Methodenartikel

Protocol voor het maken van chronische wonden bij diabetische muizen

DOI:

10.3791/57656

⸱

25 september 2019

 , 
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische wonden zijn ontwikkeld uit acute wonden op een diabetische muismodel door het induceren van hoge niveaus van oxidatieve stress na een full-dikte cutane wond. De wond wordt behandeld met remmers voor katalase en glutathion peroxidase, resulterend in verminderde genezing en biofilm ontwikkeling door bacteriën aanwezig in de huid microbiome.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chronische wonden ontwikkelen als gevolg van gebrekkige regulering in een of meer complexe cellulaire en moleculaire processen die betrokken zijn bij goede genezing. Ze hebben invloed op ~ 6.5 M mensen en kosten ~ $40B/jaar in de VS alleen. Hoewel een aanzienlijke inspanning is geïnvesteerd in het begrijpen van de ontwikkeling van chronische wonden bij mensen, blijven fundamentele vragen onbeantwoord. Onlangs ontwikkelden we een nieuw muismodel voor diabetische chronische wonden die vele kenmerken van menselijke chronische wonden hebben. Met behulp van db/DB-/- muizen, kunnen we chronische wonden genereren door het induceren van hoge niveaus van oxidatieve stress (OS) in het wond weefsel onmiddellijk na het verwonden, met behulp van een eenmalige behandeling met remmers specifiek voor de antioxidant enzymen katalase en Glutathion peroxidase. Deze wonden hebben een hoge mate van OS, ontwikkelen biofilm natuurlijk, worden volledig chronisch binnen 20 dagen na de behandeling en kunnen meer open blijven voor meer dan 60 dagen. Dit nieuwe model heeft vele kenmerken van diabetische chronische wonden bij de mens en kan daarom aanzienlijk bijdragen tot het bevorderen van fundamenteel begrip van hoe wonden chronisch worden. Dit is een belangrijke doorbraak omdat chronische wonden bij mensen ernstige pijn en leed aan patiënten veroorzaken en resulteren in amputatie als ze niet zijn opgelost. Bovendien zijn deze wonden erg duur en tijdrovend om te behandelen en leiden tot significant verlies van persoonlijk inkomen aan patiënten. Vooruitgang op dit gebied van studie door het gebruik van onze chronische wond model kan de gezondheidszorg voor miljoenen die lijden onder deze slopende aandoening aanzienlijk verbeteren. In dit protocol beschrijven we in detail de procedure om acute wonden te veroorzaken om chronisch te worden, wat nog niet eerder is gedaan.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wondgenezing omvat complexe cellulaire en moleculaire processen die tijdelijk en ruimtelijk gereguleerd zijn, georganiseerd in sequentiële en overlappende stadia waarbij veel verschillende celtypen betrokken zijn, waaronder maar niet beperkt tot de immuunrespons en de vasculaire systeem1. Onmiddellijk nadat de huid een verwonding, factoren en bloedcellen aggregaat op de wond plaats en initiëren van de coagulatie Cascade te vormen een stolsel. Na de homeostase wordt bereikt, de bloedvaten verwijden naar de wond plaats zuurstof, voedingsstoffen, enzymen, antilichamen en Chemotactische factoren die chemotrekken polymorphonucleocytes aan het wond bed van vreemde puin te wissen en afscheiden van Proteolytische enzymen 2. geactiveerde bloedplaatjes scheiden een verscheidenheid van groeifactoren om de keratinocyten aan de wondrand te stimuleren om het gewonde gebied opnieuw te epialiseren. Monocyten die op de wond plaats worden gerekruteerd, differentiëren in macrofagen die fagocytose bacteriën en dode neutrofielen en scheiden extra factoren om keratinocyten proliferatieve en Pro-migratie signalen handhaven. In de proliferatie fase, terwijl re-epithelialisatie blijft, nieuwe granulatieweefsel samengesteld uit fibroblasten, monocyten/macrofagen, lymfocyten, en endotheel cellen blijven het wederopbouwproces2. Angiogenese wordt gestimuleerd door het bevorderen van de proliferatie van endotheliale cellen en migratie, wat resulteert in nieuwe ontwikkeling van het schip. Epithelialisatie en herinrichting van de extracellulaire matrix construeren een barrière tegen het milieu. Naarmate de wond geneest en het granulatieweefsel zich in een litteken ontwikkelt, elimineert apoptosis ontstekingscellen, fibroblasten en endotheel cellen zonder extra weefselbeschadiging te veroorzaken. De treksterkte van het weefsel wordt versterkt door fibroblasten die verschillende componenten van de extracellulaire matrix verbouwen, zoals collageen, zodat het nieuw gevormde weefsel bijna net zo sterk en flexibel is als ongewonde huid2.

