Real-time druk-volume analyse van acuut myocardinfarct in muizen

Samenvatting

Acuut myocardinfarct in muizen induceert acute maar onvolledig gekarakteriseerd veranderingen in functie van left ventriculaire (LV). LV catheterisatie in muizen ondergaan coronaire occlusie fungeert als een nieuwe methode voor een real-time evaluatie van LV functie.

Samenvatting

Acuut myocardinfarct kan leiden tot acuut hartfalen en cardiogeen schok. De evaluatie van hemodynamica is van cruciaal belang voor de beoordeling van een potentiële therapeutische aanpak gericht tegen acute links ventriculaire (LV) dysfunctie. Huidige imaging modaliteiten (bv., echocardiografie en magnetische resonantie beeldvorming) hebben verschillende beperkingen, omdat gegevens over LV druk kan niet direct worden gemeten. LV catheterisatie in muizen ondergaan coronaire occlusie kan dienen als een nieuwe methode voor een real-time evaluatie van LV functie.

Aan het begin van de procedure, waren muizen verdoofd gevolgd door Endotracheale intubatie. Voor LV catheterisatie was de juiste halsslagader blootgesteld via midden-hals snede. De katheter werd geïntroduceerd en geplaatst in de holte van de LV. Linker Thoracotomie werd uitgevoerd en de linker belangrijkste coronaire (LCA) werd afgebonden. Om te induceren reperfusie, werd de hechtdraad uitgebracht na 45 min. druk-volume gegevens te allen tijde werd opgenomen.

Afbinding van de LCA veroorzaakt een afname van de LV systolische functie zoals blijkt uit een vermindering van 30% in volume van de beroerte, LV ejectie fractie (EF) en cardiale output. Maximale dP/dt als parameter voor de LV-contractility was ook aanzienlijk verminderd en diastolische functie was ernstig geschaad (minimale dP/dt-40%). Reperfusie over een periode van 20 min leidde niet tot een volledig herstel van LV functie.

Real-time druk-volume analyse diende als een geldige procedure voor de controle van de hartfunctie tijdens acuut myocardinfarct in muizen. Handhaving van stabiele narcose en een gestandaardiseerde chirurgische aanpak was cruciaal om geldige resultaten te waarborgen. Zoals de vroege fase van acuut myocardinfarct essentieel voor de morbiditeit en mortaliteit is, is de afgebakende methode zou gunstig zijn voor de preklinische evaluatie van nieuwe strategieën voor cardioprotection.

Inleiding

Hart-en vaatziekten is de meest voorkomende doodsoorzaak in de westerse beschaving¹. Acuut myocardinfarct is een kritieke gebeurtenis, die geassocieerd met hoge mortaliteit van acute en chronische^{2 wordt}. Zelfs als revascularisatie is bereikt via noodsituatie percutane coronaire interventie (PCI), blijft de sterfte hoog, met name binnen de eerste 48 uur na aanvang van de symptomen bij patiënten met acuut myocardinfarct³. Cardiogeen schok veroorzaakt door acute afname van de linker ventriculaire (LV) functie is een belangrijke oorzaak voor in het ziekenhuis mortaliteit bij deze patiënten³. Deze vroege vermindering in LV functie wordt veroorzaakt door myocardiale schade na ischemie en reperfusie. Deze zogenaamde ischemie/reperfusie (Ik / R) letsel wordt gemedieerd door veranderingen in de cellulaire metabolome zoals overdreven generatie van reactieve zuurstof soorten^4,5.

Verkennen mogelijke beschermende mechanismen die leiden tot een afname van de myocardiale schade in een preklinische instelling, zijn betrouwbare Muismodellen essentieel met inbegrip van methoden voor evaluatie van post-Ik/R LV functie⁶. In deze instelling, worden transthoracic echocardiografie⁷ en magnetische resonantie beeldvorming (MRI)⁶ veel gebruikt voor functionele fenotypering^8,9. Echter, deze methoden zijn niet geschikt voor de beoordeling van cardiogeen schok in een lopende acuut myocardinfarct en ernstige LV dysfunctie en niet direct gegevens weergeven op LV druk. Het Langendorff-apparaat met behulp van geïsoleerde hart bij een ex vivo test geeft informatie over de onderliggende pathomechanisms van vroege-fase I / R letsel¹⁰. Deze methode is beperkt als gevolg van haar onvermogen om te reproduceren in vivo adaptieve mechanismen zoals regulering van de autonome zenuwstelsel of hormonale verordening en zuur-base homeostase. Er is momenteel geen methode beschikbaar voor een volledige functionele fenotypering van cardiogeen schok en linker ventriculaire dysfunctie tijdens een lopende myocardiale ik / R letsel.

