Method Article

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

DOI:

10.3791/57543

⸱

May 21st, 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De efficiënte en robuuste isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten (OLs) is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en Pelizaeus-Merzbacher-achtige ziekte (PMLD). Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Aangezien onvolwassen OL vormen meer dan 80% van de knaagdier-hersenen witte stof op postnatale dag 7 (P7) deze methode isolatie zorgt niet alleen voor hoge cellulaire opbrengst, maar ook de specifieke Isolatievan OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming, daalt het mogelijkheid van het isoleren van contaminerende cellen zoals astrocyten en andere cellen uit de hersenen van de muis. Deze methode is een wijziging van de technieken die eerder gerapporteerd en biedt Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocyten (OLs) zijn de cellen van de myelinating van het centrale zenuwstelsel (CNS)1. De isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten in een strak gereguleerde omgeving is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose,2 . Dit vereist een efficiënte en robuuste Oligodendrocyt isolatie en cultuur methode3. In deze studie profiteerde we van de expressie van een onderscheidende Oligodendrocyt cel oppervlakte markering om een gemodificeerde isolatie-techniek die is snelle en specifieke.

Vier verschillende fasen van Oligodendrocyt rijping zijn geïdentificeerd, elk gekenmerkt door de expressie van de oppervlakte merkers onderscheidend cel voor elke ontwikkelings fase (Figuur 1). Deze cel oppervlakte markers kunnen worden herkend door specifieke antilichamen4,5, en kunnen worden gebruikt voor het isoleren van OLs in specifieke stadia. In de eerste fase, Oligodendrocyt voorlopercellen (OPCs) de capaciteit hebben om te vermenigvuldigen, migreren en specifiek express bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor (PDGF-Rα)6, ganglioside A2B5, Proteoglycaan NG27,8 , polysialic zuur-neurale cel adhesie molecuul9 en vetzuren-zuur-bindend-proteïne 7 (FABP7)10. Bipolaire morfologie hebben OPCs met enkele korte processen die afkomstig zijn van de tegengestelde Polen van de cel lichaam, dat is kenmerkend voor de voorloper van de neurale cellen11.

figure-introduction-1
Figuur 1: expressie van cel oppervlakte markers tijdens de ontwikkeling van de muis Oligodendrocyt. OLs cel oppervlakte markeringen zoals A2B5, GalC (O1), NG2, O4 en PDGF-Rα kunnen worden gebruikt om te isoleren specifiek oligodendrocyten specifieke ontwikkelingsstoornissen stadium met behulp van specifieke antilichamen.   Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In de tweede fase, OPCs aanleiding geven tot preoligodendrocytes en express op het celmembraan niet alleen OPC markeringen, maar ook het sulfatide (een sulfated galactolipid) erkend door de O4 antilichaam12,13, en de GPR17-eiwit14, die blijft bestaan tot de fase van onrijpe Oligodendrocyt (OL). In dit stadium uitbreiden preoligodendrocytes multipolaire korte processen. Preoligodendrocytes zijn de grote OL Stadium op postnatale dag 2 (P2) in de cerebrale witte stof voor zowel rat en muis met een kleine bevolking van onrijpe OLs15.

Tijdens de derde fase blijven de onrijpe OLs express van O4, uitdrukking van A2B5 en NG2 markers verliezen en beginnen te express galactocerebroside C16. In dit stadium, OLs zich inzetten voor de oligodendroglial afkomst en post mitotische cellen met lange vertakte takken17,18geworden. Onrijpe OL vormen meer dan 80% van de knaagdier witte stof op P7 en op dit moment de eerste cellen van MBP+ 15,19,20,21worden waargenomen. Daarom kon Isolatievan OLs op P7 cellulaire hoogrentende zorgen.

In het laatste en vierde ontwikkelingsstadium OL express volwassen OLs myelinating eiwitten (myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwitten (PLP), myeline verbonden glycoproteïne (MAG) en myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG)22,23 ,24,25,26. In dit stadium, volwassen OLs uitbreiden van membranen dat formulier compact enwrapping omhulsels rond de axonen en zijn in staat om myelinate. Dit valt samen met de waarneming dat in hersenen rat en muis, MBP+ cellen steeds meer overvloedig op P1419,20,21 worden.