Elke afwijking van deze zeer gecoördineerde progressie naar wondsluiting leidt tot verminderde en/of chronische wonden3. Chronische wonden worden gekenmerkt door verhoogde oxidatieve stress, chronische ontsteking, beschadigde Microvasculatuur, en abnormale collageenmatrix in de wond4. Oxidatieve stress, vooral in de wond, kan de wondsluiting2,5vertragen. Wanneer in de eerste fase van de wondgenezing de ontstekings fase ongereguleerd wordt, neemt het gastheer weefsel uitgebreide schade op als gevolg van een continue instroom van ontstekingscellen5 die cytotoxische enzymen vrijgeven, een toename van vrije zuurstof radicalen, en niet-gereglementeerde ontstekingsmediatoren, resulterend in celdood6,7.

In deze destructieve micro omgeving, biofilm-vormende bacteriën profiteren van gastheer voedingsstoffen en dragen bij aan de schade van het gastheer weefsel2. Deze biofilms zijn moeilijk te beheersen en te verwijderen omdat de gehydrateerde extracellulaire polymere stoffen bestaande uit eiwitten, DNA, RNA, en polysacchariden maakt het mogelijk bacteriën verveeld binnen te zijn tolerant voor conventionele antibiotica therapieën en ontwijk de de aangeboren en adaptieve immuunrespons2,8,9van de gastheer.

Het bestuderen van chronische wonden is cruciaal omdat ze invloed hebben op ~ 6.500.000 mensen en kosten ~ $40.000.000.000 per jaar in de VS alleen10. Patiënten met diabetes hebben verhoogde Risico's voor de ontwikkeling van chronische wonden die amputatie vereisen om de verspreiding van infectie bevatten. Deze patiënten hebben een risico van 50% mortaliteit binnen 5 jaar van amputatie die wordt toegeschreven aan het pathofysiologie mechanisme van diabetes11. De relatie tussen het immuunsysteem van de gastheer en de microbiome in wondgenezing is een belangrijk onderwerp van lopend onderzoek, omdat de gevolgen van chronische wonden, indien onopgelost, amputatie en dood12omvatten.

Hoewel een aanzienlijke inspanning is geïnvesteerd in het begrijpen van hoe chronische wonden zich ontwikkelen bij de mens, het is nog onduidelijk hoe en waarom chronische wonden vorm. Experimenten om de mechanismen van verstoorde genezing te bestuderen is moeilijk te voeren bij mensen, en wond genezings specialisten zien alleen patiënten met chronische wonden die al weken tot maanden een kroniek hebben bereikt. Specialisten zijn dus niet in staat om te bestuderen welke processen er fout gingen waardoor de wond zich zou ontwikkelen tot chronisch2. Er is een gebrek aan diermodellen die de complexiteit van menselijke chronische wonden recapituleren. Tot ons model werd ontwikkeld, bestond er geen model voor chronische wond studies.

Het chronische wond model werd ontwikkeld in muizen die een mutatie hebben in de leptine receptor (db/DB-/-)13. Deze muizen zijn zwaarlijvig, diabetische, en hebben een verstoorde genezing, maar ontwikkelen geen chronische wonden14. Bloedglucose niveaus gemiddeld rond 200 mg/dL, maar kan zo hoog zijn als 400 mg/dL15. Wanneer hoge niveaus van oxidatieve stress (OS) in het wond weefsel onmiddellijk na het verwonden worden geïnduceerd, wordt de wond chronisch16. De db/DB-/- wonden worden beschouwd als chronisch door 20 dagen en blijven open voor 60 dagen of meer. Biofilm geproduceerd door bacteriën kan worden gezien het ontwikkelen van begin drie dagen na het Wounding; een volwassen biofilm kan worden gezien 20 dagen na verwonden en blijft bestaan tot ofwel wondsluiting. De biofilm vormende bacteriën die we vinden in deze muizen zijn ook te vinden in menselijke diabetische chronische wonden.

