Lymfkliertest distale colostomie biedt een lymfkliertest model voor menselijke afleiding colitis, een overwegend lymfatische colitis in dikke darm segment van de fecale stream uitgesloten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Lymfkliertest distale colostoma, een nieuw Model van afleiding Colitis in C57BL/6 muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Afleiding colitis (DC) is een frequente klinische toestand optreedt bij patiënten met segmenten van de darm van de fecale stream als gevolg van een onderhoudend enterostomy uitgesloten. De etiologie van deze ziekte blijft vaag, maar lijkt te verschillen van die van de klassieke inflammatoire darmziekten zoals de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa. Onderzoek dat gericht is aan het ontcijferen van de pathofysiologische mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van deze ziekte ernstig belemmerd door het ontbreken van een passende lymfkliertest model. Dit protocol genereert een lymfkliertest model van DC, dat de studie van de rol van het immuunsysteem en zijn interactie met de microbiome in de ontwikkeling van DC vergemakkelijkt. In dit model worden weergegeven met C57BL/6 dieren, zijn distale delen van de dikke darm uitgesloten van de fecale stroom door het creëren van een distale colostoma, triggering de ontwikkeling van milde tot matige ontsteking in de darm uitgesloten segmenten en reproduceren van de hallmark laesies van de mens DC met een matige systemische inflammatoire respons. In tegenstelling tot het model van de rat zijn een groot aantal genetisch gemodificeerde lymfkliertest modellen op de achtergrond C57BL/6 beschikbaar. De combinatie van deze dieren met ons model zorgt ervoor dat de potentiële rol van individuele cytokines, chemokines of receptoren van biologische actieve moleculen (bijvoorbeeldInterleukine (IL)-17; Il-10, chemokine CXCL13, chemokine receptoren CXCR5 en CCR7 en de sphingosine-1-fosfaat receptor 4) te worden beoordeeld in de pathogenese van DC. De beschikbaarheid van congenisch stammen van de muis op de achtergrond C57BL/6 vergemakkelijkt grotendeels overdracht experimenten om de rol van verschillende celtypes betrokken in de etiologie van DC. Ten slotte het model biedt de mogelijkheid om de invloeden van lokale interventies (b.v., wijziging van de lokale microbiome of lokale anti-inflammatoire therapie) beoordelen op mucosale immuniteit in segmenten van de darm waarin dit probleem optreedt en niet-getroffen en de op systemische immuun homeostase.
Inleiding
In de afgelopen jaren een groot aantal niet-infectieuze colitis entiteiten anders dan klassieke inflammatoire darmziekten (IBDs; dwz., ziekte van Crohn ziekte of colitis ulcerosa) klinisch en histopathologically bij de mens hebben is gekenmerkt. De pathofysiologische mechanismen die leiden tot de ontwikkeling van deze colitis vormen worden niet volledig begrepen gedeeltelijk omdat passende dierlijke modellen schaars zijn. Afleiding colitis is één van deze recent beschreven entiteiten. Hoewel de term werd bedacht in 1980 door Glotzer1, werd de eerste beschrijving van een soortgelijke fenotype gegeven in 1972 door Morson2. De ziekte ontwikkelt in 50% tot 91% van patiënten met het verleggen van de enterostomy en de klinische intensiteit varieert3,4. Gezien de jaarlijkse incidentie van ongeveer 120.000 colostomie patiënten in de Verenigde Staten van Amerika, vormt deze ziekte-entiteit een belangrijk gezondheidsprobleem.
Het algemene doel van de ontwikkeling van dit protocol was om een lymfkliertest DC model dat berust op een colitis trigger gelijkend op dat gezien in menselijke DC en dat reproduceert de primaire histopathologische kenmerken van de ziekte bij de mens. In tegenstelling tot andere modellen lymfkliertest colitis ulcerosa inductie in ons model vereist geen genetisch gemodificeerde dieren (bijvoorbeeld, IL-7 transgene muizen, N-cadherine dominante negatieve muizen of TGFβ- / - muizen), de toepassing van chemisch irriterende stoffen (b.v., dextran sulfaat natrium (DSS) - geïnduceerde colitis, of trinitrobenzeen sulfonzuur (TNBS) - geïnduceerde colitis), of de overdracht van bepaalde cel populaties in immuun deficiënte muizen (zoals in dehoge overdracht van CD45RB model van colitis) (voor een overzicht, Zie5). In tegenstelling tot andere modellen kunt het intact immuunsysteem van ons model DC beoordeling van het immunologische mechanisme die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de DC. De beperking van de mucosal ontsteking aan het segment uitgesloten darm kunt beoordeling van de weerslag op de mucosale immuniteit in andere delen van het maag-darmkanaal, op de immuun homeostase in andere immuun compartimenten van het darmkanaal (bv , Peyer van patches en mesenteriale lymfklieren), en op de immuun homeostase van het hele organisme. Ten slotte, ons model vormt een passend instrument voor het onderzoeken van de mechanismen waarmee lokale inflammatoire stimuli die afkomstig zijn van wijzigingen in de normale omgeving voor zowel de lokale microbiome, evenals voedselbehoefte antigenen worden bestuurd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de regering van de veterinaire autoriteit (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern, van LALLF M-V).