Een gesynchroniseerde aanpak met een combinatie van druk-volume (PV) catheterisatie en voorbijgaande chirurgische links belangrijkste coronaire (LCA) occlusie zou gunstig maar technisch uitdagende. Stabiele extracardiac hemodynamica tijdens I / R letsel zijn essentieel voor geldige resultaten aangezien unstable anesthesie of bloed verlies zwaar de resultaten kan beïnvloeden. Een roman benadering voor hemodynamische fenotypering van I / R schade via LV PV catheterisatie en voorbijgaande LCA occlusie kon brengen nieuwe inzichten op cardiogeen schok en LV dysfunctie in acuut myocardinfarct en dienen als een methode voor de toekomstige analyse op cardioprotection.

Protocol

Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming en naleving van alle relevante regelgeving (' Europees Verdrag voor de bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (richtlijn 2010/63/EU) en de verzorging van de dieren werd overeenkomstig de institutionele richtsnoeren. Alle experimenten zijn uitgevoerd met mannelijke muizen van het C57BL/6JRj op de leeftijd van 6 maanden.

1. voorbereiding

1. Voorbereiding op een chirurgische Microscoop, evenals een verwarming pad en een rectale sonde te controleren van de lichaamstemperatuur. Reinigen en steriliseren van alle chirurgische instrumenten.
2. Voorbereiden 2 stukken van 10 cm 5-0 zijden draad vaartuig afbinding, 5 cm van 6-0 polypropyleen wol en 2 mm silicon buis voor afbinding van de LCA.
3. Bereid de PV cuvette voor de kalibratie van de katheter door het tevoren te verhitten tot 37 ° C en een 100 µL Hamilton spuit gevuld met 15% natriumchloride (NaCl) in H₂O voor zoute kalibratie te bereiden.
4. Plaats de PV katheter (3 cm, 1.4 F) in 37 ° C pre-water verwarmd 0.9% NaCl in H₂O (zoutoplossing) ten minste 30 minuten vóór de meting. De katheter verbinden met de gegevens acquisitie apparaat en sluit het apparaat aan een analoog/digitaal-converter. Beide apparaten op een computer aansluiten.
5. Instellen van de software. Het uitvoeren van software-geleide druk kalibratie en huidgeleiding kalibratie zoals gevraagd door de workflow software-geleide⁸.

2. narcose en analgesie

1. Anesthetize de muis met behulp van ketamine 100 mg/kg lichaamsgewicht en xylazine hydrochloride 10 mg/kg lichaamsgewicht door intraperitoneale injectie. Aan het begin van I / R chirurgie, 0,05 mg/kg lichaam gewicht buprenorfine intraperitoneally te handhaven analgesie beheren.
2. Na 10 min, het uitvoeren van een Endotracheale intubatie met behulp van een katheter van 20 G intraveneuze (iv) en de muis met 40% zuurstof (O₂) en 2% (v) Isofluraan ventileren. Juiste ventilatie parameters (bijvoorbeeld 220 µL beroerte volume, 150/min voor een 25-30 g-C57BL/6JRj-muis) instellen.
3. Continu monitor lichaam via rectale temperatuursonde. Zet de muis op de verwarmde plaat vast met het hoofd die richting van de onderzoeker. Muis normale lichaamstemperatuur is 36,5-38 ° C. Handhaven lichaamstemperatuur binnen 1 graad door aanpassing van de temperatuur van de verhitte plaat.

