Dit protocol beschrijft een nieuw opgerichte methode voor virus levering aan de lymfkliertest prostaat. Met behulp van technologie van de CRISPR/Cas9, gene overexpressie of Cre recombinase levering, de techniek kunt orthotopic wijziging van genexpressie en implementeert een roman muismodel voor prostaatkanker.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Virus levering van CRISPR gidsen voor de lymfkliertest prostaat voor Gene wijziging
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Met een steeds vaker voorkomen van prostaatkanker is identificatie van nieuwe stuurprogramma's van de tumor of modulatoren cruciaal. Genetisch gemodificeerde Muismodellen (GEMM) voor prostaatkanker worden belemmerd door de heterogeniteit van de tumor en de complexe micro dynamiek. Traditionele prostaatkanker Muismodellen omvatten onder anderen, kiemcellen en voorwaardelijke uitsparingen, transgene uiting van oncogenen en xenograft modellen. Generatie van DOVO mutaties in deze modellen is complex, tijdrovend en kostbaar. Bovendien, richten meeste van traditionele modellen de meerderheid van de prostaat epitheel, overwegende dat menselijke prostaatkanker is bekend om te evolueren als een op zichzelf staande gebeurtenis in slechts een klein gedeelte van de cellen. Waardevolle modellen wilt simuleren niet alleen de prostaatkanker initiatie, maar ook de progressie naar gevorderde ziekte.
Hier beschrijven we een methode te richten op een paar cellen in de prostaat epitheel door transducing cellen door virale deeltjes. De levering van een gemanipuleerde virus aan de lymfkliertest prostaat kunt ombouwen van genexpressie in de prostaat epitheel. Virustype en het aantal zal hierbij het aantal gerichte cellen voor gene wijziging definiëren door transducing een paar cellen voor het initiëren van de kanker en vele cellen voor gentherapie. Door middel van chirurgie gebaseerde injectie in de voorste kwab, distale uit de urine track, kan de tumor in dit model uitbreiden zonder afbreuk te doen aan de urinaire functie van het dier. Bovendien richten op slechts een subset van prostaat epitheliale cellen de techniek kunt klonen uitbreiding van de tumor, en daarom bootst menselijke tumor initiatie, progressie, evenals de invasie door de basale membraan.
Deze nieuwe techniek biedt een krachtige prostaatkanker model met verbeterde fysiologische relevantie. Dierenleed is beperkt, en aangezien geen extra fokken vereist is, over het geheel genomen dieren is verminderd. Op hetzelfde moment, wordt analyse van nieuwe kandidaat-genen en trajecten versneld, die op zijn beurt meer kostenefficiënt is.
Inleiding
Opsporing en behandeling van prostaatkanker hebben in de afgelopen tien jaar aanzienlijk verbeterd. Toch, de incidentie van prostaatkanker groeit, na levensverwachting. Met een geschatte 1,1 miljoen nieuwe gevallen wereldwijd is het een van de meest voorkomende oorzaken van kanker sterfgevallen in mannen 1. Prostaatkanker is traag in haar ontwikkeling, maar wanneer de kanker heeft geleid tot een metastatische vergevorderde, prognose is slecht als gevolg van de beperkte behandelmogelijkheden. Tot nu toe alleen een paar genen zijn geïdentificeerd als gemeenschappelijke stuurprogramma's in deze vorm van kanker, en haar heterogeniteit en multifocality belemmeren detectie van biomarkers en2,3van de stuurprogramma's van de targetable ziekte.
Klassieke technieken van genereren GEMMs ondervinden vaak door hun complexiteit, tijdige uitgaven en kosten. Voorwaardelijke knockout modellen hebben om te studeren van prostaatkanker kandidaat-genen, die in embryonale letaliteit resulteren als geïnactiveerd in de kiemcellen4wijd gebruikt. Meest voorkomende modellen betrekken een prostaat specifiek Cre recombinase gedreven door ofwel een gemodificeerde Probasin5 of een PSA6 promotor geïntegreerd in de GEMM door extra kruisingen. In deze modellen, zal het gen van belang in de meerderheid van de prostaat epitheliale cellen, het genereren van hyperplasie in het gehele orgaan, die afbreuk kan doen aan van het dier urinewegen functie7worden gericht.