1. preoperatieve zorg en voorbereiding van het dier
- Bij aankomst in het dier faciliteit, dieren (C57Bl/6) verdelen in groepen van vergelijkbare grootte, cage elke groep samen en groepen de experimenten constant te houden.
Opmerking: Gebruik maken van dieren van hetzelfde geslacht. De beschreven resultaten werden bekomen met mannelijke muizen.
Opmerking: Als mannelijke dieren worden gebruikt, kooi groepen samen beginnen wanneer ze 7 weken oud, zijn zodat een hiërarchie ingesteld kan worden, dus het minimaliseren van het risico van agressief gedrag tijdens experimenten. - Ten minste één week voor de operatie, overschakelen naar een energierijke (> 14 MJ/kg) en eiwitrijk (> 20%) voeders die bevatten alle essentiële sporenelementen en vitaminen (voor meer informatie, Zie materiaallijst).
Opmerking: Verzekeren alle muizen Weeg ten minste 25 g wanneer chirurgie wordt uitgevoerd. - Anesthesie en analgesie door intraperitoneale injectie van ketamine (87 mg/kg i.p.) en xylazine waterstofchloride (13 mg/kg i.p.) veroorzaken. Wachten totdat de muis mechanische stimulatie, bijvoorbeeld teen worp, zonder motor reactie tolereert.
- Beveilig de narcotized muis met tapes in een liggende positie op een onderlaag van de warmte gepositioneerd aan de balie van de operatie, waarborging van stabiele positionering tijdens operatie en het vermijden van een overweldigende verlies van lichaamswarmte.
Opmerking: De warmte ondervloer moet een oppervlakte temperatuur van 36 ° C tot 40 ° C; moet de operatiekamer temperatuur 21 ° C.
2. de distale colostomie operatie
- Het buikhaar scheren. Voordat u begint chirurgie, Desinfecteer het operatie gebied drie keer gebruik van alcohol 70% en een iodophor. Drape het operatie gebied voor aseptische condities te garanderen.
- Een 15-mm mediaan laparotomie uitvoeren door het gebeuren van de buikspieren aan te spannen en het buikvlies langs de linea alba, dus het minimaliseren van bloedverlies.
- Gebruik twee DeBakey atraumatische pincet, Trek voorzichtig de blindedarm, terminal ileum, en oplopende en transverse colon uit de peritoneale holte.
Opmerking: Wees voorzichtig te strikt beperken mechanische manipulatie van de darm ter voorkoming van schade aan mesenterische structuren. - Identificeer de cecal paal, opgaande dikke darm en dunne darm (figuren 1a en 1b).
Opmerking: Juiste identificatie van de oplopende dubbelpunt is van fundamenteel belang voor de juiste plaatsing van de colostomie. In gevallen waar de anatomie van de regio ileocecal dubbelzinnig is, de aanwezigheid van Peyer van patches identificeert de dunne darm en de aanwezigheid van gevormde ontlasting kenmerkt de dikke darm. - Een liniaal gebruiken om te bepalen van de positie van de toekomstige colostomie. Het moet worden geplaatst 20 mm distale aan de ileocecal valve voor een distale colostomie.
- Maak een tweede 3-mm incisie in de buikwand in de hogere juiste kwadrant. Trek de eerder geconstateerde segment van de dikke darm door middel van deze incisie vormen een lus, voorzichtig om niet te verstoren de lus.
- Zorgvuldig passeren een 22-gauge flexibele i.v. canule via de mesocolon. Wees voorzichtig niet te beschadigen mesenterische vasculaire structuren.
- De darm terug naar de peritoneale holte.
