Methodenartikel

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

DOI:

10.3791/57519

⸱

10 mei 2018

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inleiding van de vertaling is de snelheidslimieten stap voor eiwitsynthese en vertegenwoordigt een belangrijk punt op die cellen hun productie van eiwitten regelen. Verordening voor eiwitsynthese is de sleutel tot cellulaire stress-respons, en disregulatie staat centraal in veel landen van de ziekte, zoals kanker. Bijvoorbeeld, hoewel cellulaire stress tot de remming van de globale vertaling door geluidwerende GLB-afhankelijke initiatie leidt, zijn bepaalde stressrespons eiwitten selectief vertaald in een GLB-onafhankelijke manier. Discrete RNA regelgevende elementen, zoals cellulaire interne ribosome entry sites (IRESes), toestaan voor de vertaling van deze specifieke mRNAs. Identificatie van dergelijke mRNAs, en de karakterisatie van hun regulerende mechanismen, zijn een belangrijk gebied in de moleculaire biologie. Toeprinting is een methode voor de studie van RNA structuur en functie als het gaat om de initiatie van de vertaling. Het doel van toeprinting is om te beoordelen van het vermogen van in vitro Getranscribeerd RNA tot stabiele complexen met ribosomen onder uiteenlopende omstandigheden, om te bepalen welke sequenties, structurele elementen of bijkomende factoren zijn betrokken bij ribosoom bindende — een pre-cursor voor efficiënte vertaling initiatie. Naast andere technieken, zoals de analyse van de westerse en Polysoom profielen, zorgt toeprinting voor een robuuste karakterisering van mechanismen voor de regulering van de inleiding van de vertaling.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als vertaling meest cellulaire energie verbruikt, is het zinvol dat de vertaling strak gereguleerde1 is. Omgekeerd, disregulatie van de vertaling- en de daaruit voortvloeiende wijzigingen in de uitvoer van de eiwit-wordt vaak waargenomen in stress-respons en ziekte, zoals kanker1,2. Een groot voordeel van translationeel controle is de snelheid waarmee cellen hun productie van eiwitten veranderen kunnen om te reageren op verschillende stimuli3. Vertaling verordening vormt aldus een belangrijk mechanisme die invloed op de overleving van de cel en dood1,2,3 hebben kan. Van de stappen van de vertaling is Inleiding de meeste zeer gereglementeerde en complexe3. Kort, meest eukaryotische mRNAs bevatten een 5' m7G GLB dat bijna altijd essentieel is voor de vertaling ervan. Aanvang van de GLB-afhankelijke vereist eukaryotische initiatie factoren eIF4E, eIF4A en eIF4G (de GLB-erkenning complex) om te interageren met het 5' einde van de mRNA. Het 43S preinitiation ribosoom complex, waarin eIF2-gebonden initiator tRNA en eIF3, is aangeworven aan het einde 5' van de mRNA via een interactie tussen eIF4G en eIF3. De complexe preinitiation wordt beschouwd als het scannen van mRNA, geholpen door de eIF4A (een RNA helicase) totdat de start codon (AUG) ligt. De 48S Inleiding complexe vervolgens wordt gevormd en tRNA wordt geleverd in de P-site van het ribosoom. Tot slot zijn de 60S en 40S ribosoom subeenheden Verenigd om te vormen van de complexe, 80S-inleiding gevolgd door vertaling rek1,3,4. In tegenstelling, omzeilen interne ribosome entry sites (IRESes) de eis voor een 5'-cap door de indienstneming van de subeenheid 40S ribosomal rechtstreeks naar de inleiding codon3. Fysiologische stress voorwaarden verzachten globale vertaling van mRNA als gevolg van wijzigingen van belangrijke algemene eukaryotische initiatie factoren (eIFs). Echter niet-canonieke vertaling initiatie mechanismen kunnen voor selectieve vertaling van bepaalde mRNAs die vaak stressrespons eiwitten coderen en disregulatie van niet-canonieke vertaling inleiding is betrokken bij ziekte staten zoals kanker 1 , 2. discrete RNA regelgevende elementen, zoals cellulaire IRESes, toestaan voor de vertaling van dergelijke mRNAs2,3.

Een bijzonder interessant aspect van translationeel controle is te begrijpen van de mechanismen van canonieke versus niet-canonieke vertaling van een bepaalde mRNA. Toeprinting is een techniek waarmee de mechanistische detailstudie van vertaling inleiding van specifieke RNAs in vitro. Het algemene doel van toeprinting is om te beoordelen van het vermogen van een RNA van belang om de vorming van een complex met het ribosoom onder uiteenlopende omstandigheden, vertaling-initiatie ervoor om te bepalen welke sequenties, structurele elementen of accessoire factoren zijn vereist voor het initiëren van de efficiënte vertaling. Bijvoorbeeld, misschien ribosoom werving worden belemmerd in het ontbreken van een 5'-cap maar gestimuleerd door de aanwezigheid van een IRES.

