Methodenartikel

Isolatie en karakterisatie van extracellulaire blaasjes van volwassen Schistosoma japonicum

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57514

⸱

22 mei 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, 2Tianjin Agricultural University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om te beschrijven van extracellulaire blaasjes (EVs) isolatie in in vitro gekweekte medium uit volwassen Schistosoma japonicum.

Samenvatting

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn membraanachtig blaasjes uitgebracht door een aantal van de cellen in de extracellulaire communicatie. EVW vertegenwoordigen een bevolking van heterogene blaasjes, waarvan groottewaaier tussen 40 en 1000 nm. Geaccumuleerde bewijs aangegeven dat EVs spelen een belangrijke regelgevende rol in pathogene agens-gastheer interacties. Een diep begrip van Schistosoma EVW moet inzicht verwerven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de Schistosoma-gastheer interacties, ontwikkeling van nieuwe strategieën tegen schistosomiasis. Hier, streven wij naar verdere studie EVs functies in schistosomes door de presentatie van een protocol voor de isolatie en de karakterisering van het EVW van volwassen Schistosoma japonicum (S. japonicum). EVW werden geïsoleerd van in vitro cultuur medium gebruik van centrifugeren gecombineerd met een commerciële exosome isolatie kit. De geïsoleerde S. japonicum EVs (SjEVs) doorgaans bezitten een diameter van 100-400 nm en worden gekenmerkt door transmissie elektronische microscopie en het westelijke bevlekken. Het gebruik van PKH67 kleurstof-geëtiketteerden SjEVs heeft aangetoond dat SjEVs door de ontvangende cellen zijn geïnternaliseerd. Over het geheel genomen biedt onze protocol een alternatieve methode voor het isoleren van EVs van volwassen schistosomes; de geïsoleerde SjEVs mogelijk geschikt voor functionele analyse.

Inleiding

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn een bevolking van kleine membraan-gebonden blaasjes ingekapseld en verschillende eiwitten, lipiden, nucleïnezuren. Recente studies aangetoond dat de EVs een cruciale rol in de cel-cel communicatie, en betrokken bij de regulering van tal van fysiologische processen zijn, met inbegrip van cel ontwikkeling, immuunregulatie, angiogenese en cel migratie2, 3,4,5. Vergaren van bewijs geeft aan dat de EVs, circulerende exosomes, en hun lading miRNA mogelijke biomarkers voor bepaalde ziekten6vertegenwoordigt.

Verschillende protozoa zoals Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzien Leishmania spp., hebben aangetoond te kunnen afscheiden van EVs; wormen zijn bovendien bevonden om afscheiden van EVW in levende gastheren7. Betrokken te worden bij de handhaving van de infectie, pathogeniteit8en9van de immuunregulatie is parasitaire EVs gebleken. De nieuwste studies in schistosomes beide Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 en S. japonicum12 hebben aangegeven dat volwassen schistosomes afscheiden exosome-achtige blaasjes die mogelijk deelnemen aan de functionele voorschriften van specifieke biologische processen.

Tot op heden, zijn verschillende methoden gebruikt om extracellulaire blaasjes, zoals ultracentrifugatie, ultrafiltratie13, het gebruik van polymeer gebaseerde reagentia, grootte-uitsluiting chromatografie en immunoaffinity isolatie isoleren. Deze verschillende methoden beschikken over hun eigen voordelen en beperkingen14. In het algemeen ultracentrifugatie wordt beschouwd als de gouden standaard methode om vesikel te isoleren. Deze methode is echter lijden van de beperking van mogelijke EV aggregatie14.

In schistosomes, een paar methoden zijn gemeld voor EV isolatie: deze omvatten ultracentrifugatie11,12,10 en het gebruik van commerciële EV isolatie kit16 voor verschillende stadia (eieren16, schistosomula11, volwassen schistosomes10,12,17). Gezien het feit dat microvesicles van een breed scala van grootte variërend van enkele honderden nanometer duizend nanometer, ontwikkelden we een alternatieve methode die met het gebruik van Bank centrifuge, ultrafiltratie en een commerciële EV isolatie kit combineert te isoleren van de EVs uit volwassen Schistosoma japonicum. De geïsoleerde EVs meestal bezat een diameter van 100-400 nm en met succes door de ontvangende cellen waren geïnternaliseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de lokale ethische commissie van Shanghai veterinaire Research Institute, Chinese Academie van landbouwwetenschappen (toestaan nummer: SHVRIAU-14-0101).

1. in Vitro cultuur van Schistosomes

Opmerking: Schistosomes vertegenwoordigen een biohazard. Werknemers moeten het dragen van latex handschoenen helemaal tijden wanneer behandeling van wormen, schistosomal schorsingen of andere biologische materialen aanverwante. Nieuw-Zeeland konijnen waren besmet met ~ 2.000 cercariae via abdominale blootstelling. Schistosomes in de lever stadium werden verzameld uit konijnen die zijn besmet met S. japonicum cercariae op 28 dagen na infectie door perfusie van de lever en de lymfklieren aders. De procedures van worm collectie hebben aangeroepen in eerdere publicaties rapportage studies in muizen18.