- Bevestig beide uiteinden van de flexibele buis aan de huid met behulp van eenvoudige steken en een resorbeerbare hechtdraad (b.v., polyglactin 910 of polyfil 4-0 1/2 c).
- Uitvoeren alvorens te sluiten de laparotomie, vloeistof reanimatie met behulp van een intraperitoneale injectie van 0,5 mL 0,9% zout.
- Sluit het buikvlies en de spier laag met een continue hechtdraad met een resorbeerbare hechtdraad (bijvoorbeeld polyglactin 910 of polyfil 4-0 1/2 c). Sluit de huid met een continue hechtdraad met een resorbeerbare hechtdraad (b.v., polyglactin 910 of polyfil 4-0 1 / 2c).
- Open de exteriorized colon lus door het uitvoeren van een subtotaal transect met behulp van een fijne schaar. Vermijd alle schade aan het mesenterium. Niet transect het colon volledig.
- Repareren van elke colostomie openen met behulp van drie één volledige-dikte steken naar het buikvlies en huid met behulp van een monofil, absorbeerbare hechtdraad (bijvoorbeeld, polydioxanone of monofil 6-0 3/8s). De afferent loop, oftewel een functionele einde-colostoma, en de efferent loop, oftewel een slijm fistels, duidelijk gescheiden zijn op dit punt (Figuur 1 c).
Opmerking: Operation time moet minder dan 20 minuten te beperken vloeistof en thermische verliezen. - Na afwerking van chirurgie, desinfecteren instrumenten met behulp van een aldehyde-vrije desinfectie-oplossing in een ultrasoonbad volgens de instructies van de fabrikant.
3. sham operatie (Colotomy)
- Voer stap 1.1. via 2.4.
- Gebruik een liniaal om de positie van de toekomstige colotomy te bepalen. De colotomy moet op dezelfde afstand van de ileocecal valve als de colostoma in de experimentele groep worden geplaatst.
- Openen van de dikke darm ten minste tweederde de omtrek met behulp van fijn schaar.
- Dicht de colotomy met een enkellaags, full-dikte onderbroken hechtdraad met behulp van een monofil, absorbeerbare hechtdraad (b.v., polydioxanone, monofil 6-0 3/8s).
Opmerking: Operation time moet minder dan 20 minuten voor een geëxperimenteerd chirurg, vloeistof en thermische verliezen te beperken. - Stappen 2.10. , 2.11. en 2.14.
4. de postoperatieve zorg
- Dieren terugkeren naar hun kooien. Zorgen voor een Wohltemperierte sfeer van 37 ° C (bijvoorbeeldmet een infraroodlamp) totdat muizen volledig wakker zijn. Houd vervolgens, muizen in een omgeving van temperatuur - en vocht-gereglementeerde (21 ° C, relatieve vochtigheid van 30% ± 10%). Gratis toegang tot voedsel en drinkwater. Om te vergemakkelijken de vloeibare opname, bieden extra water doordrenkte diervoeder.
- Start postoperatieve analgesie door het injecteren van 0,1 mg/kg lichaam gewicht buprenorfine s.c. Wanneer dieren reactie op mechanische stimulatie vertonen. Wees voorzichtig om te voorkomen dat respiratoire depressie.
- Toeslag drinkwater met 1 mg/mL tramadol voor voortdurende Analgesie, tijdens de eerste week van de postoperatieve.
- Ter compensatie van de verminderde vochtinname wijten aan verminderde mobiliteit, leveren een solide drinken Pad in de kooi tijdens de eerste week van de postoperatieve.
