Methodenartikel

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

5.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

27 maart 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Samenvatting

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende bron van de cel voor regeneratieve geneeskunde en een platform om menselijke ontwikkelings processen te bestuderen. Stapsgewijs geregisseerd differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert is een van de belangrijkste manieren om het genereren van pancreatic cellen, met inbegrip van de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) alvleesklier voorlopercellen. Conventionele protocollen starten de differentiatie met kleine kolonies kort na de passage. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor heterogeniteiten, die zouden kunnen de differentiatie naar PDX1 belemmeren+ cellen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1+ cellen. Het protocol bestaat uit vier stappen en initieert de differentiatie door seeding gedissocieerde afzonderlijke cellen. De inductie van SOX17+ definitieve endoderm cellen werd gevolgd door de expressie van twee primitieve gut buis markeringen, HNF1β en HNF4α en eventuele differentiatie in PDX1+ cellen. Dit protocol biedt eenvoudige bediening kan verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt in endodermal lineages of PDX1+ cellen.

Inleiding

De alvleesklier bestaat voornamelijk uit exocrine en endocriene cellen, en zijn dysfunctie of overbelasting veroorzaakt verschillende ziekten, zoals diabetes, pancreatitis en alvleesklierkanker. Om het verhelderen van de pathogeny van pancreatopathy, is het noodzakelijk om te analyseren de ontwikkelingstoxiciteit proces en functie van cellen van de alvleesklier. Daarnaast is de levering van een stabiele cel met robuuste kwaliteit vereist om de cellen/weefsels suppletie therapie. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende cel bron voor deze doeleinden, en het protocol van de differentiatie naar pancreatic cellen is intensief bestudeerde1,2,3, 4. Recente vooruitgang in de in vitro generatie van cellen van de alvleesklier β bootsen de generatie van de β-cellen in menselijke volwassene, en deze cellen Toon therapeutische werking na implantatie in diabetische model muizen2,3. Bovendien, bleek het onderzoek van de β-cellen gegenereerd op basis van de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van gezonde en type 1 diabetes patiënt donoren geen functionele verschillen waaronder wanneer stress5. Ziekte fenotypen hebben bovendien gedeeltelijk weergegeven in geïnduceerde pancreatic cellen met patiënt afkomstige iPSCs of hPSCs herbergen genetische mutaties in dezelfde site als de patiënten6,7.