Sinds de eerste Isolatievan Oligodendrocyt door Fewster en collega's in 196727, zijn verschillende methoden voor de isolatie van OLs uit het knaagdier CNS doorgevoerd met inbegrip van de immunopanning28,29,30, fluorescentie-geactiveerde cel sorteren (FACS) exploiteren cel oppervlak-specifieke antigenen28,31, differentiële kleurovergang centrifugeren32,33,34,35 en een schudden methode gebaseerd op differentiële hechting van verschillende CNS glia36,37. Bestaande cultuur methoden hebben echter beperkingen, met name wat betreft zuiverheid, de opbrengst en de tijd die nodig is voor het uitvoeren van de procedures38. Meer efficiënte isolatie methoden voor oligodendrocyten zijn dus vereist.

In deze paper presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Deze methode is een wijziging van de technieken die zijn gemeld door Emery et al. 39 en Dincman et al. 40 en biedt een Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muizen gebruikt in deze studie werden verzorgd volgens de richtlijnen van het protocolnummer SUNY Downstate Medical Center divisie van laboratorium dier middelen (DLAR) 15-10492.

Opmerking: Primaire oligodendrocyten werden geïsoleerd van neonatale (P5-P7 wild-type C57Bl/6N) muizen. In dit stadium vormen onvolwassen OLs meer dan 80% van de knaagdier witte stof zorgen voor hoge cellulaire opbrengst. Alle buffer en reagens composities zijn beschikbaar aan het einde van de Tabel van materialen.

1. Coverslips voorbereiding

Opmerking: Poly-D-lysine (PDL) / laminin gecoat coverslips moet worden voorbereid voordat OL isolatie.

  1. Plaats #1 Duits coverslips glas in een conische buis van 50 mL en voeg 35 mL 70% EtOH om deze te reinigen.
  2. Sluit de buis, plaatst u deze in een nutating mixer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten terwijl het voorzichtig rocken. Coverslips kan 's nachts worden geïncubeerd.
  3. Gooi de 70% EtOH.
  4. De coverslips 3 keer met gedeïoniseerd water wassen, verwijder het water telkens met vacuüm aspiratie.
  5. 30-35 mL PDL 50 µg/ml toevoegen aan de coverslips in de buis met 50 mL, genoeg ter dekking van de coverslips.
  6. Plaats van de 50 mL-buis met de coverslips op een nutating mixer en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten terwijl het voorzichtig rocken.
  7. Wassen van de coverslips 3 keer met gedeïoniseerd water, het verwijderen van het water telkens met vacuüm aspiratie.
  8. Breng de coverslips in de 60-mm petrischalen met gedeïoniseerd water.
  9. Gebruik een tip van de pipet P200 te regelen van de coverslips als een laag die betrekking hebben op het gehele oppervlak van de petrischaal.
  10. Verwijder voorzichtig, het water van de schotels met vacuüm aspiratie.
  11. Verwijder de overmaat water rond de coverslips en laat ze drogen overnachting met deksel open en onder UV-licht in de kap.
    Opmerking: PDL gecoat glas coverslips kan worden achtergelaten bij 4 ° C in steriele petrischalen voor maximaal drie maanden.
  12. Plaats de coverslips in 24-Wells-platen, één per goed, met behulp van fijne pincet.
  13. Verplaats de coverslips naar het midden van het goed om ervoor te zorgen dat de randen raak niet aan de muur van de waterput.
  14. Voeg 100 µL van 10 µg/mL laminin verdund in B27NBMA (Zie de Tabel van materialen) beginnen in het midden van elke dekglaasje aan en verplaatsen in een circulaire mode naar de randen ter dekking van alle gebied.
    Opmerking: Aangezien laminin betrokken bij OL onderhoud is en differentiatie in volwassen OLs bevordert, het is een belangrijke factor van de overleving van de OL voor in vitro cultuur41,42,43,44.
  15. Incubeer de plaat in een incubator van 37 ° C bij 5% CO2 voor ten minste 1 uur of totdat de OLs klaar voor de beplating zijn.

