Methodenartikel

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

7.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

30 april 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Samenvatting

De geclusterde regelmatig afgewisseld palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR - geassocieerde proteïne 9 (Cas9) prokaryote adaptieve immuunsysteem verdedigingssysteem is gecoöpteerd als een krachtig hulpmiddel voor precieze eukaryotische genoom engineering. Hier presenteren we een snelle en eenvoudige methode met behulp van chimeer één gids RNAs (sgRNA) en CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) voor de efficiënte en nauwkeurige generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. We beschrijven een pijpleiding voor sgRNA-doelverschuiving sjabloonontwerp homologie geleide reparatie (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie waarmee de robuuste en snelle identificatie van correct bewerkte dieren. Onze aanpak niet alleen toelaat de facile generatie en de identificatie van de gewenste genomic punt mutant dieren, maar ook vergemakkelijkt de opsporing van andere complexe indel allelen in ongeveer 4-5 dagen met hoog rendement en een verminderde screening werklast.

Inleiding

Recente technologische vooruitgang hebben radicaal getransformeerd en versnelde de mogelijkheid om precies ingenieur genomen. Met name is de CRISPR-Cas9-systeem, dat gebaseerd op de endonuclease van RNA-geleide Cas9 is voor het opwekken van een dubbele streng pauze (DSB) in de buurt van de opeenvolging van de doelgroep van belang, uitgebreid gebruikt voor het nauwkeurig ingenieur het genoom van de meerderheid van de modelorganismen gebruikt in biomedisch onderzoek1,2,3,4. Aanzienlijk, heeft het gebruik van CRISPR-Cas9 ontgrendeld genoom bewerken zelfs in moeilijke soorten zoals C. elegans5. Ongeacht soort, genereren van puntmutaties met het genoom van de CRISPR-Cas9 gebaseerd editing systeem berust op drie componenten van de kern: 1) Cas9 endonuclease, 2) een enkele gids-RNA (sgRNA) die de endonuclease van de Cas9 aan een reeks van doel, en 3) een gebruiker ontworpen leidt homologie geleide reparatie (HDR)-sjabloon met de gewenste edit(s) van belang2.

Er zijn verschillende methoden die kunnen worden gebruikt om de targeting sgRNA en Cas9 in cellen, met inbegrip van de plasmide, RNA en virale gebaseerde levering methoden6nuclease. Onlangs, directe levering van pre-complexvorm sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) heeft ontpopt als een krachtig en efficiënt hulpmiddel in CRISPR-Cas9-gebaseerde genoom7bewerken. De directe levering van pre-complexvorm CRISPR-Cas9 RNPs heeft verschillende duidelijke voordelen, namelijk: 1) RNPs omzeilen de noodzaak voor cellulaire transcriptie en vertaling, 2) RNPs zijn snel gewist, specificiteit kunnen verhogen door vermindering van de beschikbare tijd voor af-target decolleté, en 3) RNPs bevatten geen buitenlandse DNA/RNA-elementen die de introductie van uitheemse sequenties in het genoom van de host door middel van willekeurige integratie omzeilt. Samen bieden deze kenmerken waarschijnlijk een kortstondige uitbarsting van aan-target CRISPR bewerken terwijl het minimaliseren van uit-target effecten.

Beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de invoering van site-specific genomic veranderingen in C. elegans. Dit protocol omvat gericht op sgRNA en één gestrande oligonucleotide (ssODN) HDR sjabloonontwerp, sgRNA-Cas9 RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie voor de ondubbelzinnige identificatie van goed bewerkte dieren. Met behulp van deze strategie, niet alleen kunnen de gewenste specifieke wijzigingen worden hersteld, maar andere niet-specifieke indel mutaties kunnen ook worden teruggevorderd. Dus onze strategie toelaat de generatie van een allèlique reeks met behulp van één enkele strategie, waar zowel mono-allèlique, bi-allèlique en indel mutanten kunnen worden gegenereerd op de F1 generatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierenverzorgers en experimentele procedures gevolgd het richtsnoer van het National Institutes of Health en de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan. Gebruik RNase-vrije oplossingen en Pipetteer tips in het gehele protocol. Reinig het werkgebied, pipetten, buizen en centrifuge met RNase decontaminatie oplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant (Zie Materialen tabel).

