Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

Samenvatting

Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.

Samenvatting

In talrijke biologische contexten moeten dierlijke cellen fysiek interageren met hun omgeving door de ontwikkeling van mechanische krachten. Onder deze, tractie krachten goed gekarakteriseerd zijn geweest, maar er is een gebrek aan technieken waardoor de meting van uitsteeksel krachten uitgeoefend door cellen orthogonaal op hun ondergrond. We ontwierpen een experimentele opstelling het uitsteeksel krachten uitgeoefend door Adherente cellen aan hun substraat te meten. Cellen verguld op een compatibele Formvar vel vervormen dit substraat en de resulterende topografie wordt toegewezen door atomaire kracht microscopie (AFM) op de nanometerschaal. Geldende waarden worden vervolgens geëxtraheerd uit een analyse van het profiel van de vervorming op basis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren. Vandaar, de door de individuele vooruitstekende eenheden van een levende cel uitgeoefende krachten kunnen worden gemeten na verloop van tijd. Deze techniek kan de studie van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel. Hier beschrijven we de toepassing de protrusive krachten gegenereerd door podosomes gevormd door menselijke macrofagen te meten.

Inleiding

Dierlijke cellen interactie fysiek met de matrix en de andere cellen die hun omgeving¹vormen. Dit is vereist voor hen om te migreren, internaliseren van organen, externe informatie verwerven of differentiëren. In dergelijke processen, de cel mechanische krachten moet genereren en, zoals tal van studies hebben getoond in de afgelopen jaren, de mogelijkheid van een cel te genereren van krachten en sonde zijn omgeving beïnvloedt de biologische werking, leiding bijvoorbeeld proliferatie of differentiatie^2,3. Op zijn beurt, is de meting van cellulaire krachten een grote steun te bestuderen van de regulering van de strijdkrachtgeneratie en begrijpen de implicatie in cel gedrag en weefsel lot^4,5.

De afgelopen jaren getuige geweest van de ontwikkeling van talrijke technieken voor het meten van de krachten die een cel op de omgeving-^{6 uitoefenen kan}. De meerderheid van deze geweest instrumenteel in het openbaren van dat de tractie dwingt dat cellen uitoefenen als zij trek op mobiele sondes of een vervormbare substraat. Echter de mechanische krachten die betrokken zijn in uitsteeksel in de extracellulaire omgeving lijden onder een gebrek aan meettechnieken en zijn tot nu toe niet goed gekenmerkt.

Om deze beperking ondervangen, presenteren we een methode voor het meten van krachten uitgeoefend orthogonaal op de ondergrond. Het bestaat uit het plating levende cellen op een dunne elastische blad dat in de orthogonale richting vervormen kan, waardoor het mogelijk is om te meten van substraat vervorming door de cellen en het afleiden van de krachten die betrokken zijn. Topografie van het substraat wordt gemeten met de nanoschaal resolutie met behulp van atomaire kracht microscopie en de evaluatie van de troepen uit vervorming is gebaseerd op de kennis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren^7,-^{8, 9}.

Hier beschrijven we de opstelling en de toepassing ervan voor het meten van de krachten die worden gegenereerd door podosomes, protrusive hechting structuren gevormd door macrofagen voor hun mesenchymale migratie in driedimensionale omgevingen^{10,11, 12,13,14,15,16,17}. Wij zijn van mening dat deze techniek het begrip van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel zal vooraf.