- Wegen van de dieren en de dierlijke gedrag score dagelijks tijdens de eerste week, elke tweede dag tijdens de rest van de eerste maand en elke derde dag tijdens de tweede maand met behulp van de ziekte ernst score beschreven in Kleinwort et al. 6.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Chirurgie wordt goed verdragen, zowel in de experimentele (colostoma) en sham (colotomy) groepen. Perioperatieve sterfte mag niet meer dan 10%, wanneer chirurgie en perioperatieve beheer wordt correct uitgevoerd. In de eerste week van de postoperatieve was wordt significant gewichtsverlies gezien in de experimentele en schijnvertoning groepen. Dieren van de sham-groep bereiken hun gewicht nadir meestal naar de vierde postoperatieve dag, maar het komt op een dag later in de experimentele g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het lymfkliertest model van DC gepresenteerd in dit protocol betrouwbaar reproduceert de histopathologische kenmerken van menselijke DC (b.v., DOVO ontwikkeling van lymfoïde follikels in de submucosa van ontstoken darm segmenten, crypt verkorten en vermindering van de Goblet cel nummers). Afgezien van dit voordeel, dit model wordt veroorzaakt door een zeer vergelijkbaar activerende factor en presenteert met een klinische cursus van matige tot milde Ernst, zoals het geval is in de meest getroffen mensen....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Operatiemateriaal | |||
| heat underlay, 6 watt | ThermoLux, Witte + Sutor GmbH | 461265 | |
| Ethanol 70% (met methylethylketon) | Pharmacie of the University Hospital Greifswald | ||
| Houten applicators, kleine katoenen kop eenzijdig, houten stok, 150 mm lengte | Centramed GmbH, Duitsland | 8308370 | voor desinfectie van operatieveld |
| Schaar | Aesculap (BRAUN) | BC064R | |
| Atraumatische DeBakey-tang | Aesculap (BRAUN) | OC021R | |
| Naaldhouder | Aesculap (BRAUN) | BM012R | |
| Vasofix Safety i.v. canule 22G | Braun Melsungen AG, Duitsland | 4268091S-01 | |
| VICRYL Plus 4-0 violet gevlochten; V-5 17 m 1/2c; 70 cm | ETHICON, Inc. | VCP994H | |
| PDS II 6-0 monofil; V-18 13 mm 3/8c; 70 cm | ETHICON, Inc. | Z991H | |
| BD Plastipak 1 mL (spuit met naald met steriel interieur) | BD Medical | 305501 | |
| Triacid-N (N-Dodecylpropan-1,3-diamin) | ANTISEPTICA, Duitsland | 18824-01 | desinfectie van chirurgische instrumenten in ultrasoon bad |
| Medicijnen | |||
| ketamine 10%, 100 mg/mL (ketaminehydrochloride) | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 9089.01.00 | 87 mg/kg i.p. |
| Xylasel, 20 mg/mL (xylazinehydrochloride) | selectavet, Dr. Otto Fischer GmbH | 400300.00.00 | 13 mg/kg i.p. |
| NaCl 0.9% | Braun Melsungen AG, Duitsland | 6697366.00.00 | |
| Buprenovet 0.3 mg/mL (buprenorfine) | Bayer, Duitsland | PZN: 01498870 | 0.1 mg/kg s.c. |
| Tramal Drops, 100 mg/mL (tramadolhydrochloride) | Grünenthal GmbH, Duitsland | 10116838 | 1 mg/mL drinkwater |
| Ceftriaxon-saar 2 g (ceftriaxon) | Cephasaar GmbH, Duitsland | PZN: 08844252 | 25 mg/kg lichaamsgewicht i.p. |
| metronidazol 5 mg/mL | Braun Melsungen AG, Duitsland | PZN: 05543515 | 12.5 mg/kg lichaamsgewicht i.p. |
| Voeding | |||
| ssniff M-Z Ereich | ssniff, Duitsland | V1184-3 | |
| Solid Drink Dehyprev Vit BIO, zakjes | TripleATrading, Nederland | SDSHPV-75 | |
| Uitrusting | |||
| Nikon Eclipse Ci-L | Nikon Instruments Europe BV, Duitsland | lichtmicroscopie | |
| VetScan HM 5 | Abaxis, USA | 770-9000 | Veterinaire hematologie analyzer van 50 µl veneus EDTA-bloed |
| Bandelin SONOREX (Ultrasoon bad) | Bandelin electronics, Duitsland | RK 100 H | desinfectie van chirurgische instrumenten |
| Software | |||
| NIS-Element BR4 software | Nikon Instruments Europe BV, Duitsland | ||
| GraphPad Prism Version 6 | GraphPad Software, Inc. |
Referenties
- Glotzer, D. J., Glick, M. E., Goldman, H. Proctitis and colitis following diversion of the fecal stream. Gastroenterology. 80, 438-441 (1981).
- Morson, B., Dawson, I. Gastrointestinal Pathology. , Blackwell Scientific Publications. London. (1972).
- Whelan, R. L., Abramson, D., Kim, D. S., Hashmi, H. F. Diversion colitis. A prospective study. Surg Endosc. 8, 19-24 (1994).
- Haas, P. A., Fox, T. A., Szilagy, E. J. Endoscopic examination of the colon and rectum distal to a colostomy. Am J Gastroenterol. 85, 850-854 (1990).
- Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
- Kleinwort, A., Döring, P., Hackbarth, C., Heidecke, C. D., Schulze, T. Deviation of the Fecal Stream in Colonic Bowel Segments Results in Increased Numbers of Isolated Lymphoid Follicles in the Submucosal Compartment in a Novel Murine Model of Diversion Colitis. Biomed Res Int. 2017, 13(2017).
- Tangjarukij, C., Navasumrit, P., Zelikoff, J. T., Ruchirawat, M. The effects of pyridoxine deficiency and supplementation on hematological profiles, lymphocyte function, and hepatic cytochrome P450 in B6C3F1 mice. J Immunotoxicol. 6, 147-160 (2009).
- Soave, O., Brand, C. D. Coprophagy in animals: a review. Cornell Vet. 81, 357-364 (1991).
- Ebino, K. Y., Yoshinaga, K., Suwa, T., Kuwabara, Y., Takahashi, K. W. Effects of prevention of coprophagy on pregnant mice--is coprophagy beneficial on a balanced diet. Jikken Dobutsu. 38, 245-252 (1989).
- Babickova, J., Tothova, L., Lengyelova, E., Bartonova, A., Hodosy, J., Gardlik, R., Celec, P. Sex Differences in Experimentally Induced Colitis in Mice: a Role for Estrogens. Inflammation. 38, 1996-2006 (2015).
- Lee, S. M., Kim, N., Son, H. J., Park, J. H., Nam, R. H., Ham, M. H., Choi, D., Sohn, S. H., Shin, E., Hwang, Y. J., et al. The Effect of Sex on the Azoxymethane/Dextran Sulfate Sodium-treated Mice Model of Colon Cancer. J Cancer Prev. 21, 271-278 (2016).
- Angele, M. K., Pratschke, S., Hubbard, W. J., Chaudry, I. H. Gender differences in sepsis: cardiovascular and immunological aspects. Virulence. 5, 12-19 (2013).
- Brown, R. Z. Social Behaviour, reproduction, and population changes in the house mouse (Mus musculus L). Eccological Monographs. 23, 788-795 (1953).
- Poole, T. B., Morgan, H. D. R. Differences in aggressive behaviour betweeen male mice (Mus musculus L.) in colonies of different sizes. Animal Behaviour. 21, 788-795 (1973).
- Pasquarelli, N., Voehringer, P., Henke, J., Ferger, B. Effect of a change in housing conditions on body weight, behavior and brain neurotransmitters in male C57BL/6J mice. Behav Brain Res. 333, 35-42 (2017).
- Langgartner, D., Foertsch, S., Fuchsl, A. M., Reber, S. O. Light and water are not simple conditions: fine tuning of animal housing in male C57BL/6 mice. Stress. 20, 10-18 (2017).
- Nicholson, A., Malcolm, R. D., Russ, P. L., Cough, K., Touma, C., Palme, R., Wiles, M. V. The response of C57BL/6J and BALB/cJ mice to increased housing density. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, 740-753 (2009).
- Buchler, G., Wos-Oxley, M. L., Smoczek, A., Zschemisch, N. H., Neumann, D., Pieper, D. H., Hedrich, H. J., Bleich, A. Strain-specific colitis susceptibility in IL10-deficient mice depends on complex gut microbiota-host interactions. Inflamm Bowel Dis. 18, 943-954 (2012).
- Nakanishi, M., Tazawa, H., Tsuchiya, N., Sugimura, T., Tanaka, T., Nakagama, H. Mouse strain differences in inflammatory responses of colonic mucosa induced by dextran sulfate sodium cause differential susceptibility to PhIP-induced large bowel carcinogenesis. Cancer Sci. 98, 1157-1163 (2007).
- Mahler, M., Bristol, I. J., Leiter, E. H., Workman, A. E., Birkenmeier, E. H., Elson, C. O., Sundberg, J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274, 544-551 (1998).
- Mekada, K., Abe, K., Murakami, A., Nakamura, S., Nakata, H., Moriwaki, K., Obata, Y., Yoshiki, A. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58, 141-149 (2009).
- Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Vet Pathol. 49, 32-43 (2012).
- Mills, C. D., Kincaid, K., Alt, J. M., Heilman, M. J., Hill, A. M. M-1/M-2 macrophages and the Th1/Th2 paradigm. J Immunol. 164, 6166-6173 (2000).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