2. muis hersenen Cortex dissociatie

  1. Offeren postnatale 5-7-daagse oude C57Bl/6N muis pups door snelle onthoofding met een schaar eerder gereinigd in 70% ethanol.
    Opmerking: cerebrale cortices van 5-6 neonatale muizen pups werden gebruikt voor elk preparaat. Een muis hersenen levert gemiddeld 1-1,5 x 106 OLs.
  2. Snijd de hoofdhuid huid langs de middellijn met een kleine ontleden schaar en intrekken om de schedel bloot te stellen.
  3. Snijd de schedel zorgvuldig langs de middellijn vanaf de opening aan de achterkant van de schedel naar het frontaal oppervlak, opheft met de schaar om te voorkomen beschadiging van de hersenen. Knip dan, met behulp van de opening aan de achterkant van de schedel naar elke oogkas langs de onderkant van de schedel.
  4. Gebruik fijne pincet voorzichtig plagen van de cortices uit de buurt van de veroorzaakt en hen overbrengen naar een 60-mm weefselkweek schotel met 7 mL B27NBMA. Herhaal stap 2.2 tot 2.4 voor elke hersenen, bundeling van de ontleed cortices.
  5. De cortices overbrengen in een nieuwe 60 mm weefselkweek schotel met 5 mL dissociatie buffer (B27NBMA, 20-30 U/mL papaïne en 2.500 U DNase ik).
  6. Snijd de cortices in kleine stukjes van ongeveer 1 mm-3 met behulp van een scalpel #15-mes en incubeer gedurende 20 min in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.
  7. Voeg vervolgens 1 mL van boviene groei serum (BGS) om te stoppen met de enzymatische reactie.
  8. De cortices samen met de dissociatie media overbrengen in een 15-mL conische buis met behulp van een serologische Pipetteer van 10 mL.
  9. Zachtjes begint te distantiëren van het hersenweefsel door langzaam pipetteren omhoog en naar beneden 6 - 8 keer met behulp van een 10-mL serologische Pipetteer, met behulp van care om te minimaliseren van de bubbels.
  10. Laat de stukjes weefsel te regelen voor 2-3 min en het supernatant overbrengen in een verse buis.
  11. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS/2500 U DNase ik aan het weefsel pellet.
  12. Een serologische 5 mL-pipet zachtjes het verwerpen van het hersenweefsel terwijl pipetteren omhoog en omlaag gebruiken 6 - 8 keer. Wees voorzichtig om te minimaliseren van de bubbels.
  13. Laat de stukjes weefsel te regelen voor 2-3 min.
  14. Het supernatant overbrengen in een verse buis. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS/DNase ik aan het weefsel pellet.
  15. Zachtjes distantiëren van het hersenweefsel met behulp van een P1000 Pipetteer tip, terwijl de mix van media pipetteren en brain weefsel op en neer. Herhaal stappen 2.13 en 2.14 totdat geen grote brokken van weefsel blijven of tot B27NBMA die 10 gewichtspercenten BGS/DNase ik is uitgeput, indien dit eerder is. Wees voorzichtig om te minimaliseren van de bubbels.
  16. Zwembad celsuspensie met vorige supernatant.
  17. 70-µm cel zeef in een 50 mL-buis te plaatsen. Met behulp van een 10-mL serologische Pipetteer, voorbij de gepoolde celsuspensie zachtjes de zeef van de cel 70-µm.
  18. De cel zeef wassen door toevoeging van 1 mL B27NBMA met 10% BGS/DNase ik.
  19. Gooi de cel zeef. Zodat het volume 30 mL met B27NBMA met 10% BGS/DNase ik.
  20. Spoel de celsuspensie twee 15-mL conische buizen. De celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g centrifugeren.
  21. Verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder het verlaten van de cellen die zijn blootgesteld aan de lucht. De bovendrijvende vloeistof zullen bewolkt als gevolg van cel puin. Voeg 3 mL B27NBMA met 10% BGS aan de pellet.
  22. Zorgvuldig distantiëren de pellet van de cel met behulp van een pipet P1000. Zodat het volume tot 15 mL met B27NBMA met 10% BGS.
  23. De celsuspensie voorbij een vers 40 µm cel zeef.
  24. De cel zeef wassen door toevoeging van 1mL B27NBMA met 10% BGS. Gooi de cel zeef.
  25. Zodat het volume 30 mL met B27NBMA met 10% BGS.
  26. De celsuspensie overbrengen in 2 x 15 mL conische buizen. De celsuspensie gedurende 10 minuten bij 200 x g centrifugeren.
  27. Allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het verlaten van de cellen die zijn blootgesteld aan de lucht. Resuspendeer de cel-pellets op in 5 mL ijs koud magnetische cel sorteren (MCS) buffer.