Voor het genereren van pancreatic cellen uit hPSCs, wordt stapsgewijze gestuurde differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert gebruikt. De alvleesklier is afgeleid van de endoderm laag van het vroege embryo, die spreekt van geslacht bepalen regio Y-vak 17 (SOX17) en forkhead vak A2 (FOXA2)8. Op basis van de studies van de muis, vormt de endodermal laag de primitieve gut buis, die wordt gekenmerkt door de uitdrukking van de hepatocyte nucleaire factor 1-beta (Hnf1β) en hepatocyte nucleaire factor 4-alpha (Hnf4α). De primitieve gut buis kieuwopeningenvorm en ontwikkelt zich tot de respiratoire toestellen, maagdarmkanaal en organen. Na de rek, de achterste voordarm gebied wordt de vermoedelijke alvleesklier regio, zoals aangegeven door de expressie van het transcriptionele factor alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1 (PDX1)8,-9,10. De dorsale en ventrale delen van de PDX1+ gut buis dikker aan formulier alvleesklier toppen, die worden gekenmerkt door de co uitdrukking van alvleesklier transcriptie factor 1 subeenheid alpha (PTF1A) en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Deze expressie is de morfologische begin van alvleesklier organogenese. Alvleesklier endoderm cellen, die onderdelen van de alvleesklier toppen, vormen een vertakte buisvormige netwerk van epitheliale structuren12 en uiteindelijk in exocrine en endocriene cellen, met inbegrip van de β-cellen insuline-afscheidende onderscheiden en glucagon-afscheidende α-cellen. Uitdrukking van PDX1 wordt eerst gedetecteerd bij de vermoedelijke alvleesklier regio, die vervolgens wordt waargenomen gedurende de gehele ontwikkeling van de alvleesklier, en toont localization voor β - en δ-cellen9,13,14. Hoewel de Pdx1+ cel gebied dat doet niet express Ptf1a of Nkx6.1 onderscheidt in het antrum maag, twaalfvingerige darm, extrahepatic gal duct en sommige intestinale cellen in de midden tot late stadium van ontwikkeling in muizen9, PDX1+ cellen worden beschouwd als van de progenitoren van de alvleesklier de vroeg developmental stadium bij de mens.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1+ cellen voor de generatie van de alvleesklier geslachten. Het protocol initieert differentiatie door zaaien losgekoppeld afzonderlijke cellen15,16,17. In het algemeen, ongedifferentieerde hPSCs worden onderhouden als kolonies of cel aggregaten in suspensie of in hechting. Dientengevolge, starten de meeste protocollen de differentiatie kort na passaging. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor ruimtelijke en transcriptionele heterogeniteiten18,19,20,21,22, die zouden kunnen belemmeren de eerste stap van de differentiatie naar definitieve endoderm gevolgd door inefficiënte differentiatie naar PDX1+ cellen. Dit protocol kan bieden gemakkelijk te hanteren om te verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt aan endodermal geslachten en PDX1+ cellen23, 24 , 25.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Experimenten met behulp van de hPSCs werden goedgekeurd door de ethische commissie van de afdeling van de geneeskunde en de Graduate School of Medicine, Kyoto University.

1. voorbereiding van de materialen

Opmerking: Alle media en reagentia voorbereiden op celcultuur in een steriele omgeving. Opwarmen basis voedingsbodems tot kamertemperatuur (RT) vóór gebruik. Medium voor differentiatie wordt gebruikt binnen 6 uur op RT. Details van de reagentia worden vermeld in de Tabel van materialen.

  1. Differentiatie (figuur 1A)
    1. Stadium 1A medium: Transfer RPMI 1640 medium in een buis met behulp van een precisiepipet. Voeg toe de serumvrij supplement, activin A, CHIR99021 en Y-27632 tot een concentratie van 1 x, 100 ng/mL, 3 μM en 10 μM, respectievelijk.
    2. Stadium 1B medium: Transfer RPMI 1640 medium in een buis met behulp van een precisiepipet. Voeg het serumvrij supplement, activin A en CHIR99021 tot een concentratie van 1 x 100 ng/mL, ≤1 μM, respectievelijk.
      Opmerking: De concentratie van CHIR99021 moet lager zijn dan in fase 1A medium, en toevoeging is niet nodig, maar het verhoogt het nummer van de cel.
    3. Fase 2 medium: overdracht verbeterd MEM (iMEM) medium in een buis met behulp van een precisiepipet. Voeg de serumvrij supplement en Keratinocyt groeifactor (KGF) tot een concentratie van 0,5 x en 50 ng/mL, respectievelijk.
    4. Fase 3 medium: overbrengingsmedium iMEM in een buis met behulp van een precisiepipet. Voeg het serumvrij supplement, KGF, BEKERTJE, 3-Keto-N-aminoethyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) en 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic zuur (TTNPB) door de pipet te concentraties van 0,5 x 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM en 10 nM, respectievelijk.
  2. Stroom cytometry (FCM)
    1. 1 x Permeabilization/afwas buffer: overbrengen van water in een buis met een pipet. Permeabilization/afwas buffer door een pipet aan een concentratie van 1 x toevoegen.
    2. FCM blokkeren oplossing: 1 x Permeabilization/afwas buffer overbrengen in een buis met een pipet. Ezel serum door een pipet aan een concentratie van 2% (vol/vol) toevoegen.
  3. Immunokleuring
    1. Het blokkeren van de oplossing: de overdracht Dulbecco Phosphate-Buffered zout (DPBS) in een buis met een pipet. Voeg ezel serum en Triton X Pipetteer aan concentraties van 5% (vol/vol) en 0,4% (vol/vol), respectievelijk.