3. links ventriculaire catheterisatie

1. Desinfecteer borst en hals met drie afwisselende scrubs van betadine en 70% alcohol.  Wachten op huid ontsmettingsmiddel te drogen. Verwijder de borsthaar met behulp van een kleine dierlijke scheersysteem.
2. Het uitvoeren van een longitudinaal mediane snede 10 mm 5 mm onder de onderlip naar het borstbeen met behulp van kleine heelkundige schaar.
3. Het ontleden van het linker en rechter deel van de submandibulaire klier via botte voorbereiding met behulp van een pincet. Aparte spier- en vetweefsel in de regio van de juiste paratracheal om de juiste gemeente halsslagader bloot te stellen. Mobiliseren en scheiden van het schip voor een totale lengte van 5-10 mm van bindweefsel via zorgvuldige botte voorbereiding naast het schip met een gebogen pincet.
   Opmerking: Vermijd mechanische manipulatie van de nervus vagus of de halsslagader lichaam te allen tijde, omdat dit leiden ernstige hypotensie en bradycardie tot kan.
4. De twee bereid zijde draden onder het schip doorgeven. De distale vaartuig met een strakke knoop afbinden en leg een losse knoop op de proximale blootgestelde regio waarmee nog passage van de katheter.
5. De draden van de craniale (strakke) knoop naast het hoofd van de muizen toe te passen van een lichte spanning op het schip, zoals dit de invoering van de katheter vergemakkelijkt vast te stellen. Plaats een hemostat vasculaire klem op het proximale vaartuig proximale van de losse knoop omkeerbaar blokkeren bloeddoorstroming.
6. Het uitvoeren van een wigvormige snede 1 mm proximale aan de craniale knoop te openen van het vaartuig met micro schaar.
   Opmerking: Een kleine daling van bloed geeft goede uitvoering van deze stap.
7. De katheter zorgvuldig voor 10 mm. opname van katheter gegevens invoegen
   Opmerking: Het uitrekken van de incisie met een pincet kan dit proces gemakkelijker maken.
8. Pak de vasculaire klem. Voeg 1-2 druppels zoutoplossing aan de incisie katheter verkeer te vergemakkelijken. Blijven voor de invoering van de katheter voor ongeveer een ander 10 mm. Na het passeren van de proximale knoop met de sensor tip, zet vast de knoop zorgvuldig net genoeg om te voorkomen dat bloed terugvloeiing naast de dunnere gedeelten van de katheter zonder afbreuk te doen aan katheter beweging.
   Opmerking: De grootte van de sensor op het puntje van de katheter voorkomt terugvloeiing van bloed, bij het uitpakken van de vasculaire klem.
9. Voorzichtig blijven plaatsen van de katheter tot druk analyse toont arteriële bloeddruk profiel geeft aan dat de katheter is geplaatst in de aorta (figuur 3A).
   Opmerking: De katheter die het bereiken van de aortaklep wordt aangegeven door een lichte weerstand en pulse-gesynchroniseerde beweging van de katheter.
10. Als ervaren weerstand probeerde door te gaan via de aortaklep, trek de katheter weer 5 mm en advance totdat LV catheterisatie aangegeven zullen worden in een verandering in PV analyse aangezien diastolische druk zullen bereiken 0 - 20 mmHg (figuur 3B). Opmerking wijzigingen in de volume controle op de linker ventriculaire plaatsing van de sensor tip (Figuur 3 c) verder te bevestigen. De proximale knoop meer strak vast om te voorkomen dat de katheter beweging.