Het principe van de techniek is in vitro transcriberen een RNA van belang, het broeden in de aanwezigheid van cellulaire extracten met vertaling onderdelen (of de gezuiverde componenten) zodat de inleiding complexen te vormen en om te keren transcriberen het RNA met een specifieke primer. Stabiele complexen van RNA-ribosoom zal leiden tot omgekeerde transcriptie tot stilstand op de 3'-rand van het ribosoom-de zogenaamde 'toeprint'5,6,7.

In dit protocol, de ribosomal subeenheden, eIFs, tRNAs en IRES trans-acteren factoren (ITAFs) zijn gunstig bijgedragen door konijn Retikulocyt lysate (RRL). Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een primer fluorescently-label en fluorescentie gel gebaseerde imager, in plaats van een radiolabeled primer. Dit elimineert de extra stappen, met inbegrip van radiolabeling van de primer, evenals de gel drogen en blootstelling aan een toenemende scherm. De fluorescerende bands van gasten worden geregistreerd in real time als de gel loopt, waardoor voor grotere resolutie. Afgetopte X-gebonden remmer van apoptosis eiwit (XIAP) IRES RNA wordt gebruikt als een voorbeeld hier, hoewel afgetopte mRNAs kan ook door deze techniek8worden geanalyseerd.

In tegenstelling tot westerse analyse, die de uiteindelijke uitvoer van het vertaalproces in cel lysates meet, is toeprinting een in vitro -benadering voor het meten van de vertaling initiatie complexvorming op een RNA. Deze reductionistische aanpak zorgt voor de zeer gedetailleerde studie van substraten of factoren die vertaling initiatie regelen (bv., afgetopte of un-afgetopte mRNA, IRES structuur, aan- of afwezigheid van poly-A-staart, bepaling van specifieke proteïne factoren, enz.). Vandaar, toeprinting kunnen worden gebruikt om te bestuderen van de verschillende wijzen van vertaling8 of de effecten van mRNA structuren, zoals IRESes, op eiwit synthese9,10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opmerking: RNA is zeer gevoelig voor afbraak door ribonucleasen (RNases). Standaard voorzorgsmaatregelen nemen om de RNA intact te houden. Handschoenen vaak worden gewijzigd. Gebruik gefilterd Pipetteer tips, nuclease-gratis plasticware en chemicaliën nuclease-vrij in alle stappen van het protocol. Gebruik nuclease-vrije of diethyl-pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water voor alle oplossingen.

1. bereiding van de oplossingen

  1. Toeprinting buffer bereiden: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2.5 mM Mg(OAc)2, 5% (m/v) sacharose, 2 mM dithiothreitol (DTT) en 0,5 mM spermidine.
    1. DTT en spermidine opslaan in eenmalig gebruik aliquots bij-20 ° C tot het voorkomen van herhaalde bevriezen-ontdooien cycli.
      Opmerking: DTT en spermidine moeten worden toegevoegd aan de buffer van de toeprinting onmiddellijk vóór gebruik. Een oplossing ontbreekt DTT en spermidine kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
  2. Bereid hoeveelheden van 85 mM 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP) en 91 mM adenosinetrifosfaat (ATP). Opslaan van de aliquots bij-20 ° C.
  3. Bereiden van 450 mL van 6% polyacrylamide - 7M ureum gel mix: 67,5 mL van 40% acrylamide:bis-acrylamide (19:1), 189 g ureum, 112,5 mL 5 x FSME (Tris/boraat/thylenediaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA)) en 120 mL water. Los de ureum door opwarming van de aarde in een waterbad 37 ° C of op een hete plaat met roeren. Filtreer de oplossing (bijv., 0,2 micrometer nitrocellulose vacuüm filter).
    Opmerking: De oplossing kan worden achtergelaten bij 4 ° C gedurende ten minste één maand.
    Let op: Monomeer acrylamide is een neurotoxine dat kan worden geabsorbeerd door de huid. Neem grote zorg om te voorkomen dat contact met de huid (dwz., het dragen van handschoenen, een laboratoriumjas, en oogbescherming). Polyacrylamide moet ook voorzichtig behandeld worden, als polymerisatie kan niet overgaan tot 100% voltooid.
  4. Bereiden van formamide laden kleurstof: 95% formamide, 18 mM EDTA, 0,025% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS), 0,025% (m/v) bromophenol blauw, 0,025% (m/v) xyleen cyanol. Winkel bij-20 ° C.
  5. Los 1 nmol primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' einde-aangeduid met IRDye 800) in 100 μl van water voor een werkende concentratie van 10 pmol/l. Bewaren bij-20 ° C in eenmalig gebruik aliquots (ongeveer 10 µL), beschermd tegen licht.