Oxidatieve stress wordt veroorzaakt door het behandelen van de wonden met twee remmers van antioxidant enzymen, katalase en glutathion peroxidase, twee enzymen met de capaciteit om waterstofperoxide af te breken. Waterstofperoxide is een reactieve zuurstof soort en kan cellulaire schade veroorzaken door de oxidatie van eiwitten, lipiden, en DNA. Catalase katalyseert de afbraak van waterstofperoxide in minder schadelijke chemicaliën zuurstof en water. 3-amino-1, 2, 4-triazol (Atz) remt de katalase door specifiek en covalent binden aan het actieve centrum van het enzym, het inactiveren van17,18,19. Atz is gebruikt om de effecten van oxidatieve stress zowel in vitro als in vivo te bestuderen door de remming van katalase20,21,22,23,24. Glutathion peroxidase katalyseert de reductie van waterstofperoxide door de antioxidant, glutathion, en is een belangrijk enzym dat de cel beschermt tegen oxidatieve stress25. Mercaptosuccininezuur (MSA) remt glutathion peroxidase door binding met de selenocysteïne actieve plaats van het enzym met thiol, het inactiveren26. MSA is gebruikt om de effecten van oxidatieve stress in vitro en in vivo ook20,27,28te bestuderen.

Dit nieuwe model van chronische wonden is een krachtig model om te bestuderen, omdat het veel van dezelfde kenmerken deelt die zijn waargenomen bij chronische wonden bij menselijke diabetische, waaronder langdurige ontsteking van verhoogde OS en natuurlijke biofilm vorming van huid-microbiome. De wonden hebben een verminderde dermale-epidermale interactie, abnormale matrix depositie, slechte angiogenese en beschadigde vasculatuur. Chronische wonden zullen zich ontwikkelen in zowel mannelijke als vrouwelijke muizen, zodat beide geslachten kunnen worden gebruikt om chronische wonden te bestuderen. Daarom kan het chronische wond model aanzienlijk bijdragen tot een fundamenteel begrip van hoe dergelijke wonden beginnen. Het gebruik van dit chronische wond model kan antwoorden bieden op fundamentele vragen over hoe de chroniteit wordt geïnitieerd/bereikt door middel van bijdragen uit de Fysiologie van verstoorde wondgenezing en het microbiome van de gastheer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden voltooid in overeenstemming met en naleving van de federale voorschriften en de Universiteit van Californië beleid en procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Californië, Riverside IACUC.

1. dier

  1. Gebruik diabetische en zwaarlijvige B6. BKS (D)-Leprdb/j muizen voor het chronische wond model. De Aanschafopties omvatten ofwel heterozygoten voor de fokkerij of homozygoten rechtstreeks voor experimenten.
  2. RAS heterozygote mannetjes en vrouwtjes om nakomelingen te produceren. Slechts een kwart van het nest, statistisch, zal groeien tot diabetische en zwaarlijvige (db/DB-/-).
  3. Wean en huis db/DB-/- muizen samen met hun littermates 3 weken na de geboorte. Scheid db/DB-/- muizen van hun littermates 5 weken na de geboorte en huis met andere db/DB-/- muizen tot ze 5-6 maanden oud zijn en kunnen worden gebruikt voor het chronische wond model. Gedurende deze tijd kan een volwassen en complex huid-microbiome ontwikkelen.
    Opmerking: de db/DB-/- muizen zijn gemakkelijk visueel geïdentificeerd van littermates tussen 3-5 weken oud. De db/DB-/- muizen zijn zwaarlijvig, zijn diabetisch en zullen aanzienlijk groter en rondere zijn dan het wild type en heterozygoot littermates. Hun buik kan iets Pinker en hun heupen groter lijken. Verhoogd gewicht moet worden bevestigd voorafgaand aan de operatie. Ook is het mogelijk om hoge niveaus van glucose in het bloed te meten en genotype de muis om de mutatie in de leptine receptor te bevestigen.

2. Vivarium en husbandry

  1. Huis db/DB-/- muizen in een conventionele Vivarium (geen barrière/specifieke pathogeen vrije faciliteit) zodat een microflora kan worden vastgesteld op de huid van db/DB-/- muizen. Voor het specifiek modelleren van mensen die lijden aan chronische wonden, neem geen speciale voorzorgsmaatregelen om blootstelling aan pathogenen te voorkomen.
  2. Bescherm de kooien met micro-isolator doppen om de verspreiding van infecties binnen de Vivarium te minimaliseren. Verander de kooien twee keer per week met nieuwe bedden en voer de muizen met reguliere Vivarium Chow. Het strooisel of het voedsel niet autoclaaf.
  3. Stel kamertemperatuur in op een bereik tussen 21 en 24 °C, met kleine schommelingen afhankelijk van de tijd van het jaar. De luchtvochtigheid, de reflectie van het klimaat en de locatie, zal variëren tussen 19 en 70%.