1. sgRNA-doelverschuiving

  1. Met behulp van een webbrowser, opent u de webpagina: http://crispor.tefor.net8
    1. Ingang ~ 60 basenparen (bp) van reeks begeleidende de gewenste bewerking van belang (d.w.z. 30 bp 5' en 3' voor gewenste edit).
    2. Selecteer het genoom Caenorhabditis elegans in het pulldown menu.
    3. Selecteer het Protospacer naast motief (HF1-20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9, eSPCas9 1.1) in het pulldown menu.
    4. Klik op verzenden. Kies de hoogste gerangschikte doel volgorde dichtst bij het bewerken van belang in de resultatenpagina. Als er geen geschikt doel binnen de begeleidende 60 bp input sequentie zijn, vouwt u de query-reeks tot 100 bp (d.w.z. 50 bp aan weerszijden van de gewenste bewerken).
  2. Verkrijgen van een beschikbaar bron, bijvoorbeeld synthego, een 20-mer doel sgRNA met de volgende specificaties: 3 nmol; geen wijzigingen.
  3. Na ontvangst, centrifugeer gelyofiliseerd sgRNA buis op met > 12.000 x g voor 1 minuut bij kamertemperatuur. 60 µL voor nuclease-gratis TE toevoegen aan de buis, en zachtjes resuspendeer door pipetteren naar boven en beneden de 15 - 20 keer met behulp van een precisiepipet van P200. De eindconcentratie is 50 µM.

2. een door de homologie geleide reparatie sjabloonontwerp

  1. Ontwerp een ssODN HDR sjabloon, bevattende: 1) de mutatie van belang, 2) een unieke in-frame beperking endonuclease site, 3) een stille mutatie van een of beide van de Gs binnen de NGG PAM-reeks, en 4) 50 bp 5' en 3' homologie armen flankerend de eerste en laatste mutatie. (Figuur 1 c) 9 , 10.
    1. Als de mutatie van de sequentie NGG PAM niet mogelijk is, voeren 5-6 stille mutaties binnen de sgRNA doel erkenning volgorde om te voorkomen dat sgRNA-gemedieerde splitsing van de ssODN HDR-sjabloon.
  2. Vanuit een beschikbare bron, bijvoorbeeld idtdna, een "Ultramer DNA oligonucleotide" te verkrijgen met de volgende parameters: schaal: 4 nmol; Formulering: None; Zuivering: Standaard ontzouten.
  3. Na ontvangst, centrifugeer gelyofiliseerd ssODN buis op met > 12.000 x g voor 1 minuut bij kamertemperatuur. Zachtjes resuspendeer ssODN om een eindconcentratie van 100 µM in nuclease-vrije ddH2O door pipetteren naar boven en beneden de 15 - 20 keer met behulp van een precisiepipet van P200.

3. ontwerp-genotypering Primers

  1. Ontwerp een begeleidende de genoom wijziging instellen voor het genereren van een ~ 400-700 bp PCR amplicon11primer.
  2. Optimaliseren van PCR fietsen voorwaarden voor de productie van een interne en specifieke amplicon11.

4. bereid injectie Mix

  1. Centrifugeer tabel 1 reagentia op maximale snelheid gedurende 2 minuten bij 4 ° C.
  2. In de aangegeven volgorde, aan een PCR nuclease-gratis buis met toevoegen van tabel 1 reagentia.
  3. Meng door zachtjes op en neer 10 keer met een pipet P20 pipetteren.
  4. Injectie mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.

5. injectie Protocol

  1. Injectie micropipet met ongeveer de helft van de injectie mix12laden. Sla de resterende injectie mix in het geval de injectie naald klompen of breekt.
  2. Breken micropipet uiteinde zodat ~ 20-30 psi een geleidelijke vloeiende oplossing12 produceert.
    Opmerking: Grotere diameter tips negatief van invloed zijn op de gezondheid van dieren en verlagen F1 nakomelingen opbrengst.
  3. Injecteren van 10-15 jonge volwassen wormen in beide gonadale armen indien mogelijk12. Als dat niet het geval is, injectie in één gonadale arm is voldoende.
  4. Toestaan dat ingespoten dieren (P,0) om te herstellen voor 1-2 h bij kamertemperatuur op een 35 mm OP50-geplaatste nematode media (NGM) groeischijf. Vervolgens kies één ingespoten P0 dieren aan individuele OP50-geplaatste 35 mm NGM platen met behulp van een platina wire worm12.

6. screen P0 platen en enkele mCherry(+) F1s

  1. Twee dagen na injectie, identificeren P0 platen met F1 nakomelingen uiting van mCherry in de farynx met een fluorescerende stereomicroscoop (Figuur 1 d, dag 2 - 3). Kies drie P0 platen die de meeste mCherry(+) F1 dieren bevatten.
  2. Uit elk van de drie geselecteerde P0 platen, één 8-12 mCherry(+) F1 dieren voor een totaal van 24-36 mCherry(+) F1s met behulp van een worm halen (Figuur 1 d, dag 2 - 3).
    Opmerking: mCherry(-) dieren kunnen ook een honkslag sloeg uit deze P0 platen, maar de kans om correct te identificeren bewerkt dieren is veel lager (figuur 2A).
  3. Toestaan dat individuele F1s tot self-fertilize en leggen eieren voor 1-2 dagen bij kamertemperatuur.