2. hPSC differentiatie naar Posterior voordarm cellen/Pancreatic progenitoren (PDX1+ cellen)

Opmerking: Het gedrag van alle procedures met behulp van steriele technieken. hPSCs worden bijgehouden op 6-Wells-platen bekleed met een synthetische materiaal van het oppervlak voor hPSCs met hPSC onderhoud medium volgens de fabrikant instructies17,26. Wanneer cellen bereiken 50-80% confluentie (fase 0) ze gebruiken voor differentiatie.

  1. Bereiden kelder membraan matrix beklede platen.
    1. Overdracht RPMI 1640 (4 °C) in een buis 6 mL afgekoeld tot 4 °C op ijs. Voeg 2 mg van kelder membraan matrix (4 °C) met gekoeld 1 mL-pipet tips en meng goed door zachte pipetteren zodat 0.33 mg/mL kelder membraan matrix.
    2. Pipetteer 2 mL van verdunde kelder membraan matrix aan elk putje van 6-well cel cultuur platen door een pipet. Plaats de platen bij 37 °C gedurende 60-90 min. in een broedmachine. Houd daarna de platen op RT tot gebruik (binnen 3 uur).
  2. Zaad van de hPSCs en initiëren van differentiatie aan definitieve endoderm (fase 1A).
    1. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg 2 mL 0,5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (RT) per putje Pipetteer te wassen de hPSCs gekweekt in de 6-Wells-platen.
    2. Gecombineerd 0.5 mM EDTA en voeg 2 mL 0,5 mM EDTA per putje Pipetteer. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    3. Gecombineerd 0.5 mM EDTA en voeg vervolgens 1 mL van hPSC onderhoud medium op RT aangevuld met 10 μM Y-27632 per goed door pipet. Pipetteer zachtjes maar snel om te blazen uit de gekoppelde cellen op de platen en distantiëren geklonterd cellen in afzonderlijke cellen. De celsuspensie niet bubble tijdens pipetteren.
    4. Spoel de celsuspensie in een tube van 50 mL centrifuge met 4 mL hPSC onderhoud medium bij RT aangevuld met 10 μM Y-27632. Pipetteer zachtjes de celsuspensie.
    5. Tellen van het aantal cellen in de celsuspensie met behulp van de Trypan blauw procedure voor de uitsluiting van de vlek.
      1. Mix 15 μl celsuspensie en 15 μL van Trypan blauw in een buis.
      2. Breng 10 μL van de celsuspensie verdund met Trypan blauw naar cel tellen van dia's in tweevoud door een 10 μL pipet.
      3. Tellen de cel nummer met een automatische cel teller en berekenen van de celdichtheid in de celsuspensie. Levensvatbaarheid is meestal > 98%.
    6. Aliquot de celsuspensie in een centrifugebuis 50 mL op 1-1,5 x 106 cellen per putje van 6-Wells-platen (1-1,5 x 105 cellen/cm2).
    7. Centrifugeer de tube 50 mL bij 200 x g bij RT gedurende 5 minuten.
    8. De bovendrijvende vloeistof met behulp van een precisiepipet gecombineerd en resuspendeer de cellen met 1 mL van fase 1A medium (RT) per putje. Zachtjes de celsuspensie Pipetteer en voeg een ander 1 mL van fase 1A medium (totaal, 2 mL per putje).
    9. De matrix van de verdunde kelder membraan in de putten van de cel cultuur platen in stap 2.1.2 bereid door een 1.000 μL pipet gecombineerd. Ga naar de volgende stap onmiddellijk.