3. bepaling van de cellen en levensvatbaarheid

  1. Verdun 100 µL van de celsuspensie met 400 µL van Trypan blauwe oplossing in een buis van de 1.5-mL microcentrifuge om een verdunning 1:5 in 0,4% (m/v).
  2. Hiermee centreert u een glas cover over een hemocytometer kamer en vul de twee kamers met 10 µL van de verdunning van de cel met behulp van een precisiepipet P10 en het vermijden van overvulling. De oplossing zal passeren onder het glas cover door capillaire werking.
  3. Plaats van de hemocytometer in het werkgebied van de Microscoop en aanpassen van de focus met behulp van 40 X vergroting.
    Opmerking: De cellen zijn opgenomen met behulp van een hand-held teller in elk van de vijf pleinen (vier hoeken en een centrum). Alleen niet-levensvatbare cellen absorberen de kleurstof en blauw, terwijl live en gezonde cellen verschijnen ronde en refractieve en doen niet absorberen de blauw gekleurde kleurstof, zodat voor de bepaling van het aantal levensvatbare en totale cellen per milliliter.

4. isolatie van O4+ oligodendrocyten

  1. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 10 minuten.
  2. Verwijder het supernatant zorgvuldig met behulp van vacuüm aspiratie, vermijden van blootstelling van de cellen aan de lucht.
  3. Resuspendeer de pellet in 90 µL van MCS buffer per 1 x 107 totaal aantal cellen, gevolgd door de toevoeging van 10 µL van anti-O4 kralen per 1 x 107 cellen.
  4. Meng de celsuspensie en kralen door zachtjes flicking de buis 15 mL kegelvormig met de vinger 4 - 5 keer.
  5. Incubeer de mix voor 15 min bij 4 ° C, flicking de buis 15 mL kegelvormig met de vinger 4-5 timesevery 5 min.
  6. Het wassen van de mix door zachtjes de toevoeging van 2 mL van MCS buffer per 1 x 107 cellen aan de buis. Centrifugeer de mix bij 200 x g gedurende 10 minuten.
  7. Verwijder het supernatant door zorgvuldig met behulp van vacuüm aspiratie, vermijden van blootstelling van de cellen aan de lucht. Resuspendeer de pellet cel in 500 µL van MCS buffer voor elk 1 x 107 cellen.
  8. Een magnetische scheidingsteken aan de stand van een magnetische scheidingsteken koppelen. Een selectiekolom hechten aan het magnetische scheidingsteken en plaatst u een 40 µm cel zeef op de top van de kolom. Plaats twee 15-mL of een 50 mL conische buis onder de kolom van de scheiding voor het verzamelen van de stroom door.
  9. Vooraf spoelen de 40-µm cel zeef en scheiding kolom met 3 mL MCS buffer en laat de buffer uitvoeren door de kolom zonder het te laten drogen.
  10. Toe te voegen de mix van celsuspensie en kralen aan de zeef van de cel in de selectiekolom.
  11. Wassen van de 40 µm cel zeef met 1 mL MCS buffer.
  12. Negeren van de cel zeef en laat de mengeling van cellen, kralen en buffer uitvoeren door de kolom zonder het te laten drogen.
  13. Was de scheiding kolom 3 keer met 3 mL MCS buffer en 1 keer met OL proliferatie media.
  14. Verwijder de scheiding kolom uit de magnetische scheidingsteken, plaats het snel in een conische buis 15 mL en onmiddellijk Voeg 5 mL OL proliferatie media.
  15. Plaats een zuiger op de top van de kolom en stevig druk te spoelen van de gelabelde cellen in de conische buis 15 mL.
  16. Verwijder 100 µL celsuspensie cellen en levensvatbaarheid als aangegeven in punt 3 met behulp van de Trypan blauw en hemocytometer te bepalen.
    Opmerking: De levensvatbaarheid van de cellen boven de 80% is aanvaardbaar om door te gaan met de cultuur van OLs, maar levensvatbaarheid groter is dan 90% is optimaal.