3. voorschriften voor de ontwikkeling van chronische wonden

  1. Gebruik alleen mannelijke en vrouwelijke muizen die fenotypisch zwaarlijvig zijn, diabetische, en ten minste 5-6 maanden oud voor de ontwikkeling van chronische wonden. Het gewicht van deze muizen moet variëren tussen 40-80 g, gemiddeld rond 60 g.
  2. Gebruik geen muizen die als zwaarlijvig worden beschouwd maar minder wegen dan 50 g.
    Opmerking: alle muizen waarnaar in dit protocol wordt verwezen, passeren de hier beschreven kwalificaties, tenzij anders vermeld.

4. scheren en aanbrengen van Depilatory lotion

Opmerking: Verwijder ongewenst haar op de dorsum van de muis voordat u gaat kloppen. De volgende procedure wordt uitgevoerd op Live db/DB-/- muizen die niet onder anesthesie de dag voor de operatie. Neem voorzorgsmaatregelen om stress en schade aan het dier te voorkomen.

  1. Scheren
    1. Plaats de muis op een schoon oppervlak en grip op de onderkant van de staart van de muis met de duim en de tweede vinger om de positie van de muis te beveiligen. De muis kan springen of plotselinge bewegingen maken; Als dat zo is, reageer snel en trek de Clippers terug om letsel te voorkomen.
    2. Scheer het haar van de muis met een Hair Clipper (figuren 1a, 1B). Plaats het blad parallel aan de huid van de muis en Scheer de hele rug van de nek naar de staart, inclusief rondom de staart, zodat een groot genoeg oppervlak een transparante film dressing kan plaatsen (Zie tabel met materialen). Licht het mes lichtjes af tegen de richting van haargroei voor de meest efficiënte snede. (Figuur 1B).
      1. Druk het blad niet diep in de huid, omdat het de huid kan beschadigen door blauwe plekken of snijden.
  2. Toepassing van ontharings lotion
    Let op: gebruik ontharings lotion om een zeer gladde huid te verkrijgen, zodat de doorzichtige dressing stevig kan hechten.
    1. Week de huid van de muis met water om chemische brandwonden te voorkomen door zachtjes een doorweekt papier te vegen tegen de geschoren huid met voldoende druk om het reeds gesneden haar tegen de huid te bevochtigd.
    2. Terwijl de huid nat is, wrijf je de huid van de muis lichtjes in met een kleine kuit van ontharings lotion (Zie tabel met materialen) voor 15-20 s (figuren 1C, 1d). Verdeel de lotion volledig over waar het haar is ingekort. Gebruik meer lotion als de muis groter is.
    3. Breng geen lotion aan op de oren van de muis, staart of ergens in de buurt van het gezicht. Als de lotion op de oren of staart wordt, veeg dan gewoon met een NAT papier doekje tot het spoelen. Als de lotion op het gezicht van de muis komt, was de muis onmiddellijk onder stromend kraan of gedeïoniseerd water om schade aan de ogen, neus en mond te voorkomen.
    4. Laat de lotion reageren met het haar voor een extra 20-45 s na het aanbrengen.
    5. Voordat u gaat spoelen, Controleer de voltooiing van de onthardings reactie door de lotion van de huid op verschillende plaatsen (Figuur 1E) lichtjes af te vegen met een gehandschoende vinger of een dunne metalen spatel. De reactie is compleet als de huid roze is zonder de aanwezigheid van zwart haar. Het is het beste om snel te controleren of het haar daadwerkelijk is verwijderd voor het spoelen dan voortijdig te spoelen en daarna lotion opnieuw te moeten aanbrengen.
  3. Spoelen
    Opmerking: nadat de ontharings reactie is geverifieerd, moet u de muis met lopende kraan of gedeïoniseerd water wassen om de ontharing lotion te verwijderen en chemische brandwonden te voorkomen.
    1. Plaats de muis op de linker gehandschoende hand en druk de voet van de staart tegen de Palm met de linker duim om te voorkomen dat de muis beweegt. Sluit en strek de rest van de linker vingers om te voorkomen dat de muis bijten.
    2. Plaats de muis zodat het gezicht/hoofdgebied is weg van de stroom van water en de stroom van lauw water kan vallen achter het hoofd en alleen op de rug. Wrijf snel maar zachtjes over de achterkant van de muis met de rechterhand gehandschoven om de lotion weg te spoelen.
    3. Zodra de huid van de muis vrij is van de lotion, veeg je de muis snel schoon met een papieren handdoek om het grootste deel van het water te absorberen (Figuur 1F).
  4. Verzorging na scheren en ontharing
    1. Controleer en reinig alle resterende onthardings lotion die op de oren en staart kan blijven met een natte papier veeg.
    2. Plaats de muis terug in zijn individuele kooi en plaats de kooi op een verwarmingskussen (40-45 °C) gedurende ongeveer 30 minuten. De muis moet terugkeren naar normaal gedrag, scheur rond, en de bruidegom zelf binnen een paar minuten.
    3. Huis elke muis in een aparte kooi gedurende de duur van het experiment. De huid van de muizen is niet langer beschermd en kan gemakkelijk worden gekrast en gebeten door andere muizen.
    4. Aangezien de ontharings lotion lichte irriterende effecten kan hebben die het wond genezingsproces kunnen verstoren of veranderen, wacht u 18-24 h voor de operatie om de muis huid te kalmeren en de muis aan te passen aan het gebrek aan haar op de rug.
  5. Het verwijderen van haar van de huid met donkere pigmentatie
    Opmerking: sommige db/DB-/- muizen hebben mogelijk donkere vlekken in de huid die haar sneller en sterker dan de huid zullen laten groeien zonder deze patches. (Figuur 2A). Deze donkere delen van de huid verschijnen donkerder van kleur als gevolg van mid-late anagene stage haarfollikels en/of pigment incontinentie29,30.
    1. Als donkere vlekken worden opgemerkt, breng ontharings lotion opnieuw, maar alleen in deze gebieden, en herhaal stap 4,2 en 4,3 (figuren 2b, 2c).
      Opmerking: de donkere vlekken van de huid zullen het haar sneller laten groeien gedurende de duur van het experiment, dus knip het haar kort elke 3-5 dagen, indien nodig. Een pleister of twee uit de buurt van de gewenste locatie van de wond is aanvaardbaar. Als de achterkant van de muis aanzienlijk wordt bedekt door deze donkere vlekken, gebruik deze muis niet voor het chronische wond model.