  1. Verzamelen van parasieten in een bekerglas van 500 mL. Was ze grondig en voorzichtig 3 x met 200 mL voorverwarmd (37 ° C) PBS (pH 7.4).
  2. Aparte ~ 200 worm paren voor elke petrischaal 90 mm. Daarna wassen de parasieten grondig en voorzichtig 2 x met 50 mL voorverwarmd (37 ° C) RPMI-1640 kweekmedium dat 100 U van penicilline en 100 mg/mL streptomycine.
  3. Handhaven van parasieten in voorverwarmde RPMI-1640-kweekmedium zonder antibiotica bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 bij een dichtheid van ~ 5 worm paren /mL voor 2 h in 90 mm Petri schotel 40 mL.
    Notities: Het RPMI 1640-medium mag geen serum bevatten, anders exogene extracellulaire vesikel zal worden ingevoerd.

2. pre-behandelde voorwaarde Media

  1. Verzamel het kweekmedium en centrifugeer dan het medium bij 4 ° C bij 2.000 × g gedurende 30 min tegmental puin worm te verwijderen van de eieren.
  2. Het supernatant overbrengen in een verse buis en filtert vervolgens de oplossing met behulp van een filter van de spuit 0,22 µm.
  3. Verzamelen van de gefilterde oplossing in een dialyzed zak (moleculair gewicht cut-off: 3.5kD) en klik vervolgens dialyze de oplossing om met 8% PEG8000-oplossing bij 4 ° C's nachts.
    Notities: Deze stap is belangrijk voor de verrijking van SjEVs voor het verhogen van het rendement van de SjEVs isolatie.

3. isolatie van SjEVs

  1. Breng de dialyzed oplossing over in een nieuwe buis en voeg vervolgens 0.5 volumes van het totale exosome isolatie reagens.
  2. Meng de oplossing goed door de vortexing of op en neer pipetteren teneinde homogeniteit van de oplossing te waarborgen.
  3. Incubeer het mengsel bij 2 ° C tot 8 ° C's nachts.
  4. Centrifugeer het mengsel bij 15.000 × g gedurende 1 uur bij 2 ° C tot 8 ° C.
  5. Gecombineerd en verwijder het supernatant.
    Notities: EVW bevinden zich in de pellet aan de onderkant van de buis (niet zichtbaar in de meeste gevallen).
  6. Resuspendeer de pellet EVs in 2 mL PBS en sla de EVs-oplossing bij-80 ° C tot verdere analyse.

4. karakterisering van het EVW door het westelijke bevlekken

  1. Bepaal de eiwitconcentratie van het SjEVs monster, bijvoorbeeld door BCA assay.
  2. 10-20 µg van het EVW in 22.5 µL RIPA buffer voor te bereiden. Voeg vervolgens 7,5 µL van 4 x laden buffer en warmte gedurende 5 minuten bij 95 ° C.
  3. Afzonderlijke SjEVs proteïnen door 12% SDS-pagina gel.
  4. Breng de eiwitten aan Membraan PVDF en vervolgens sonde met anti-CD63 antilichamen (1:1, 000 verdunning), gevolgd door het sonderen met anti-konijn IgG-HRP (1:5, 000 verdunning).
  5. Gebruik van ECL detectie reagens voor membraan ontwikkeling en detecteren de signalen door een chemiluminescentie imaging systeem.

5. de karakterisering van het EVW door transmissie-elektronenmicroscopie

  1. Voeg 2 µL van geïsoleerde SjEVs tot 200 mesh formvar beklede rasters en dan laat ze drogen bij kamertemperatuur.
  2. Vlek met 2% Phosphotungstic zuur voor 1 min en vervolgens laat ze drogen bij kamertemperatuur.
  3. De rasters op de monsterhouder van de transmissie-elektronenmicroscoop laden en blootgesteld aan een 80 kV elektronenstraal voor beeldopname.

6. SjEVs Label met PKH67 en cel opname Assay

Notities: Alle volgende stappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur (20-25 ° C), tenzij anders aangegeven.

  1. Pipetteer 5 µg SjEVs oplossing in een conische bodem polypropyleen buis en pas het volume aan 12 mL door RPMI 1640 medium toe te voegen.
  2. Centrifugeer het SjEVs bij 110.000 × g gedurende 90 min bij 4 ° C om SjEVs pellet.
  3. Na het centrifugeren, moet u zorgvuldig de bovendrijvende substantie gecombineerd.
    Opmerking: De PKH67 ethanolbevattend kleurstof moet niet worden toegevoegd direct naar de SjEV pellet, aangezien dit in heterogene kleuring en verminderde levensvatbaarheid resulteren zou.
  4. Bereid een 2 x EV schorsing oplossing door toevoeging van 1 mL verdunningsmiddel C naar de SjEV pellet; om ervoor te zorgen volledige dispersie, resuspendeer met zachte pipetteren.
  5. Net voordat hij kleuring in verdunningsmiddel C, stelt u een vers 2 x kleurstof oplossing door toevoeging van 2 µL van de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing aan 1 mL verdunningsmiddel C in een centrifugebuis polypropyleen en vermenging goed te verspreiden.
  6. Voeg snel de 1 mL 2 x EV schorsing (stap 6.4) 1 ml 2 x kleurstof oplossing (stap 6.5) en onmiddellijk meng het monster door pipetteren.
  7. Laat het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten inwerken.
  8. Stop de kleuring door toevoeging van 4 mL FBS en vervolgens Incubeer gedurende 1 minuut.
  9. Toevoegen RPMI1640 medium om het volume aan 12 mL en vervolgens Centrifugeer bij 110.000 × g bij 4 ° C voor 90 min.
  10. Verwijder het supernatant en RPMI1640 medium om resuspendeer de PKH67 met het label SjEV pellets toevoegen.
  11. Centrifugeer bij 110.000 × g bij 4 ° C voor 90 min te wassen eenmaal en voegt u PBS om resuspendeer de SjEVs pellets.