2. voorbereiding van mRNA

  1. Versterken van DNA sjablonen voor de synthese van mRNA door de polymerase-kettingreactie (PCR) van passende sjablonen (dwz., genomic DNA of de plasmide DNA, voorkomend). Gebruik een hifi-polymerase van DNA volgens de instructies van de fabrikant, met de volgende voorwaarden voor reactie (35 cycli): smelten, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; uitbreiden, 72 ° C, 30 s.
    Opmerking: De voorwaartse primer (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) omvat de T7 promotor volgorde te voorzien van RNA transcriptie; de omgekeerde primer (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) omvat 51 thymine residuen een poly-A-staart voorzien de getranscribeerde RNA. Opmerking dat RNA kan ook in vitro transcriptie van plasmide DNA.
  2. Gebruik een passende transcriptie kit voor in vitro transcriberen IRES-bevattende RNA of afgetopte RNA van de DNA-sjabloon. Volg de instructies van de fabrikant. Voorbereiding van het monster RNA in standaard 20 μL reactie delen. Behandelen van de nieuw-gesynthetiseerd RNA met 2 eenheden van RNase-vrije DNase gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  3. Verdun de RNA DNase behandeld tot 110 µL met nuclease-gratis water toevoegen 110 µL zure fenol, vortex 5 s en centrifuge voor 3 min bij 20.000 x g bij kamertemperatuur. Verwijderen van 100 µL van de waterfase aan een nieuwe 1,5 mL microfuge buis, voeg 10 µL van 3 M natriumacetaat en vortex 2 s. toevoegen, 3 volumes van 100% ethanol, vortex 5 s, en neerslag van het RNA bij-20 ° C's nachts.
  4. Centrifugeer bij > 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C en negeren de bovendrijvende substantie. Wassen van de pellet met 500 µL ijskoude ethanol van 70% (v/v) en herhaal het centrifugeren. Zo veel van het supernatans dat mogelijk gecombineerd en drogen van de pellet voor 5-10 min. oppassen niet te verjagen van de pellet.
  5. Resuspendeer de RNA in de juiste hoeveelheid water nuclease-vrije opleveren van een concentratie van de werken van 0.5 μg/μL. Dit kan worden opgeslagen bij-80 ° C of onmiddellijk gebruikt.

3. Toeprinting reactie

  1. Mix 15 μL van konijn Retikulocyt Lysate (RRL, niet nuclease-behandeld), 1 μL (40 eenheden) van RNase Inhibitor, 1 µL van 91 mM ATP (1.82 definitieve mM) en 1 μL van 85 mM GMP-PNP (1,7 mM definitieve) in een 1,5 mL microfuge buis. Incubeer bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
    Opmerking: De RRL moet aliquoted voor eenmalig gebruik om te voorkomen dat repetitieve bevriezen-ontdooien. Een kritische controle is een reactie die RRL, ontbreekt om te verhelderen van de natuurlijke pauzes van omgekeerde transcriptie als gevolg van de secundaire structuur van het RNA. Toeprinting buffer ter vervanging van RRL voor dit besturingselement toevoegen.
  2. Voeg 0,5 µg (1 µL) van RNA toe en Incubeer bij 30 ° C gedurende 5 minuten.
  3. Voeg 22 µL van Toeprinting buffer en Incubeer bij 30 ° C gedurende 3 minuten.
  4. Voeg 0,5 µL (5 pmol) IRDye-geëtiketteerden primer en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.
  5. Voeg 2 µL van 25 mM dNTPs (eindconcentratie: elke 1 mM), 2 µL van 100 mM Mg(OAc)2, 1 µL van aviaire Myeloblastosis Virus Reverse-Transcriptase (AMV-RT) en 3,5 µL van Toeprinting buffer. Het eindvolume is 50 μl.
  6. Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 45 min.
  7. Voeg 200 µL nuclease-gratis water en direct uitpakken met 250 µL van 25:24:1 fenol: chloroform: Isoamylalcohol (pH ongeveer 8.0). Vortex 5 s en centrifuge op 20.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Verwijderen van de waterfase aan een nieuwe 1,5 mL microfuge buis, 3 volumes van 100% ethanol, vortex 5 s, toevoegen en neerslag bij-20 ° C's nachts.
  8. Centrifugeer bij > 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C en negeren de bovendrijvende substantie. Wassen van de DNA-pellet met 500 µL ijskoude ethanol van 70% (v/v). Centrifugeer bij > 20.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Aspirate zoveel supernatant mogelijk en lucht droog dat de pellet voor 5-10 min. oppassen niet te verjagen van de pellet.
  9. Los van de pellet in 6 μL van de nuclease-gratis water en voeg 3 μL van formamide laden kleurstof.