    10. Pipetteer zachtjes de celsuspensie in stap 2.2.8 opnieuw. Breng de celsuspensie (2 mL) in elk putje van de plaat van een 6-well onmiddellijk na het mengen. De afdekplaat met een aluminiumfolie aan de plaat beschermen tegen licht. Plaats de plaat in de schone Bank op RT voor 10-15 min.
      Opmerking: Verplaats de plaat niet na het zaaien.
    11. Voorzichtig plaats de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator (bevochtigde sfeer) en cultuur gedurende 24 uur.
      Opmerking: De plaat niet schudden na het zaaien.
  3. Het veroorzaken van de differentiatie in definitieve endoderm (fase 1B).
    1. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg toe 2 mL van DPBS aan de putjes Pipetteer. Herhaal de aspiratie en de toevoeging van DPBS één keer.
      Opmerking: Om alle dode cellen verwijdert de enkelgelaagde, schud zachtjes de plaat voor elke aspiratie.
    2. De gebruikte DPBS gecombineerd met een pipet en voeg 4 mL van fase 1B medium (37 °C) per putje. Voorzichtig plaats de plaat in de 37 °C incubator (bevochtigde sfeer van 5% CO2) en de cultuur gedurende 48 uur.
    3. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg 2 mL van DPBS naar de waterput Pipetteer. Herhaal de aspiratie en de toevoeging van DPBS één keer.
      Opmerking: Verwijder de dode cellen uit de enkelgelaagde door zacht schudden vóór elke aspiratie.
    4. De gebruikte DPBS Pipetteer gecombineerd en voeg 4 mL van fase 1B medium (37 °C) per putje. Voorzichtig plaats de plaat in de incubator (37 °C, bevochtigde sfeer van 5% CO2) en de cultuur gedurende 24 uur.
  4. Het veroorzaken van de differentiatie in de primitieve gut buis (fase 2).
    1. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg 2 mL van DPBS naar de waterput Pipetteer.
      Opmerking: Verwijder de dode cellen uit de enkelgelaagde door zacht schudden vóór elke aspiratie.
    2. De gebruikte DPBS Pipetteer gecombineerd en voeg 4 mL van fase 2 medium (37 °C) per putje. Plaats de plaat in de incubator (37 °C, bevochtigde sfeer van 5% CO2) en de cultuur voor 4 dagen.
  5. Veroorzaken van de differentiatie in PDX1+ cellen (fase 3).
    1. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg 2 mL van DPBS naar de waterput Pipetteer. Herhaal de aspiratie en de toevoeging van DPBS één keer.
    2. De gebruikte DPBS Pipetteer gecombineerd en voeg 4 mL van fase 3 medium (37 °C) per putje. Plaats de plaat in de incubator (37 °C, bevochtigde sfeer van 5% CO2) en de cultuur voor 3 dagen.
  6. De differentiatie in alvleesklier endocriene cellen te induceren.
    1. NKX6.1+ cel inductie (fase 4, voor 8 dagen) gevolgd door endocriene cell inductie (5e etappe 12 dagen) met eerder beschreven protocollen3,16,26uitvoeren. Karakteriseren en valideren van de endocriene celdifferentiatie door immunokleuring en kwantitatieve real-time omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (qRT-PCR) analyse.
      Opmerking: Verwijzen naar Toyoda et al.16 en Kimura et al.,26 voor gedetailleerde experimentele procedures. Zie tabel 1 voor primer sequenties gebruikt voor qRT-PCR analyse.