4. ischemie/reperfusie chirurgie

1. Huid incisie van caudal borstbeen richting de linker oksel voor een totale lengte van 15 mm. Ga verder met botte voorbereiding van de lagen twee spier uitvoeren, totdat de ribben kunnen worden gevisualiseerd.
2. Open de thorax via incisie tussen de derde en vierde links rib. Gebruik chirurgische haken toegang te krijgen tot het hartzakje. Resect het hartzakje boven het hart. Voordat u verdergaat met Afbinding van de LCA, wachten 30 s zonder het aanraken van het dier aan PV-recordgegevens voor geldige analyse.
3. Lokaliseer de LCA opkomende onder de linker oorschelp en aflopende aan de linker kant van het hart naar de top. Gebruik een 6-0 polypropyleen hechtdraad te omsingelen van de slagader met een lus 2 mm onder de linker oorschelp. Plaats een buis van de kleine silicium onder de lus en plaats van een strakke knoop hierboven.
   Opmerking: Distale myocard draaien grijs fungeert als positieve controle voor LCA occlusie⁶. Ik / R operatie moet worden uitgevoerd binnen 5 min onafhankelijk van de operationele onderzoeker.
4. Snijd de hechtdraad op 1 mm lengte. Laat de chirurgische haken en handmatig sluiten de spier lagen boven de incisie. 45 min wachten terwijl de continu opname PV gegevens.
5. Na 45 min, opnieuw open de incisie en verwijder de silicium-buis om te induceren reperfusie. Registratie van de gegevens voor een ander 20 min.
   Opmerking: Een wijziging in een rode kleur gezien voordat ischemie geeft succesvolle reperfusie.

5. kalibratie

Opmerking: De kalibratie van de katheter PV-systeem bestaat uit 4 verplichte stappen, waarvan er twee uitgevoerd moeten worden na de meting. Kalibratie moet worden herhaald na elk experiment om geldige resultaten te waarborgen.

1. Druk Kalibratie en geleidbaarheid kalibratie voordat het experiment zoals beschreven in stap 1.5 uitvoeren.
2. Zoute kalibratie uitvoeren wanneer de katheter nog steeds in het linkerventrikel geplaatst is nadat het experiment zelf is voltooid. Lokaliseer de juiste halsslagader dwarskrachten van de halsslagader in de voorbereide omgeving. Injecteren van 10 µL 25% NaCl in H₂O via een Hamilton syringe terwijl opnamegegevens.
3. Bereken de kalibratie met behulp van de software van de verwerving door te wijzen op de opgaande fase in de volumecurve (figuur 5C). Herhaal dit proces voor een totaal van 3 keer. Vermijd verlies van bloed nadat spuit extractie met behulp van een vasculaire klem te snel het comprimeren van de punctie.
4. Volume kalibratie om te kalibreren van volume data-acquisitie door analyse van gestandaardiseerde volumes uitvoeren Ongeveer 500 µL muis bloed verkrijgen bij cardiale punctie met een spuit van 1 mL EDTA iets (b.v., 5 µL per 200 IE heparine). Terugtrekken van de PV-katheter 10-15 mm om te voorkomen beschadiging van de katheter.
5. Vul het verkregen bloed in de 37 ° C voorverwarmde kalibratie cuvette (figuur 5A). Vermijd bellen als het met de resultaten interfereren kan. Het uiteinde van de katheter in elk goed en record gegevens toevoegen. Het verkrijgen van een standaard curve door software-geleide analyse (figuur 5B). Herhaal dit proces voor een totaal van 3 keer.
6. Euthanaseren muizen door exsanguination of cervicale dislocatie terwijl voldoende Isofluraan anesthesie te allen tijde wordt gehandhaafd.

6. de gegevensanalyse

1. Na het voltooien van de meetfrequenties, door software-geleide data analyses uit te voeren. Daarom, Markeer de juiste sectie (ten minste tien cycli) binnen de sectie van het analyseren van de PV Workflow en basislijn analyses uit te voeren. Cycli met afwijkingen vanwege ventilatie of manipulatie uitsluiten, indien noodzakelijk (figuur 3D).
2. PV baseline-analyse voor passage van de aortaklep (arteriële druk alleen), onmiddellijk vóór en na de LCA occlusie uitvoeren Gaan door het PV baseline-analyse uitvoeren en in intervallen van 5 min. tijdens ischemie en na reperfusie. Aan het einde van het experiment, analyse van gegevens van de druk na intrekking van de katheter uit het linkerventrikel (arteriële druk).
3. Analyseren van ten minste 10 opeenvolgende cycli om bemonstering fout te vermijden. Wanneer sterke inmenging van ervaren verkregen waarden met de ventilatie, de tijdelijke onderbreking van de ventilatie voor een maximum van 5 s kan worden beschouwd.
4. Gebruik de volgende parameters die zijn berekend in de Baseline-analyse (figuur 3D) te karakteriseren LV functie:
   1. Beroerte volume (µL)
   2. Ejectie Fractie: beroerte volume / eind-diastolische volume (%)
   3. Cardiale output: beroerte volume * hartslag (µL/min)
   4. Cardiale index: Cardiac output / body oppervlakte (µL/(min*cm²)
   5. Beroerte werk: Inner gebied van PV curve (mmHg * µL)
   6. Maximale druk (Pmax); Gemiddelde druk (Pmean)
   7. Max dP/dt (mmHg/s) als een parameter van LV systolische functie
   8. min dP/dt (mmHg/s) als parameter voor de naleving van de LV
   9. Tijdconstante van isovolumetric ontspanning: Tau (ms)

