Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De geclusterde regelmatig afgewisseld palindromische herhaalt (CRISPR) - CRISPR - geassocieerde proteïne 9 (Cas9) prokaryote adaptieve immuunsysteem verdedigingssysteem is gecoöpteerd als een krachtig hulpmiddel voor precieze eukaryotische genoom engineering. Hier presenteren we een snelle en eenvoudige methode met behulp van chimeer één gids RNAs (sgRNA) en CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) voor de efficiënte en nauwkeurige generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. We beschrijven een pijpleiding voor sgRNA-doelverschuiving sjabloonontwerp homologie geleide reparatie (HDR), CRISPR-Cas9-RNP complexvormers en levering en een genotypering strategie waarmee de robuuste en snelle identificatie van correct bewerkte dieren. Onze aanpak niet alleen toelaat de facile generatie en de identificatie van de gewenste genomic punt mutant dieren, maar ook vergemakkelijkt de opsporing van andere complexe indel allelen in ongeveer 4-5 dagen met hoog rendement en een verminderde screening werklast.
Inleiding
Recente technologische vooruitgang hebben radicaal getransformeerd en versnelde de mogelijkheid om precies ingenieur genomen. Met name is de CRISPR-Cas9-systeem, dat gebaseerd op de endonuclease van RNA-geleide Cas9 is voor het opwekken van een dubbele streng pauze (DSB) in de buurt van de opeenvolging van de doelgroep van belang, uitgebreid gebruikt voor het nauwkeurig ingenieur het genoom van de meerderheid van de modelorganismen gebruikt in biomedisch onderzoek1,2,3,4. Aanzienlijk, heeft het gebruik van CRISPR-Cas9 ontgrendeld genoom bewe....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierenverzorgers en experimentele procedures gevolgd het richtsnoer van het National Institutes of Health en de institutionele dier zorg en gebruik Comité (IACUC) aan de Universiteit van Michigan. Gebruik RNase-vrije oplossingen en Pipetteer tips in het gehele protocol. Reinig het werkgebied, pipetten, buizen en centrifuge met RNase decontaminatie oplossing volgens de richtlijnen van de fabrikant (Zie Materialen tabel).
1. sgRNA-doelverschuiving
- Met behulp van een webbrowser, opent u de webpagina: http://crispor.tefor.net8
- Ingang ~ 60 basenparen (bp) van reeks begeleidende de g....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Mutaties in menselijke superoxide dismutase 1 (SOD1) goed voor ~ 10-20% van de familiale Amyotrofische laterale sclerose, een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die steevast tot verlamming en dood17 leidt. Menselijke SOD-1 is een evolutionair Geconserveerde proteïne delen van 55% identiteit en 70% gelijkenis met de C. elegans SOD-1 proteïne (figuur 1B). Om aan te tonen de eenvoud, haalbaarheid en doeltreffendheid .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het CRISPR-Cas9-systeem is een krachtige en effectieve tool om het genoom van modelorganismen juist te wijzigen. Hier, we laten zien dat chimeer sgRNAs20 in combinatie met ssODN HDR sjablonen inschakelen de hoogefficiënte generatie van genomic puntmutaties in C. elegans. Nog belangrijker is, we laten zien dat RNP levering bewerken hoogrenderende produceert wanneer fluorescentie wordt gebruikt als een marker co selectie, markeren het gemak en de betrouwbaarheid van de techniek.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Wij danken de leden van de Beg-laboratorium voor kritische lezing van dit manuscript. Stammen werden verstrekt door de Caenorhabditis genetica Center, dat wordt gefinancierd door de NIH kantoor van infrastructuur onderzoeksprogramma (P40 OD010440). Onderzoek in het laboratorium Beg wordt ondersteund door subsidies van de NIH (R01 NS094678) and Muscular Dystrophy Association (MDA382300) naar A.A.B.
Dankbetuigingen
Er zijn geen conflicten van belang in verband met dit verslag.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimère sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | wordt geleverd met de sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | wordt geleverd met de sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9-eiwit |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
Referenties
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(20....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