Protocol

1. bereiding van Formvar beklede rasters

1. Elektronenmicroscopie rasters met pure aceton schoon en droog ze op filterpapier. Vervolgens schoon een microscoopglaasje met pure ethanol, veeg met een lens papier en verwijder stof met een blower.
2. Plaats een glasplaatje met ethanol-schoongemaakt, verticaal in de trechter van een film gieten apparaat met een oplossing van Formvar in het onderste deel. Betrekking hebben op de top van de trechter.
3. Pomp 100 mL oplossing van Formvar (0,5% in ethyleendichloride) met de verstuiver lamp, totdat het niveau tweederde van de dia bereikt.
4. Houd de dia in de oplossing voor 1 min.
5. Open de klep van het apparaat voor de afvoer van de Formvar-oplossing in een gestage stroom. Een debiet van 10 tot 15 mL/s levert een film van de Formvar van 30-80 nm. De dikte van de film wordt bepaald door de concentratie van de oplossing van de Formvar en het tarief van de riolering.
   Opmerking: Het tarief van de drainage kan worden gecontroleerd door de ontluchting de druk via het ventiel lucht-out door het ventiel langzaam te openen. Hoe sneller de drainage, hoe dikker de film. In de praktijk, want het is moeilijk te voorspellen de laagdikte van het debiet van de Formvar, wij bereiden meerdere batches van Formvar films en controle van hun dikte door de AFM (zie stap 2).
6. Verwijderen van de dia uit de zaal en droog het fijn op filterpapier te verwijderen van een vloeibare Formvar.
7. Knip een rechthoek 20 x 50 mm uit de Formvar film met een scheermesje.
8. Vul een bekerglas met zuiver gedestilleerd water en langzaam duik de dia verticaal in het water te zweven uit de film: de film moet drijven op het wateroppervlak.
9. Plaats droge aceton gereinigd rasters op de film, glanzende onder ogen zien.
10. Plaats een ronde glazen dekglaasje aan (Ø 12 mm) op een paar van de rasters. Deze dekglaasje aan zal dienen om de laagdikte te meten (zie stap 2).
11. Bedek een microscoopglaasje met een witte sticker aangepast zodat het past. Dompel de dia verticaal aan de grens van de zwevende Formvar film totdat de hele film houdt zich aan de dia. Verwijderen van overtollig water uit de dia met filtreerpapier en laten drogen bij kamertemperatuur 's nachts.

2. meting van de laagdikte

1. Snijd de Formvar rond het dekglaasje aan met een pincet om het loskoppelen van de dia.
2. De locatie van het raster onder het dekglaasje aan Markeer met een pen.
3. Snijd de Formvar rond de gemarkeerde raster om het loskoppelen van het dekglaasje aan. Er zal dus een gat in de resterende Formvar blad, dat toelaten zal om de laagdikte te meten. Bedek het dekglaasje aan met PBS en plaats het op een glasplaatje op de Microscoop.
4. Monteer een siliciumnitride cantilever op het AFM glazen blok, ervoor te zorgen dat de gouden streep wordt niet gedekt door het uiteinde van de veer.
   Opmerking: De gevoeligheid en de lente-constante van de uitkraging moeten hebben eerder gekalibreerd in PBS.
5. Monteren van het blok glas op de AFM-module en plaats vervolgens de module naar de Microscoop.
6. Plaats de Formvar beklede dekglaasje aan op de kamer observatie en bedek het met 500 µL van PBS.
7. Scannen van de rand van het gat in het blad van de Formvar met behulp van AFM in contact modus en een 0.5 nN kracht instelpunt.
8. Gebruik het glasoppervlak dekglaasje aan als de referentie voor hoogte metingen, en evalueren van de dikte van de Formvar als de hoogte van de dwarsdoorsnede (uitvoeren ten minste 10 metingen per Formvar partij).

3. enten van cellen op rasters

1. Onder een steriele motorkap, zetten een strook (12 mm x 3 mm) van dubbelzijdige plakband een dekglaasje aan.
2. Knip uit een raster van Formvar-coating met een pincet en leg het ondersteboven op de zelfklevende strip (alleen de rand van het raster moet worden aangesloten op de tape). De film van de Formvar moet onder ogen zien het dekglaasje aan.
3. Dit apparaat op een cultuur goed zetten.
4. Plaats een droplet 10 µL van RPMI zonder FCS met 10⁴ macrofagen onderscheiden van menselijke monocyten¹⁶.
   Opmerking: Zorg ervoor dat niet aan te raken van het raster met de pipet tip Voorkom beschadiging van de Formvar-coating.
5. Incubeer gedurende 30 min (37 ° C, 5% CO₂) om te laten cellen houden.
6. Vul de put met 2 mL RPMI met 10% FCS.
7. Laat het apparaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO₂ cellen houden voordat AFM observatie laten inwerken.

