 10 mM MgSO4)56.
  9. Verdun de celsuspensie tot een definitieve OD600 van 0,5 met 10 mM MgSO4. De bereid schorsing van G1250, E. coli met OD600 = 0,5 wordt aangeduid als 'de G1250 plating-cultuur'.
  10. Sla de G1250 plating cultuur op ijs en gebruiken binnen 1-2 uur.

4. plating de verpakte DNA-monsters

  1. Per één verpakt DNA-monster, bereiden zestien steriele 14 x 100 mm2 ronde onderkant buizen en zestien TB1 agar platen. Tien uit elke verzameling zal worden gebruikt voor de screening en zes voor titering (drie voor Titer 20) en drie voor Titer 100.
    1. TB1 agar platen als volgt voorbereiden. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g caseïne pepton en 12.0 g Agar, vervolgens toevoegen 800 mL dH2O en 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride. Breng de pH op 7.0 met NaOH of HCl en dH2O toevoegen aan een eindvolume van 1 L.
    2. Meng goed en autoclaaf voor 30 min. laat het mengsel afkoelen tot 55 ° C, dan giet het in steriele 100 mm petrischalen (20-25 mL per schotel). Bewaar de platen bij 4 ° C voor maximaal twee weken.
      Opmerking: TB1 agar platen moeten bereid zijn ten minste 24 uur vóór gebruik.
  2. Aliquot 200 µL van de cultuur van de beplating G1250 in elke ronde-onderkant-buis.
  3. Voor titering, vul een verdunning van de 1:100 van het verpakte DNA-monster en meng goed door de vortexing (dat wil zeggen, 10 µL verpakt DNA-monster + 990 µL SM buffer).
  4. Voeg 20 µL van de verdunning 1:100 aan elk van de drie Titer 20 buizen.
  5. Voeg 100 µL van de verdunning 1:100 aan elk van de drie Titer 100 buizen.
  6. Voor screening, voeg 100 µL van de 'onverdund ' verpakt DNA-monster aan elk van de tien screening buizen.
  7. Verwerken van alle titering en screening buizen (2 x 3 + 10 = 16 buizen), als volgt: Meng goed door de vortexing voor ongeveer 10 s, en vervolgens uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten wilt toestaan dat de host E. coli te adsorberen de bacteriofagen.
  8. Toevoegen van 2.5 mL magnetron gesmolten TB1 agar (gekoeld tot 55 ° C) van boven naar elke titer of screening buis, onmiddellijk meng door vortexing (zachtjes), en gieten in de passende titer of screening TB1 agar platen.
    1. De bovenste agar TB1 als volgt voorbereiden. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g caseïne pepton en 7.0 g Agar, 800 mL dH2O. Add 1 mL 0,1% Thiamine hydrochloride toevoegen, vervolgens op pH 7.0 met NaOH of HCl. Tot slot wil dH2O een eindvolume van 1 liter.
    2. Meng goed en autoclaaf voor 20-25 min. winkel bij kamertemperatuur voor maximaal drie maanden.
    3. Voorafgaand aan het gebruik, de bereid TB1 top agar in een magnetron te smelten, meng goed en laat afkoelen tot 55 ° C in een waterbad.
      Opmerking: De gesmolten en gekoeld TB1 bovenkant wordt toegevoegd aan de inhoud van elke titer of screening buis, en na mengen wordt gegoten in de passende titer of screening TB1 agar platen.
  9. Laat de platen staan gedurende 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur, met het deksel kier om condensatie te voorkomen.
  10. Omkeren van de platen en plaats van de tien screening platen in een stationaire 24 ° C incubator en incubeer gedurende 46-48 h (d.w.z., selectieve voorwaarden) en de zes titer platen in een stationaire 37 ° C incubator en incubeer gedurende 24u/overnachting (dat wil zeggen, niet-selectieve voorwaarden).
    Opmerking: Voor quality assurance en standaardisatie van resultaten, verkrijgbare besturingsoplossingen faag met een mengsel van wildtype en mutant cII met bekende mutantfrequentie zijn vergulde naast de verpakte DNA-monsters en opgenomen in alle assay loopt56.