Virale levering van het Cre-eiwit door injectie in de voorste kwab van de lymfkliertest prostaat kan dit probleem oplossen door slechts een paar cellen8. Technische vereisten van de laboratoria, deskundigheid en doelstellingen rekening houdend met, de voordelen van de methode van een breed scala aan mogelijke variaties. Succesvolle benaderingen met gebruikmaking van Adenovirus gericht op JunB en Pten9 of Lentivirus gericht op Pten en Trp5310 is o.a. gebleken. Transgenen, zoals luciferase, toe te voegen aan de virale constructie of aan de GEMM kan bovendien niet-invasieve monitoring van progressie van de ziekte via bioluminescentie imaging11.
Genoom bewerken op basis van de CRISPR/Cas9-technologie, onthult een nieuwe en snelle mogelijkheid om te studeren van kanker via een snelle generatie van somatische uitsparingen12. Virale levering van één gids RNAs (sgRNAs) gericht aan de voorste kwab van de lymfkliertest prostaat stelt een fysiologisch relevanter model van prostaatkanker. Op deze manier kunnen afzonderlijke cellen uitvoering gekozen mutaties klonen die in staat van expansie en invasie zijn vormen. Bovendien zal gebruik van gids RNAs voor meerdere doelgenen cel klonen met de wijzigingen genereren in verschillende genen. Hierdoor kan tumor heterogeniteit en een natuurlijke selectiedruk op progressie van kanker, die het belang van elk gen wijziging of epistatic mechanismen kan onthullen.
Hier presenteren we een methode om de virale deeltjes te leveren aan de lymfkliertest prostaat voor wijziging van de genexpressie. Door een kleine incisie van de buik, de lymfkliertest anterior prostaat kwab is blootgesteld en virale deeltjes worden ingespoten in de kwab. Vijf dagen na chirurgie, chirurgische clips kunnen worden verwijderd uit de huid en de prostaatkanker kan worden geanalyseerd vanaf 8 weken na. Globaal, is dit een snelle en kostenefficiënte procedure, die heeft weinig invloed op de muis en maakt grotere tumor te ontwikkelen zonder afbreuk te doen aan de muis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol omvat een chirurgische ingreep in laboratorium muizen. Alle dierproeven moeten afzonderlijk worden beoordeeld en goedgekeurd door een institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). De aanpak is gebaseerd op dierlijke herstel en overleven, zorgen voor passende anesthesie en pijnbehandeling een aseptische chirurgische omgeving te allen tijde. Gebruik een verwarming pad te voorkomen hypothermie tijdens chirurgie en tot herstel van de verdoving.
1. begin overwegingen
- Afhankelijk van het gebruikte virus, verschillende titer eisen gelden; Verdun het virus dienovereenkomstig.
Opmerking: In dit voorbeeld een Adeno-associated virus verdund in PBS wordt geïnjecteerd in een titer van 1 x 1012 IU/mL. Het virus heeft serotype 9 en bevat gids RNA Pten en expressie van Cre eiwit onder de promotor van een ubiquitin (Figuur 1). Verlies van Pten stegen pAKT en verspreiding van de prostaat epitheel13. - Gebruik mannelijke muizen op een leeftijd van 8 weken ten tijde van de operatie om voldoende prostaat ontwikkeling.
Opmerking: Muizen aangetoond in dit experiment zijn Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin muizen op C57BL/6J achtergrond12 (Figuur 1). - Vers bereiden een mix van de narcose en eventueel Houd het steriel.