3. Stroom Cytometry (FCM)

  1. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg 2 mL 0,5 mM EDTA naar de waterput Pipetteer. Herhaal de aspiratie en de toevoeging van 0,5 mM EDTA één keer.
    Opmerking: Schud de plaat voorzichtig als u wilt verwijderen alle dode cellen uit de cellen enkelgelaagde vóór elke aspiratie.
  2. Te distantiëren van de cellen (ongeveer 3-6 × 106 cellen per putje), voeg 2 mL 0,25% trypsine bevattende 0,5 mM EDTA per putje. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 5-10 min.
  3. Pipetteer zachtjes maar snel te distantiëren geklonterd cellen in afzonderlijke cellen. De celsuspensie niet bubble tijdens pipetteren.
  4. Toevoegen van 8-10 mL basis voedingsbodem (RPMI 1640 of iMEM, RT) met 0,5 x serumvrij supplement en 10 μM Y-27632 per goed en meng de celsuspensie. Breng de celsuspensie in een centrifugebuis.
  5. Centrifugeer de buis bij 300 x g bij RT gedurende 5 minuten.
  6. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen met 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipetteer zachtjes de celsuspensie.
  7. Centrifugeer de buis bij 300 x g bij RT gedurende 5 minuten.
  8. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen met 100 μl van fixatie en permeabilization buffer per 106 cellen onder een kap. Pipetteer zachtjes de celsuspensie onder een kap. Houd de buis op RT voor 30 min.
  9. Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT gedurende 5 minuten.
  10. De bovendrijvende vloeistof onder een motorkap gecombineerd en resuspendeer de cellen met 500 μL FCM blokkeren oplossing per 106 cellen. Pipetteer zachtjes de celsuspensie. Houd de buis op RT voor 30 min.
  11. 50 μl van de celsuspensie overbrengen in een buis (ongeveer 1 x 105 cellen). Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 100 μl van verdunde primair antilichaam (Zie Tabel van materialen) in FCM blokkeren oplossing en Incubeer bij 4 °C voor > 16u.
  12. Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 180 μL van 1 x Perm/afwas buffer.
  13. Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 100 μl van verdunde secundair antilichaam (Zie Tabel van materialen) in FCM blokkeren oplossing. Incubeer de cellen bij RT gedurende 60 minuten of bij 4 °C voor > 16u met bescherming tegen licht.
  14. Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 180 μL van 1 x Perm/afwas buffer.
  15. Centrifugeer de buis bij 400 x g bij RT voor 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met 180 μL van 2% ezel serum in DPBS.
  16. Filteren dat de celsuspensie overzetten op een 5 mL ronde onderkant polystyreen buis met een cel zeef (35 µm nylon gaas) en blijven bij 4 °C met bescherming van licht tot analyse.
  17. Het analyseren van een verhouding van positief gekleurde cellen door een stroom cytometer27.

4. immunokleuring

  1. Het gebruikte medium gecombineerd en voeg 2 mL van DPBS naar de waterput Pipetteer. Herhaal de aspiratie en de toevoeging van DPBS één keer.
    Opmerking: Zachtjes schud de plaat om te verwijderen alle dode cellen uit de cellen enkelgelaagde vóór elke aspiratie.
  2. Voeg toe 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) (4 °C) per putje Pipetteer onder een kap. Houd de plaat bij 4 °C gedurende 20 min.
  3. Verwijder de PFA Pipetteer onder een kap. Voeg 2 mL DPBS op RT naar de waterput Pipetteer onder een kap. Herhaal de aspiratie en de toevoeging van DPBS één keer.
  4. Voeg toe 2 mL blokkerende oplossing per putje en houd de plaat bij RT voor 30 min.
  5. De gebruikte oplossing gecombineerd en voeg 1 mL primair antilichaam (Zie Tabel van materialen) in het blokkeren van de oplossing per putje. Incubeer bij RT gedurende 60 minuten of bij 4 °C voor > 16u.
  6. De gebruikte oplossing gecombineerd, voeg toe 2 mL DPBS met 0,4% Triton X-100 en Incubeer bij RT gedurende 10 min. herhalen de aspiratie, toevoeging van oplossing en incubatie één keer.
  7. De gebruikte oplossing gecombineerd en voeg 1 mL secundair antilichaam (Zie Tabel van materialen) in het blokkeren van de oplossing per putje. Incubeer bij RT gedurende 60 min met bescherming tegen licht.
  8. De gebruikte oplossing gecombineerd, voeg toe 2 mL DPBS met 0,4% Triton X-100 (RT) en Incubeer bij RT gedurende 5 min met bescherming tegen licht. Herhaal de aspiratie, toevoeging van oplossing en incubatie twee keer.
  9. Neem microfoto te onderzoeken van de differentiatie-efficiëntie onder een fluorescentie Microscoop28.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Teeltmateriaal hiPSCs (585A129,30) zijn gecondenseerd en vormen een homogene enkelgelaagde (figuur 1B), die is geschikt voor differentiatie. Niet-gedifferentieerdeproductie hiPSCs (fase 0) zijn losgekoppeld en opnieuw agarvoedingsbodem als afzonderlijke cellen op lage cel dichtheden (1-1,5 x 105 cellen/cm2). Binnen 1 uur, de cellen zijn gekoppeld aan de plaat en beginnen te tonen uitsteeksel. Op dag 1, zijn de c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De generatie van PDX1+ cellen bestaat uit meerdere stappen; Daarom is het essentieel voor het behandelen van cellen op het juiste moment. Onder de trappen, de efficiëntie van de inductie van definitieve endoderm grotendeels is van invloed op de efficiëntie van de laatste inductie, eventueel door interferentie van andere contaminerende lineage cellen (dat wil zeggen, mesoderm en ectoderm), die kan verspreiden en/of afscheiden factoren die specifieke differentiatie verstoren. Als het aandeel van de SOX17+

