We beschrijven de immunomagnetic isolatie van primaire muisknop oligodendrocyten, waarmee het snelle en specifieke isolement van de cellen voor in vitro cultuur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De efficiënte en robuuste isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten (OLs) is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose en Pelizaeus-Merzbacher-achtige ziekte (PMLD). Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte selectiemethode voor de isolatie van de immunomagnetic van fase drie O4+ preoligodendrocytes cellen van neonatale muizen pups. Aangezien onvolwassen OL vormen meer dan 80% van de knaagdier-hersenen witte stof op postnatale dag 7 (P7) deze methode isolatie zorgt niet alleen voor hoge cellulaire opbrengst, maar ook de specifieke Isolatievan OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming, daalt het mogelijkheid van het isoleren van contaminerende cellen zoals astrocyten en andere cellen uit de hersenen van de muis. Deze methode is een wijziging van de technieken die eerder gerapporteerd en biedt Oligodendrocyt voorbereiding zuiverheid boven de 80% in ongeveer 4 uur.
Inleiding
Oligodendrocyten (OLs) zijn de cellen van de myelinating van het centrale zenuwstelsel (CNS)1. De isolatie en de cultuur van primaire oligodendrocyten in een strak gereguleerde omgeving is een waardevol instrument voor het in vitro onderzoek naar de ontwikkeling van oligodendroglia, alsook de biologie van demyeliniserende ziekten zoals multiple sclerose,2 . Dit vereist een efficiënte en robuuste Oligodendrocyt isolatie en cultuur methode3. In deze studie profiteerde we van de expressie van een onderscheidende Oligodendrocyt cel oppervlakte markering om een gemodificeerde isolatie-techniek....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De muizen gebruikt in deze studie werden verzorgd volgens de richtlijnen van het protocolnummer SUNY Downstate Medical Center divisie van laboratorium dier middelen (DLAR) 15-10492.
Opmerking: Primaire oligodendrocyten werden geïsoleerd van neonatale (P5-P7 wild-type C57Bl/6N) muizen. In dit stadium vormen onvolwassen OLs meer dan 80% van de knaagdier witte stof zorgen voor hoge cellulaire opbrengst. Alle buffer en reagens composities zijn beschikbaar aan het einde van de Tabel van materialen.
1. Coverslips voorbereiding
Opmerking: Poly-D-lysine (PDL) / laminin gecoat co....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het doel van deze studie was om een verbeterde isolatie methode voor O4+ primaire muisknop oligodendrocyten waarvoor de minste mogelijke manipulatie van de doelcellen. De hele procedure van euthanasie voor de pups aan de beplating van de cellen in coverslips duurt ongeveer 4 uur en gegevens hieronder vertegenwoordigen drie onafhankelijke experimenten. Na weefsel dissociatie, gemiddeld 4,3 ± 0,46 x 107 cellen waren geïsoleerd voor elke onafhankelijke experiment met ee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze mededeling presenteren we een methode voor de efficiënte isolatie van hoogst gezuiverde onvolwassen muis Oligodendrocyt culturen. In vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen39,40, leverde deze methode een hogere zuiverheid met een veel lager niveau van GFAP-positieve astrocyten en een zeer laag percentage van andere cellen niet-gekenmerkt. Het is belangrijk om erop te wijzen dat deze onrijpe OLs al toegezegd om de oligodendroglial afstamming. Dus.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen informatieverschaffing.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) en de National Institutes of Health (R03NS06740402). De auteurs bedanken Dr Ivan Hernandez en zijn leden van de lab voor het verstrekken van laboratorium ruimte, apparatuur en advies.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10ml serologische pipetten | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| 10ml spuit Luer-Loc tip | BD, Becton Dickinson | 309604 | |
| 15ml conische buizen | Falcon | 352097 | |