4. topografie metingen van Podosome-geïnduceerde vervormingen

1. Plak twee stroken plakband verdubbeld-zijdige op een glazen bodem petrischaal.
   Opmerking: De afstand tussen de twee stroken moet kleiner zijn dan de diameter van het raster.
2. Zorgvuldig het loskoppelen van de grid verguld met macrofagen van het plakband.
3. Schakel het raster ondersteboven om de cellen tegenover het glas en plak het net tussen de twee zelfklevende strips.
4. Fix het raster met twee nieuwe strips van een double-sided lijm: de grid zal dus worden ingeklemd tussen twee zelfklevende strips, toegankelijk naar de AFM tip verlaten van het centrale gedeelte van het raster.
   Opmerking: Zorg ervoor dat het raster is goed vast en niet verdraaid; anders misschien de AFM uitkraging niet zitten kundig voor aanpak van het Formvar oppervlak.
5. Vul de petrischaal met 2 mL van het kweekmedium voorverwarmde 37 ° C (RPMI met 10% FCS) aangevuld met 10 mM HEPES (pH 7.4).
6. Zet de schotel van cultuur op een 37 ° C schotel verwarmingssysteem.
7. Installeer de schotel kachel in het werkgebied van de AFM.
8. Laat het systeem stabiliseren bij 37 ° C.
9. Breng een eerste globale beeld te vinden podosomes in contact modus met een 0.5 nN kracht, en vervolgens scannen de topografie van de Formvar bij 3 Hz met een ongeveer 20 nm-grote pixel.
   Opmerking: Vermijd scannen in de buurt van de randen van het raster.

Resultaten

Het bovenstaande protocol beschrijft hoe voor te bereiden van de experimentele opstelling te kwantificeren uitsteeksel krachten door macrofaag podosomes op een substraat Formvar toegepast. Dit wordt bereikt met behulp van AFM en wordt geïllustreerd in Figuur 1.

Bij het analyseren van een topografische beeld van uitstulpingen onder podosomes de JPK gegevensverwerking softwarematig, moet een derdegraa...

Discussie

Materiaaleigenschappen

De keuze van het materiaal voor het vervormbare membraan, in ons geval Formvar, moet aan een aantal voorwaarden voldoen. Het materiaal moet worden transparant voor zichtbaar licht en fluorescentie vertonen beperkte auto zodat opmerkingen in helder veld en fluorescentie microscopie. De ruwheid van de dunne film moet goed minder dan 10 nm te vermijden topografische effect op cel adhesie en duidelijke observatie van de cel-geïnduceerde uitsteeksels door AFM...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
200 mesh nikkel roosters	Electron Microscopy Sciences	G200-Ni
Filterpapier	Sigma-Aldrich	1001-055
Microscoopglaasjes	Fisher Scientific	10235612
Witte stickers 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Filmgietapparatuur met klep in de uitlaat	Electron Microscopy Sciences	71305-01
Vleesmessen	Electron Microscopy Sciences	72000
Ethanol	VWR	1.08543.0250
Aceton	VWR	20066.321
Formvar 0,5% oplossing in ethyleendichloride	Electron Microscopy Sciences	15820
12 mm dekglasjes	VWR	631-0666
Omgekeerd microscoop	Carl Zeiss	Axiovert 200
Atomaire krachtmicroscoop	JPK Instruments	NanoWizard III
Temperatuurgestuurde monsterhouder	JPK Instruments	BioCell
Siliciumnitride cantilever met een nominale veerconstante van 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Dubbelzijdig plakband	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm glazen bodem Petri-schaaltjes	WPI	FD35-100