5. de beplating van geïsoleerde O4+ oligodendrocyten

  1. Verdun de celsuspensie aan de wens plating dichtheid (5 x 10,5 cellen per dekglaasje aan) met behulp van OL proliferatie media.
    Opmerking: OL zaaien dichtheid is zeer belangrijk, zodat passende celdichtheid dient bevestigd te worden met behulp van een Microscoop weefselkweek voordat u verdergaat. Dichtheid onder 10.000 cellen/coverslips zaaien kan leiden tot overleving van de arme cel. Dichtheid bij 10.000 tot 25.000, OL plating is morfologische differentiatie traag45. We plaat OLs bij een seeding dichtheid van ten minste 50.000 cellen/coverslips om de overleving van de cel.
  2. De 24-Wells-platen met coverslips bekleed met laminin van incubator aan de kap van weefselkweek verplaatsen
  3. Laminin uit elke dekglaasje aan verwijderen en vervangen door 100 µL van OL schorsing.
  4. Incubeer OLs in de 37 °C/5% CO2 incubator voor een maximum van 45 min ter bevordering van OL hechting op de coverslips.
  5. Na incubatie het 24-Wells-platen uit de incubator te verwijderen. Overstroming van elk van de 24-well plaat met 500 µL van OL proliferatie media.
  6. Plaats de OLs terug in de 37 °C/5% CO2 incubator voor extra 24 h.
  7. 24 uur na de beplating van OLs, proliferatie media verwijderen en vervangen door OL differentiatie media voor het opwekken van differentiatie.
  8. Het OLs plaats terug in de incubator en verwijder niet totdat de cellen klaar voor fixatie zijn.
    Opmerking: Wijzigingen in pH zijn schadelijk voor OLs en afnemen van de levensvatbaarheid van de cellen, daarom geen onnodige verwijdering van OLs culturen uit de incubator moet worden vermeden.