7. één Worm PCR en genotypering

  1. Na 1-2 dagen voor het leggen van eieren, breng u de F1s in individuele PCR strip tube caps met 7 µL van Worm Lysis Buffer met behulp van een worm pick ( Figuur 1 d,tabel 2, dag 4-5).
  2. Centrifuge PCR buizen bij maximumsnelheid voor 1 minuut bij kamertemperatuur te brengen dieren naar de onderkant van de buis, bevriezen buizen bij-80 ° C gedurende 1 uur.
    Opmerking: Wormen kunnen worden opgeslagen bij-80 ° C voor onbepaalde tijd.
  3. Lyse van bevroren wormen in een thermocycler met behulp van het volgende programma: 60 ° C gedurende 60 minuten, 95 ° C gedurende 15 minuten, 4 ° C houdt.
  4. Set-up PCR mastermix zoals aangegeven in tabel 3.
  5. Voegt toe 21 µL van het PCR mastermix in schone PCR buizen, en vervolgens 4 µL van lysis van de worm uit stap 3. Meng goed met behulp van een precisiepipet en PCR-programma volgens de richtlijnen van de fabrikanten (Zie Materialen tabel).
  6. Zuiveren van PCR reacties met behulp van een schone DNA en concentraat kit, volgens de instructies van de fabrikant (Zie Materialen tabel). Elueer DNA door 10 µL water toe te voegen aan de kolom van de spin.
  7. Set-up restrictie-enzym mastermix zoals aangegeven in tabel 4.
  8. 10 µL van het restrictie-enzym mastermix toevoegen aan elke schoongemaakte PCR-reactie en incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 ° C13.
  9. Aparte verteerd PCR producten op een 1,5% agarose gel op 120 V met 1 x Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer14uitgevoerd.

8. identificatie en verificatie van de opeenvolging van bewerkte dieren

  1. Onderzoeken enzym verteerd monsters op de aanwezigheid van bands die wijzen op potentieel bewerkt dieren14 (Figuur 1 d, dag 4-5).
    Opmerking: Een N2-besturingselement ter identificatie van potentiële indel mutaties die kunnen worden waargenomen als verschuivingen in de band grootte en/of onverwachte en complexe restrictie-enzym spijsvertering "banding" patronen laden.
  2. Na het identificeren van potentiële bewerkte dieren, gebruik de resterende 3 µL van lysis van de worm en herhaal de PCR-reactie. Niet schoon of restrictie-enzym verteren de PCR reactie nadat het programma is voltooid. De PCR-reactie op een 1% agarose gel, afzonderlijke laden en haal de band met behulp van een gel extractie kit15 (Zie Materialen tabel).
  3. Sanger reeks16 gel geëxtraheerde DNA met behulp van de F1-primer te identificeren correct bewerkte dieren (figuur 1A)
    Opmerking: Heterozygote leest zal bevatten overlay pieken als gevolg van de aanwezigheid van de wild-type en gemanipuleerde allel.
  4. Te verkrijgen bij homozygoot dieren geverifieerde heterozygoot bewerkte dieren, één 8-12 F2 dieren stappen 7-8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Mutaties in menselijke superoxide dismutase 1 (SOD1) goed voor ~ 10-20% van de familiale Amyotrofische laterale sclerose, een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die steevast tot verlamming en dood17 leidt. Menselijke SOD-1 is een evolutionair Geconserveerde proteïne delen van 55% identiteit en 70% gelijkenis met de C. elegans SOD-1 proteïne (figuur 1B). Om aan te tonen de eenvoud, haalbaarheid en doeltreffendheid ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het CRISPR-Cas9-systeem is een krachtige en effectieve tool om het genoom van modelorganismen juist te wijzigen. Hier, we laten zien dat chimeer sgRNAs20 in combinatie met ssODN HDR sjablonen inschakelen de hoogefficiënte generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. Nog belangrijker is, we laten zien dat RNP levering bewerken hoogrenderende produceert wanneer fluorescentie wordt gebruikt als een marker co selectie, markeren het gemak en de betrouwbaarheid van de techniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Wij danken de leden van de Beg-laboratorium voor kritische lezing van dit manuscript. Stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Onderzoek in het laboratorium Beg wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS094678) and Muscular Dystrophy Association (MDA382300) naar A.A.B.

Dankbetuigingen

Er zijn geen conflicten van belang in verband met dit verslag.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.chimère sgRNA
Nuclease-free TESynthego Inc.wordt geleverd met de sgRNA kit EZ kit
Nuclease-free waterSynthego Inc.wordt geleverd met de sgRNA kit EZ kit
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728Cas9-eiwit
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Clean & ConcentratorZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel DNA Recovery KitZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinase KSigmaP2308
Glass Borosilicate Glass MicropipettesSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1.0mm. ID: 0.78mm
Trizma HydrochlorideSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
RNaseZap Decontamination SolutionFisher ScientificAM9780

Referenties

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genoommodificatie van C elegansselectie van sgRNA doelwitssODN HDR templategenotypering met restrictie enzymenfluorescente mCherry markerverificatie via Sanger sequencinghomozygote mutante dierensnelle mutatiepijplijn

Gerelateerde artikelen