Resultaten

Na LV catheterisatie, werd omkeerbare Afbinding van de LCA uitgevoerd voor 45 min, gevolgd door 10 min van reperfusie. PV gegevens werd helemaal opgenomen tijden (Figuur 1).

Juiste plaatsing van de PV-katheter werd bevestigd door het verkrijgen van de karakteristieke LV PV grafiek (figuur 2A). LV katheter plaatsing bleek de typische ventriculaire drukbereik met een mini...

Discussie

PV toezicht op LV hemodynamica in acuut myocardinfarct fungeert als een nieuwe methode voor real-time in vivo beoordelingvan cardiogeen schok en verminderde LV functie i / R letsel. PV catheterisatie bieden een breed spectrum aan parameters met betrekking tot LV systolische en diastolische functie. Naast de LV volumetrische parameters meestal verkregen door echocardiografie of MRI (kamer volumes, EF, beroerte volume en cardiale output), levert PV analyse een vollediger Profiel van LV functie doordat tegelijkerti...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Betaisodona Loesung	Mundipharma	4162-1606/89x30mm	Povidon-Iod
Calibration cuvette	Millar instruments	910-1049	Calibration cuvette
Contura professional hair trimmer	Wella	HS-60	Klein dieren scheersysteem
Eclipse Needle 27G	BD	REF 305770	27G naald
Forceps	FST	11203-25, 11069-08, 11616-15, 11506-12, 11051-10	Chirurgische forceps
Forceps	Aesculap Braun	BN731R, BD 311R	Chirurgische forceps
Foris FS2434	Eizo	0FTD2033	Monitor
Hamilton Syringe 100 µl needle	Hamilton	80621	100µl spuit met naald
Heated Small animal OP table	Harvard Apparatus	15001	Verwarmde operatietafel
Heparin-Natrium 25000	Ratiopharm	N68542.04	Heparine
Ketamin 10% 100 mg/ml	bela-pharm	FS1670041	Ketamin
Labchart Pro 8 + Pro modules	AD Instruments	MLS260/8	PV data-analysesoftware
LAS EZ	Leica	LAS EZ	Microscoopcamerasoftware
Leica IC80 HD	Leica	IC80 HD	Microscoopcamera
Leica M80	Leica	M80	Microscoop
Micro-tip catheter transducer	Millar instruments	SPR-839	PV katheter
MiniVent	Harvard Apparatus	845	ventilatie
MPVS Ultra	Millar instruments	PL3508B48/M	PV katheter data-acquisitieapparaat
Octenisept	Schülke	20000832-A	ontsmettingsmiddel
Plastipak 1ml	PD	REF 303172	1ml spuit
PowerLab 8/35	AD Instruments	PL3508	analoog/digitaal converter
Prolene 6-0	Ethicon	XNEH7814.P31	Polypropyleennaad
Retraction Kit	FST	18200-20	retractie van chirurgische situs
Seraflex 5-0	Naila	IC108000	zijdena naad
Small and micro-scissors	FST Essen	14059-11, 15007-08, 14064-11	Chirurgische schaar
Small silicon tube	Reichelt Chemietechnik		buis voor LCA-occlusie
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Natriumchloride
testo 108	testo	5631080	rectale thermometer
Thinkcentre desktop computer	Lenovo	PC0EJS2V	Computer
Vasofix Safety 20G	Braun	4269110S-01	intubatiekatheter
Windows 10	Microsoft	KW9-00240	Besturingssysteem
Xylazin 2%	Ceva	6324464.00.00	Xylazin hydrochloride