| 24-well weefselkweekplaten | Falcon | 353935 | |
| 40µm cellezaaier | Fisher Scientific | 22368547 | |
| 50ml conische buizen | Falcon | 352098 | |
| 5ml serologische pipetten | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| 60mm weefselkweekplaten | Falcon | 353002 | |
| 70µm cellezaaier | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Alexa Fluor 488 geit anti-muis IgG (H+L) secundair antilichaam | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgM (H+L) secundair antilichaam | Invitrogen | A21042 | |
| Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgM (H+L) secundair antilichaam | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa Fluor 594 geit anti-kip IgG (H+L) secundair antilichaam | Invitrogen | A11042 | |
| Anti-O4 kralen- Anti-O4MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-094-543 | |
| Apo-Transferrine mens | Sigma | T1147 | |
| Autofil complete flesdopfilterassemblage, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1101 | |
| Autofil complete flesdopfilterassemblage, 0.22um filter, 250ml | USA Scientific | 6032-1102 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Boorzuur | Sigma | B7660 | |
| Rundserum (BGS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30541.03 | |
| BSA | Fisher Scientific | BP-1600-100 | |
| CNTF | Peprotech | 450-50 | |
| d-Biotine | Sigma | B4639 | |
| Desoxyribonuclease I (DNAse I) | Worthington | LS002007 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311 | |
| Epifluorescente microscoop met Olympus DP70 camera | Olympus | Bx51 | |
| Feather wegwerp scalpels | Andwin Scientific | EF7281C | |
| Forskoline | Sigma | F6886 | |
| Duitse glazen dekglasjes, #1 dikte, 12mm diameter rond | NeuVitro | GG-12-oz | |
| GFAP antilichaam | Aves | GFAP | |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-61 | |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | |
| Magnetische scheidingstandaard - MACS multistand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Magnetische scheider-MiniMACS scheider | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex PES 0.22µm filtereenheid | Millipore | SLG033RS | |
| Montagemedia- Prolong Gold met DAPI | Thermo Fisher | P36930 | |
| N-acetyl-cysteïne (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Natuurlijke muis laminine | Invitrogen | 23017-015 | |
| Neurobasal Medium A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Neurotrophine-3 (NT-3) | Peprotech | 450-03 | |
| NG2 antilichaam | Millipore | AB5320 | |
| Papaïne | Worthington | LS003126 | |
| PBS zonder Ca2+ en Mg2+ | Sigma | D5652 | |
| PDGF | Peprotech | 100-13A | |
| Petrischalen | Falcon | 351029 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-2 | |
| Progesteron | Sigma | P8783 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Selectiekolom-LS kolommen | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Natriumseleniet | Sigma | S5261 | |
| Trace elementen B | Corning | 25-000-CI | |
| Trijoodthyronine (T3) | Sigma | T6397 | |
| Triton-X | Sigma | T8787 | |
| Trypan Blauw oplossing | Corning | 25-900-CI | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| B27NBMA | 487.75 mL Neurobasal Medium A; 10 mL B27 Supplement; 1 mL Primocin; 1.25 mL Glutamax; Filter steriliseren en bewaren bij 4 °C tot gebruik. | ||
| B27NBMA + 10% BGS | 27 mL B27NBMA; 3 mL Bovine growth serum | ||
| CNTF oplossing stock (10 µg/ml; 1000X) | Bestel bij Peprotech (450-50). Maak op bij 0.1 tot 1 mg/ml volgens de instructies van de fabrikant (kan variëren per partij) in buffer (bijv. DPBS + 0.2% BSA). Bewaar bij -80 °C. Werkoplossing (10 µg/ml, 1000X) 1. Maak op 0.2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) in DPBS oplossing en filter steriliseren. 2. Verdun master stock aliquot tot 10µg/ml in steriele, gekoelde 0.2% BSA/DPBS. 3. Aliquoteer (20µl/buis) en snel invriezen in vloeibare stikstof. 4. Bewaar aliquots bij -80 °C. | ||
| d-Bio |
Referenties
- Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
- Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