Opmerking: Voor betere dierlijke herstel na de operatie, verdoving tegengif is hoogst-geadviseerd.- Ter voorbereiding van een totaal volume van 5 mL verdoving, meng 0,15 mL medetomidine hydrochloride (1 mg/mL), midazolam 0.4 mL (5 mg/mL) en 0,25 mL Butorfanol (10 mg/mL) met 4.2 mL steriele zout water.
Opmerking: Alternatieve verdoving methoden, zoals inhaleerbare Isofluraan, kunnen volgens de richtlijnen van de institutionele verzorging van de dieren worden gebruikt. - Meng om om te keren het effect van medetomidine hydrochloride na chirurgie, 0,1 mL atipamezole (5 mg/mL) met 4.9 mL steriele zout water.
- Ter voorbereiding van een totaal volume van 5 mL verdoving, meng 0,15 mL medetomidine hydrochloride (1 mg/mL), midazolam 0.4 mL (5 mg/mL) en 0,25 mL Butorfanol (10 mg/mL) met 4.2 mL steriele zout water.
- Bereiden een aseptische chirurgische omgeving door goede desinfectie en sterilisatie. Autoclaaf chirurgische instrumenten vóór gebruik.
2. virus-levering aan de lymfkliertest prostaat
- Anesthetize het dier door intraperitoneale injectie met een steriele 1 mL spuiten en een 27G x ½" naald. Gebruik een verdoving dosis van 0,01 mL/g lichaamsgewicht. Als de procedure langer dan 30 min duurt, anesthesie te handhaven door het injecteren van 1/3 van de eerste dosis elke 30 min.
- De verdoving diepte vóór ramingskosten spier ontspanning, pedaal terugtrekking en ooglidreflex reflexen bestuderen. Wanneer verlies van reflexen wordt waargenomen, scheren de onderbuik van het dier.
- Bedek zorgvuldig de ogen van het dier met veterinaire ophthalmic zalf gebruiken een steriel katoenen doekje te voorkomen blindheid vanwege het ontbreken van hoornvlies reflex.
- Veeg de geschoren buik met 70% ethanol en 10% Povidon jodium ontsmet het chirurgische gebied. Schrobben het chirurgische gebied vanuit het midden van het chirurgische gebied naar de periferie.
- Een verticale huid incisie aan de lage-abdominale middellijn van ongeveer 1 cm met behulp van een steriele chirurgische scissor uitvoeren
- Til het buikvlies met behulp van een verlostang fijne punt Voorkom beschadiging van de organen die onder leggen. Zorgvuldig maken een insnijding van de < 8 mm met behulp van chirurgische schaar via het buikvlies.
Opmerking: In tegenstelling tot de mens, van een knaagdier prostaatklier omvat vier afzonderlijke lobben. De voorste kwab is gekoppeld aan het zaadblaasje. - Zachtjes gaan de vetweefsel opzij te ontdekken van het zaadblaasje. Met behulp van een verlostang ring zorgvuldig verheffen het zaadblaasje totdat de anterior prostaat kan worden geïdentificeerd (Figuur 1).
- Het injecteren van een totaal volume van 30 µL virus (3 x 1010 virale deeltjes) oplossing in de voorste prostaat epitheel met een 0,5 mL insuline-injectiespuit met een naald 30G x 8 mm. Minimaliseren van lekkage en zorgen voor dat de vloeistof is geabsorbeerd in het weefsel, vorming van een kleine luchtbel. Plaats het zaadblaasje terug in de buikholte.
- Suture het buikvlies met 2-3 eenvoudige onderbroken steken met 6-0 absorbeerbare draadjes met een 13 mm, 3/8 cirkel en een naald taper punt.
- Nieten de huid met 3 steriele 4.8 x 6.5 mm clips opheffen van de huid met een tang om te voorkomen beschadiging van het buikvlies.