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de financiering uit de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) via Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 en 18 K 08510) T.T. en Grant-in-Aid voor JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant nummer 17J07622) A.K. en het Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED) door middel van haar onderzoek toekennen "Core Center for iPS celonderzoek, Research Center netwerk voor realisatie van regeneratieve geneeskunde" K.O. De auteurs bedanken Dr. Peter Karagiannis voor het lezen van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamineToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acidSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×)Thermo Fisher Scientific17504-044Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesFor flow cytometry
Biomedical freezerSANYOMDF-U538For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-ChamberBIO-RAD1450011Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEARGreiner bio-one657165For differentiation culture/6-well plate
CentrifugeTOMYAX-310For cell culturing
CentrifugeTOMYMX-305For RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRVClean bench
Corning CellBIND 6-well plateCorning3335For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor ReducedCorning354230Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC SubstrateCorning3535For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
CryostatLeicaLeica CM1510 SFor immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm KitBecton Dickinson554714Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako penDakoS2002For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey SerumMerck MilliporeS30Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap CapCorning3522355 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1,000 µLWatoson124-1000SUse together with pipettes
Filter Tip, 20 µLWatoson124-P20SUse together with pipettes
Filter Tip, 200 µLWatoson124-P200SUse together with pipettes
Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X700For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubatorThermo Fisher Scientific370AIncubator
HNF-1β Antibody (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNAAmbionAM7954For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 AntibodyR&D SystemsAF2419Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 AntibodyR&D SystemsAF1924Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option mediumThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
Incubation chamberCosmo Bio10DOFor immunostaining of aggregates
Latex Examination GlovesAdachi
MAS coated slide glassMatsunami Glass83-1881For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction PlateApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907For RT-qPCR
MicroscopeOlympusCKX41N-31PHPFor cell culturing
MicrotubeWatoson131-515CS
Monoclonal Anti-α-FetoproteinSIGMAA8452Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodrop 8000Thermo Fisher ScientificFor RT-qPCR
Oligo dTFASMACCustom made Oligo For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powderNacalai tesque26126-54PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigeratorSANYOMPR-514For 4 °C storing
PIPETMAN P GILSONPipette
Recombinant Human KGF/FGF-7R&D Systems251-KGKGF
Recombinant Human NogginPeproTech120-10CNOGG

Referenties

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

PDX1 positieve cellenhPSC differentiatiedefinitief endodermstromale vasculaire fractieflowcytometrieWestern blotconfocale microscopiecelisolatieweefseldigestieprogenitorcellen

Gerelateerde artikelen