5. het onderzoek van de Titer en platen Screening om te bepalen van de cII Mutant frequentie

  1. Na de 24 h/overnachting incubatie bij 37 ° C, tellen het aantal plaques gevormd in elk van de drie Titer 20 platen en de Titer-100 platen. Als u wilt meer gemakkelijk identificeren de plaques, houd de plaat naast een witte lichtbak en tegen een donkere achtergrond met deksel verwijderd (Zie Figuur 2).
  2. Make een gemiddelde van het aantal plaques geteld in elke set Titer 20 platen en Titer 100 platen (triplicate, elk).
  3. Kies het gemiddelde aantal uit de set van titer platen die zich het dichtst bij het bereik van 50 tot 200 platen per plaat set valt.
  4. Het totale aantal plaques vertoond in de tien screening platen als volgt berekenen:
    Total plaques gescreend = (gemiddelde aantal plaques in de gekozen set van titer platen ÷ aantal µL van verdunning per gekozen titer plaat gebruikt) x verdunningsfactor x aantal µL van verpakte DNA-monster per screening plate [100 µL/plaat] x aantal screening platen [10].
    Opmerking: bijvoorbeeld, als het gemiddelde aantal platen per plaat in de set van Titer 20 platen 128 is en het bijbehorende nummer in de reeks van de Titer 100 platen 478 is, het nummer 128 zal worden gebruikt voor de berekening van het totale aantal plaques gescreend , als volgt:
    (128 ÷ 20) x 100 [verdunningsfactor] x 100 [µL/plaat] x 10 [platen] = 640,000
    Dit is gelijk aan het gemiddelde aantal plaques te vermenigvuldigen met 5000 of 1000, als het gemiddelde aantal is gebaseerd op de graven van de Titer 20 platen of Titer 100 platen, respectievelijk.
  5. Na 46-48 h incubatie bij 24 ° C, count het totale aantal plaques gevormd in de platen van de tien screening (volg de instructies in hoofdstuk 5.1).
    Opmerking: De cII mutantfrequentie wordt berekend door het totale aantal plaques gevormd in de screening platen door het totale aantal plaques gescreend. Met behulp van het bovenstaande voorbeeld, indien het totale aantal plaques geteld in de tien screening-platen is 112, de cII mutantfrequentie voor dit DNA-monster zou 112 ÷ 640,000 = 17,5 x 10-5.

6. verificatie van de Putative λ cII mutanten, PCR versterking en DNA Sequencing

  1. Kern van de plaque in kwestie met een steriele, wide-boring Pipetteer tip en verdrijven het (door op en neer pipetteren) in een buis van de steriele microcentrifuge met 500 µL van steriele SM buffer.
  2. Incubeer gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of bij 4 ° C's nachts, zodat de phage deeltjes te elueren van de agar sluit.
  3. In een steriele 14 x 100 mm2 ronde onderkant buis, meng 200 µL van de cultuur van de beplating G1250 met 1 µL van de gevulde faag-oplossing, en incubeer gedurende 30 min op RT.
  4. Plaat van het monster met behulp van 2.5 mL 55 ° C gesmolten TB1 top agar en Incubeer de plaat bij 24 ° C gedurende 46-48 h (selectieve voorwaarden), zoals beschreven in secties 4.8 – 4.10.
  5. Nadat u de secundaire plaques hebben gevormd, met een pipet tip zorgvuldig kiezen een enkele goed geïsoleerde geverifieerde λ cII-mutant plaque (raak de lagere agar).
    Opmerking: De vermeende cII mutant plaques Replating dient twee doeleinden: (i) plating artefacten kan soms worden verward klein-formaat platen; en (ii) een agarose kern ontleend aan een screening plaat niet-mutant phage(s) samen met een mutant bacteriofaag kan bevatten. Secundaire plaques van een lage dichtheid replating zal voorzien in een niet-verontreinigde mutant sjabloon PCR en latere DNA sequentieanalyse.
  6. De plaquette overbrengen in een microcentrifuge buis 25 µL tweemaal gedestilleerd water bevattende pipetteren omhoog en omlaag.
  7. Plaats de buis in kokend water gedurende 5 minuten.
  8. Centrifugeer bij maximumsnelheid (18.000 x g) gedurende 3 minuten op RT.
  9. 10 µL van het supernatans dat onmiddellijk overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis met 40 µL van een PCR mastermix waarin de eindconcentraties van de reagentia zijn 1 x Taq PCR buffer, 10 pmol elk van de voorwaartse en omgekeerde inleidingen, 12,5 nmol van elke dNTP , en 2.5 U van Taq polymerase van DNA.
    Opmerking: De voorwaartse en omgekeerde inleidingen zijn als volgt: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (posities-68 tot -50 ten opzichte van de cII start codon) en 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (standpunten +345 aan +365 ten opzichte van de cII start codon), respectievelijk.
  10. Versterken van de sjabloon met behulp van de volgende fietsen parameters: een 3 min denaturatie bij 95 ° C, gevolgd door 30 cycli van 30 bij 95 ° C, 1 minuut bij 60 ° C, s en 1 min bij 72 ° C, met een definitieve verlenging van 10 minuten bij 72 ° C.
  11. Zuiveren het 432 bp PCR product met de cII -gen en flankerende gebieden met behulp van commercieel beschikbare PCR reiniging kits, volgens de instructies van de fabrikant.
  12. DNA sequencing met behulp van een platform van de juiste volgorde uitvoeren en analyseren van de resulterende DNA-sequenties te sporen van mutaties in de cII transgenic (Zie de onderstaande opmerking).
    Opmerking: Dit wordt best bereikt door uitlijning met de verwijzing cII volgorde met behulp van software, zoals de web gebaseerde T-Coffee reeks uitlijning server. Voor instructies over hoe het programma te gebruiken, bezoek: http://tcoffee.crg.cat/