7. SjEVs-Cell opname Assay

  1. Zaad zoogdiercellen zoals NCTC kloon 1469 cellen of HEK293T cellen in 6-Wells-platen (2 × 105 cellen per putje) en 's nachts de cellen cultuur.
  2. Voeg 5 µg SjEVs PKH67-geëtiketteerd en vervolgens cultuur cellen bij 37 ° C gedurende 2-4 uur.
  3. Na incubatie het medium verwijderen en de cellen met PBS tweemaal wassen.
  4. Herstellen van de cellen met de 4% formaldehyde oplossing gedurende 15 minuten en twee keer meer met PBS gewassen.
  5. Vlek celkernen met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  6. Observeer de cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te kwantificeren van de opbrengst van geïsoleerde SjEVs met behulp van de beschreven protocol, gebruikt wij BCA eiwit assay voor toegang tot de eiwitconcentratie van de geïsoleerde SjEVs van 28-daagse volwassen schistosomes. Zoals blijkt uit tabel 1, varieerde de eiwitconcentratie SjEV 208 µg tot 250 µg per 100 mL medium (tabel 1). De grootte van de deeltjes, zoals bepaald door de Malvern nanoparticle analyse, vermeld dat de geïsoleerde SjEVs van 100 v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Recente studies over EVs hebben aangetoond dat Schistosoma die EVS een belangrijke rol in9,12,16, gastheer-pathogeen interacties3,spelen. Naar verdere adres hun regelgevende taken, is het essentieel om te isoleren van EVs van schistosomes. Hier beschrijven we een alternatieve methode om SjEV te isoleren. Deze methode levert de omvang van een breed scala van SjEVs, van 100 nm tot 400 nm, in volw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie was, gedeeltelijk of in zijn geheel, ondersteund door nationale Natural Science Foundation van China (31472187 en 31672550) en de landbouwkunde en het programma van de innovatie van de technologie van de Chinese Academie van landbouwwetenschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal
Total Exosome Isolation Reagent (van celkweekmedium)ThermoFisher SCIENTIFIC4478359Voor het isoleren van S. japonicum extracellulaire vesikels
PKH67Sigma-aldrichMINI67Voor het labelen van EV's
RPMI 1640 MediumThermoFisher SCIENTIFIC11875119Voor parasietcultuur
Penicilline-StreptomycineThermoFisher SCIENTIFIC15140122
0,22 μm spuitfilterMerckSLGP033RB
SnakeSkin dialyseslangThermo SCIENTIFIC68035
PEG8000Sangon BiotechA100159 
RIPABeyotimeP0013B
EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substraat (ECL)Fisher scientificWBKLS0100 
DAPICell Signaling Technology4083
BCA-kitBeyotimeP0010
CD63-antilichamenSangon BiotechD160973-0025
PVDFBio-Rad1704273
Formvar/Carbon 400 meshTed Pella01754-F
FosfowolfraamzuurTed Pella19402
anti-muis IgG-HRPCWBIOCW0102
NCTC clone 1469 cellenATCCATCC® CCL-9.1™
FBSHyCloneSV30087.02
Apparatuur
GE chemoluminescentie beeldvormingssysteemGEImageQuant LAS4000mini
Transmissie-elektronenmicroscopieHitachiH-7600
Milli-Q waterMilli-QMilli-Q Elix
Eppendor Centrifuge EppendorfCentrifuge 5804R
ZetaSizer NanoMalvernZetaSizer Nano ZS 
UltracentrifugeBeckmanOptima L-100 XP Ultracentrifuge
IncubatorESCOCCL-107B
MicroscoopZeissZeiss Axio Observer Z1

Referenties

  1. Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
  2. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  3. Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175(2017).
  4. Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
  5. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  6. Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
  7. Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040(2014).
  8. Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
  9. Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488(2014).
  10. Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
  11. Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665(2015).
  12. Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
  13. Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
  14. Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
  15. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  16. Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574(2016).
  17. Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885(2016).
  18. Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 11(2001).
  19. Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EV isolatieexosoom isolatiekittransmissie elektronenmicroscopieWestern blotCD63 antilichaamPKH67 kleurstofnanodeeltjesanalysecelopname assay

Gerelateerde artikelen