4. sequencing reacties

  1. De DNA-sjabloon van 2.1 en de primer met het IRDye-label uit stap 3.4 gebruiken voor standaard sequencing reacties, met behulp van dideoxynucleotides (ddNTPs) als keten afsluitweerstanden. Gebruik een geschikte DNA sequencing kit en volg de instructies van de fabrikant.
  2. Mix 6 μL van elke reactie sequencing met 3 μL van formamide laden kleurstof.

5. bereiding van de Sequencing van Gel en elektroforese

Opmerking: Dit protocol gebruikt een fluorescentie gel gebaseerde imager en een 21 x 23 cm x 0,2 mm gel, maar kan worden aangepast voor andere sequencers of gel-maten, indien nodig.

  1. Grondig schoon de 0,2 mm afstandhouders, alsmede de korte (23 × 25 cm) en lang (30 × 25 cm) glasplaten met 100% ethanol. Droge lucht.
  2. Mix-30 mL van 6% polyacrylamide - 7M ureum gel meng met 200 μl van 10% (m/v) ammonium persulfate (APS) en 20 μL van tetramethylethylenediamine (TEMED). Giet de gel, verzorgen om te voorkomen dat bubbels, en de ' haai ' gel kam invoegen. Laat de gel te polymeriseren gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  3. Bouw de opstelling sequencing en vul de reservoirs met 1 x TBE.
  4. Vooraf een looptijd van 15 min op 1500 V totdat de optimale temperatuur van 55 ° C is bereikt.
  5. Verwarm de monster/laden kleurstof mix (vanaf stappen 3.9 of 4.2) tot 85 ° C voor 5 min. belasting 1 μL op de sequencing-gel.
  6. De gel op 1500 V voor 8 h uitvoeren. De machine zal het lezen van de bands in real-time.
  7. Demonteren van het apparaat, en gooi de acrylamide gel en lopende buffer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij hebben eerder beschreven van het vermogen van de XIAP IRES GLB-onafhankelijke vertaling initiatie in vitro8,10te steunen. Toeprinting was de belangrijkste techniek te ondervragen de mechanistische details van de complexe XIAP IRES-initiatie. Een DNA-construct codering een mRNA met de XIAP IRES (Figuur 1A) werd in vitro transcribeerde en onderworpen aan de toeprin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toeprinting is een krachtige techniek om direct het vermogen meten van een RNA van belang ter ondersteuning van de vorming van vertaling initiatie complexen onder zeer gecontroleerde omstandigheden. Dit protocol beschrijft een vereenvoudigde methode voor toeprinting zoogdieren RNAs. Konijn Retikulocyt lysate (RRL) wordt gebruikt als een handige bron van ribosomen, eIFs, initiator tRNA en IRES trans-handelend factoren (ITAFs). De experimentator biedt hun RNA van keuze en kan ook het aanvullen van de reactie van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflict-van-belang om bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door een natuurwetenschappen, Engineering Raad van Canada-Discovery onderzoeksbeurs (RGPIN-2017-05463) en de Stichting van Canada voor innovatie-John R. Evans leiders Fonds (35017), de Campus Alberta innoveert programma en de Alberta-ministerie van Economische ontwikkeling en handel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DEPC (Diethyl pyrocarbonate)SigmaD5758-100ML
TRIS base, UltrapureJT Baker4109-01
KOAc (Potassium acetate)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate)Bio BasicMB0326
Sucrose, molecular biology gradeCalbiochem573113-1KG
SpermidineSigma85558
GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solutionSigmaG0635
ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solutionSigmaA6559
19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40%Bio BasicA0006
UreaBio BasicUB0148
500mL bottle top filtration units, 0.2 µmSarstedt83.1823.101
FormamideSigmaF9037-100ML
EDTA (disodium salt, dihydrate)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
Bromophenol blueBio BasicBDB0001
Xylene cyanol FFBio BasicXB0005
MEGAshortscript T7 transcription kitAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kitAmbionAM1344
Acid Phenol:Chloroform (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl AlcoholInvitrogen15593-049
Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated.Green Hectares, USAContact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Mix equal parts for a stock of 25 mM each.
AMV-RT, 10 U/µLPromegaM5101
Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing KitThermo Fisher707701KT
Model 4200 IR2 DNA analyzerLI-CORProduct has been discontinued
APS (Ammonium Persulfate)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion High Fidelity PolymeraseNew England BiolabsM0530
Turbo DnaseThermo FisherAM2238

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
  3. Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).
  4. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
  5. Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
  6. Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
  7. Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).
  8. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  9. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  10. Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
  11. Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
  12. Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
  13. Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
  14. Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
  15. Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
  16. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295(2014).
  17. Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).
  18. Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

IRES gemedieerde translatieRNA zuiveringreverse transcriptiepolyacrylamidegelelektroforesefluorescentie imagingribosoombindingcap afhankelijke initiatie

Gerelateerde artikelen