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Afhankelijk van de Gegevensdistributie, worden parametrische of niet-parametrische tests gebruikt om te bepalen van de significantie van het verschil in de cII -mutantfrequentie tussen behandeling en controlegroepen (d.w.z., geïnduceerde versus spontane mutant frequenties) . Vergelijking van de frequenties geïnduceerde cII mutant over verschillende behandelgroepen is gemaakt door diverse (paarsgewijze) statistische toetsen, naargelang van toepassing. De hypergeo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De λ Select cII bepaling wordt gebruikt voor de detectie van mutaties in de cII transgenic verhaald aan de genomic DNA van cellen uit organen/weefsels van BB knaagdieren3verkregen. Het genoom van deze transgene dieren bevat meerdere exemplaren van de tandem van de shuttle-vector inplanten geïntegreerde λLIZ, die de cII draagt (294 bp) en lacI (1.080 bp) transgenen, als het vogelgriepvirus reporter genen1, 2

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen erkennen van de bijdragen van alle collega's en medewerkers aan onze oorspronkelijke studies, waarvan de resultaten naar zijn verwezen in dit manuscript (ter illustratie). De auteurs werk wordt ondersteund door subsidies van het nationale Instituut van tand- en craniofaciale onderzoek van de National Institutes of Health (1R01DE026043) aan AB en aan de University of California Tobacco-Related Disease Research Program aan AB) TRDRP-26IR-0015) en de ST (TRDRP-25IP-0001). De sponsors van de studie had geen rol in de studie ontwerp, dataverzameling, data-analyse, data interpretatie, schrijven van het verslag, of in het besluit tot het indienen voor publicatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgarMO Bio Laboratories, Inc.12112-05Bacteriologisch graad
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermo Fisher Scientific4337455Geen
Caseïne PeptonAlfa AesarH26557Geen
GelatineJ. T. Baker2124-01Poeder
GlycerolFisher ScientificBP 229-1 / M-13750Geen
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500Geen
QIAquick PCR-zuiveringskitQiagen810450 PCR-zuiveringsreacties
Natriumacetaat TrihydraatFisher ScientificM-15756Geen
Taq5000 DNA Polymerase Qiagen201207Geen
Thiamine HydrochlorideMacron Fine Chemicals2722-57Geen
Transpack Packaging ExtractStratagene Corp., Overgenomen door BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.20022350 verpakkingsreacties
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4Geen
TryptonBiosciencesRC-110Geen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828(2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116(2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lambda Select cII mutatieassayisolatie van genomisch DNAherstel van lambda shuttlevectorverpakking van bacteriofageninfectie van gasthebacteri nselectieve kweekscoring van cII mutantenDNA sequentieanalysemutageniteitstestentransgene knaagdiercellen

Gerelateerde artikelen