- Voor betere herstelmogelijkheden, de verdoving tegengif in een dosis van 0,01 mL/g lichaamsgewicht door intraperitoneale injectie met behulp van een steriele 1 mL spuit en een naald 27G x ½" van toepassing. Zorgvuldig plaatst de dierlijke terug in zijn kooi.
3. na chirurgieprocedures
- Houd de kooi met muizen die onderging operatie op een verwarming pad gedurende 1 uur na de ingreep een, te voorkomen hypothermie tot volledig hersteld. Als het tegengif wordt toegepast, moet het dier wakker een paar minuten na de injectie.
- Toezicht op de dieren dagelijks voor passende wond genezing en pijn indicaties. Indien nodig, beheren extra pijnstillers volgens de richtlijnen van de institutionele dierenverzorgers.
- Huid clips verwijderen na 4-5 dagen, nadat de wond is gesloten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om te beoordelen virus levering aan de lymfkliertest prostaat, werden monsters geanalyseerd drie maanden na de operatie. De Rosa26-LSL-Cas9-EGFP muizen12 express GFP in cellen die zijn blootgesteld aan Cre eiwit uitgedrukt door het virus. De prostaat monsters werden onderzocht met een fluorescentie microscopie om gebieden te identificeren met GFP signaal (figuur 2A). Het GFP-signaal geeft aan Cre activiteit in de prostaat epitheel, maa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit protocol beschrijven we een methode om te wijzigen genexpressie in de voorste kwab van de lymfkliertest prostaat door virus injectie, maken een krachtige nieuwe muismodel voor prostaatkanker (Figuur 2). Het succesvolle beheer van een Adenovirus werd voor het eerst beschreven door Leow et al. in 20058. Wij hebben eerder getoond hoe tijdrovend kruisingen van een Cre-allel voor weefsel-specifieke schrapping 9 (...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
MIJNHEER werd gefinancierd door een beurs van de Deense cancer society (R146-A9394-16-S2). MFB en MKT werden gefinancierd door AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). De heer en MFB werden medegefinancierd door Graduate School, gezondheid, AU. Het E.F.W.-laboratorium wordt ondersteund door subsidies van het Spaanse ministerie van economie (SAF2015-70857, medegefinancierd door het EFRO-EU) en een ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
We willen bedanken Liliana Fajardo Mellor (genen, ontwikkeling en ziekte; Nationale Cancer Research Center) voor de kritische lezing van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J muizen | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulinspuit | BD | 324825 | voor virusinjectie |
| 1 ml spuit | BD | 300013 | voor anesthesie-injectie |
| 30 G 1/2'' naald | BD | 304000 | voor anesthesie-injectie |
| 6-0 Polysorb-naad | Medtronic | GL889 | om het peritoneum te sluiten |
| Steriele chirurgische chirurgdoekjes | meerdere leveranciers | ||
| Verwarmingskussen | meerdere leveranciers | ||
| Povidon-jood bereidingsdoekje | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimapparaat | Aesculap | GT415 | om de buik te scheren |
| Dumont pincet | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro naaldhouder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris schaar | F.S.T | 14094-11 | |
| Nauw patroon pincet | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring pincet | F.S.T | 11106-09 | |
| Wondklemsysteem handvat met clips | F.S.T | 12030-01 | om de huid te sluiten |
| Wondklemsysteem verwijderaar | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscoop | Leica | er zijn verschillende modellen gebruikt | |
| Reagentia | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | verkregen van het dierfaciliteit | ||
| Butorphanol | verkregen van het dierfaciliteit | ||
| Medetomidinhydrochloride | verkregen van het dierfaciliteit | ||
| Midazolam | verkregen van het dierfaciliteit | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Oogzalf | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | meerdere leveranciers | virus gebruikt in dit protocol is een eigen productie | |
| pAKT-antilichaam | CST | 4060 | gebruikt 1:200 verdunning |
| GFP anitbody | CST | 2956 | gebruikt 1:100 verdunning |
Referenties
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