6. immunofluorescentie kleuring

  1. Voor de detectie van cel Verwijder oppervlakte markeringen (NG2, O1 en O4) het medium van de putten.
  2. Voeg 250 µL van muis hybridoma supernatant met primaire antilichamen tegen O1 (onverdund)13 en O4 (onverdund)13 en konijn polyklonale tegen NG2 (1:150 verdund in B27NBMA).
    Opmerking: Als verkrijgbare anti-O1 en anti-O4 antilichamen zijn om te worden gebruikt, is het raadzaam om te gebruiken verdunningen voorgesteld door de fabrikant.
  3. Incubeer de cellen met primair antilichaam voor 45 min maximale in een 37 °C/5% CO2 incubator.
  4. Wassen tweemaal met 0,05% Tween-20/1 X PBS. Herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde (4% PFA) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Verdun Alexa 488-geconjugeerde geit-antimuis IgM of anti-konijn IgG secundair antilichaam (1:400) in B27NBMA.
  7. De 0,05% Tween-20/1 X PBS uit de coverslips verwijderen. Incubeer de cellen met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  8. Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  9. Voor dubbele kleuring voor het detecteren van interne merkers (GFAP), verwijdert u de 0,05% Tween-20/1 X PBS en blok/permeabilize cellen met blok/permeabilization buffer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Ga anders verder met stap 6.17.
  10. Verwijder blok/permeabilization buffer en voeg van 250 µL kip anti-GFAP (1:100) verdund in blok/permeabilization buffer.
  11. Incubeer de cellen met anti-GFAP gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Verdun Alexa 594-geconjugeerde geit anti-kip IgG secundair antilichaam deze (1:400) in B27NBMA.
  13. De 0,05% Tween-20/1 X PBS uit de coverslips verwijderen. Incubeer de cellen met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  14. Wassen drie keer, gedurende 5 min met 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Counterstain met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en monteer de cellen met antifade montage DAPI met media.
  16. Laat de coverslips overnachten in het donker bij kamertemperatuur genezen.
  17. Het imago van de gekleurde cellen met een Microscoop epifluorescence.
    Opmerking: In dit protocol, de cellen werden beeld bij 40 X vergroting met behulp van een uniforme belichtingstijd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van deze studie was om een verbeterde isolatie methode voor O4+ primaire muisknop oligodendrocyten waarvoor de minste mogelijke manipulatie van de doelcellen. De hele procedure van euthanasie voor de pups aan de beplating van de cellen in coverslips duurt ongeveer 4 uur en gegevens hieronder vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten. Na weefsel dissociatie, gemiddeld 4,3 ± 0,46 x 107 cellen waren geïsoleerd voor elke onafhankelijke experiment met ee...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze mededeling presenteren we een methode voor de efficiënte isolatie van hoogst gezuiverde onvolwassen muis Oligodendrocyt culturen. In vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen39,40, leverde deze methode een hogere zuiverheid met een veel lager niveau van GFAP-positieve astrocyten en een zeer laag percentage van andere cellen niet-gekenmerkt. Het is belangrijk om erop te wijzen dat deze onrijpe OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming. Dus...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen informatieverschaffing.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) en de National Institutes of Health (R03NS06740402). De auteurs bedanken Dr Ivan Hernandez en zijn leden van de lab voor het verstrekken van laboratorium ruimte, apparatuur en advies.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10ml serologische pipettenFisher Scientific13-676-10J
10ml spuit Luer-Loc tipBD, Becton Dickinson309604
15ml conische buizenFalcon352097
24-well weefselkweekplatenFalcon353935
40µm cellezaaierFisher Scientific22368547
50ml conische buizenFalcon352098
5ml serologische pipettenFisher Scientific13-676-10H
60mm weefselkweekplatenFalcon353002
70µm cellezaaierFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaamInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgM (H+L) secundair antilichaamInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgM (H+L) secundair antilichaamInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 geit anti-kip IgG (H+L) secundair antilichaamInvitrogenA11042
Anti-O4 kralen- Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrine mensSigmaT1147
Autofil complete flesdopfilterassemblage, 0.22um filter, 250mlUSA Scientific6032-1101
Autofil complete flesdopfilterassemblage, 0.22um filter, 250mlUSA Scientific6032-1102
B27 SupplementInvitrogen17504-044
BoorzuurSigmaB7660
Rundserum (BGS)GE Healthcare Life SciencesSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotineSigmaB4639
Desoxyribonuclease I (DNAse I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
Epifluorescente microscoop met Olympus DP70 cameraOlympusBx51
Feather wegwerp scalpelsAndwin ScientificEF7281C
ForskolineSigmaF6886
Duitse glazen dekglasjes, #1 dikte, 12mm diameter rondNeuVitroGG-12-oz
GFAP antilichaamAvesGFAP
GlucoseFisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
InsulinInvitrogen12585-014
Magnetische scheidingstandaard - MACS multistandMiltenyi Biotec130-042-303
Magnetische scheider-MiniMACS scheiderMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22µm filtereenheidMilliporeSLG033RS
Montagemedia- Prolong Gold met DAPIThermo FisherP36930
N-acetyl-cysteïne (NAC)SigmaA8199
Natuurlijke muis laminineInvitrogen23017-015
Neurobasal Medium AInvitrogen10888-022
Neurotrophine-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 antilichaamMilliporeAB5320
PapaïneWorthingtonLS003126
PBS zonder Ca2+ en Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
PetrischalenFalcon351029
Poly-D-LysineSigmaP6407
PrimocinInvivogenant-pm-2
ProgesteronSigmaP8783
PutrescineSigmaP5780
Selectiekolom-LS kolommenMiltenyi Biotec130-042-401
NatriumselenietSigmaS5261
Trace elementen BCorning25-000-CI
Trijoodthyronine (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Trypan Blauw oplossingCorning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379
B27NBMA487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C tot gebruik.
B27NBMA + 10% BGS27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum
CNTF oplossing stock (10 µg/ml; 1000X)Bestel bij Peprotech (450-50). Maak op bij 0.1 tot 1 mg/ml volgens de instructies van de fabrikant (kan variëren per partij) in buffer (bijv. DPBS + 0.2% BSA). Bewaar bij -80 °C.
Werkoplossing (10 µg/ml, 1000X)
1. Maak op 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS oplossing en filter steriliseren.
2. Verdun master stock aliquot tot 10µg/ml in steriele, gekoelde 0.2% BSA/DPBS.
3. Aliquoteer (20µl/buis) en snel invriezen in vloeibare stikstof.
4. Bewaar aliquots bij -80 °C.
d-Bio

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oligodendrocyte IsolationImmunomagnetic SeparationO4 Positive CellsPrimary OligodendrocytesNeonatal Mouse PupsMagnetic Cell SortingCell Strainer FiltrationCentrifugation ProtocolOligodendrocyte ProliferationImmunofluorescence Staining

Related Articles