Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

Summary

Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.

Abstract

In talrijke biologische contexten moeten dierlijke cellen fysiek interageren met hun omgeving door de ontwikkeling van mechanische krachten. Onder deze, tractie krachten goed gekarakteriseerd zijn geweest, maar er is een gebrek aan technieken waardoor de meting van uitsteeksel krachten uitgeoefend door cellen orthogonaal op hun ondergrond. We ontwierpen een experimentele opstelling het uitsteeksel krachten uitgeoefend door Adherente cellen aan hun substraat te meten. Cellen verguld op een compatibele Formvar vel vervormen dit substraat en de resulterende topografie wordt toegewezen door atomaire kracht microscopie (AFM) op de nanometerschaal. Geldende waarden worden vervolgens geëxtraheerd uit een analyse van het profiel van de vervorming op basis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren. Vandaar, de door de individuele vooruitstekende eenheden van een levende cel uitgeoefende krachten kunnen worden gemeten na verloop van tijd. Deze techniek kan de studie van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel. Hier beschrijven we de toepassing de protrusive krachten gegenereerd door podosomes gevormd door menselijke macrofagen te meten.

Introduction

Dierlijke cellen interactie fysiek met de matrix en de andere cellen die hun omgeving¹vormen. Dit is vereist voor hen om te migreren, internaliseren van organen, externe informatie verwerven of differentiëren. In dergelijke processen, de cel mechanische krachten moet genereren en, zoals tal van studies hebben getoond in de afgelopen jaren, de mogelijkheid van een cel te genereren van krachten en sonde zijn omgeving beïnvloedt de biologische werking, leiding bijvoorbeeld proliferatie of differentiatie^2,3. Op zijn beurt, is de meting van cellulaire krachten een grote steun te bestuderen v....

Protocol

1. bereiding van Formvar beklede rasters

1. Elektronenmicroscopie rasters met pure aceton schoon en droog ze op filterpapier. Vervolgens schoon een microscoopglaasje met pure ethanol, veeg met een lens papier en verwijder stof met een blower.
2. Plaats een glasplaatje met ethanol-schoongemaakt, verticaal in de trechter van een film gieten apparaat met een oplossing van Formvar in het onderste deel. Betrekking hebben op de top van de trechter.
3. Pomp 100 mL oplossing van Formvar (0,5% in ethyleendichloride) met de verstuiver lamp, totdat het niveau tweederde van de dia bereikt.
4. Houd de dia in de oplossing voor 1 min.
5. Open de kl....

Results

Het bovenstaande protocol beschrijft hoe voor te bereiden van de experimentele opstelling te kwantificeren uitsteeksel krachten door macrofaag podosomes op een substraat Formvar toegepast. Dit wordt bereikt met behulp van AFM en wordt geïllustreerd in Figuur 1.

Bij het analyseren van een topografische beeld van uitstulpingen onder podosomes de JPK gegevensverwerking softwarematig, moet een derdegraa.......

Discussion

Materiaaleigenschappen

De keuze van het materiaal voor het vervormbare membraan, in ons geval Formvar, moet aan een aantal voorwaarden voldoen. Het materiaal moet worden transparant voor zichtbaar licht en fluorescentie vertonen beperkte auto zodat opmerkingen in helder veld en fluorescentie microscopie. De ruwheid van de dunne film moet goed minder dan 10 nm te vermijden topografische effect op cel adhesie en duidelijke observatie van de cel-geïnduceerde uitsteeksels door AFM.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 mesh nickel grids	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filter paper	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscope slides	Fisher Scientific	10235612
White stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Film casting device with valve in its outlet	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Razorblades	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Acetone	VWR	20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm coverslips	VWR	631-0666
Inverted microscope	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomic Force Microscope	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder	JPK Instruments	BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Double-sided adhesive tape	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes	WPI	FD35-100