5. reagens instellen

Opmerking: de ontwikkeling van chronische wonden in db/DB-/- muizen wordt bereikt door behandeling met specifieke remmers voor katalase en glutathion peroxidase, 3-amino-1, 2, 4-triazol (Atz) en mercaptosuccininezuur (MSA), respectievelijk16 . De volgende procedure Details de dosis en toediening van de analgesie en remmers op basis van het gewicht van de muis.

  1. Injecteer de pijnstiller buprenex intraperitoneaal bij 0,05 mg/kg muis in steriel PBS. Injecteer ongeveer 30 minuten voor de operatie een volume van 120 μL voor een 60 g muis. Een andere dosis toedienen 6 h na de operatie. Indien nodig kan een extra dosis worden gegeven.
  2. Injecteer Atz intraperitoneaal met 1 g/kg muis in steriel PBS. Injecteer ongeveer 20 minuten voor de operatie een volume van 480 μL voor een 60 g muis. Injecteer de helft van het volume aan de linker kant van de buik en de andere helft aan de rechterkant.
  3. Stort MSA topisch op de wond tussen het transparante verband en het wond weefsel bij 150 mg/kg muis in steriel PBS. Dien een volume van 60 μL toe voor een 60 g muis binnen 10 minuten na de operatie.

6. chirurgie

Opmerking: het succes van het chronische wond model berust op niet-steriele omstandigheden. Deze muizen zijn niet kiemvrij en zijn ondergebracht in een conventioneel Vivarium. De bacterie-microbiome die zich in de huid bevindt is cruciaal voor de daaropvolgende initiatie en ontwikkeling van chronische wonden bij behandeling met remmers van anti-oxydant enzymen. Daarom is de traditionele pre-chirurgische voorbereiding van de site contra-geïndiceerd.

  1. Intraperitoneale injectie
    1. Bevestig de muis op een schuine gedeelte van het kooi rack en houd de staart vast met de muis die comfortabel staat met het hoofd lager dan het lichaam van de muis. Dit zorgt ervoor dat we proberen de inwendige organen zo ver mogelijk weg van het injectie punt te verplaatsen.
    2. Steek de naald in de rechteronderkwadrant van de buik om injectie in de blaas of andere buikorganen te voorkomen.
    3. Zuig de naald op vóór de injectie.
  2. Behandeling en anesthesie
    1. Toedienen Buprenex 30 min en ATZ 20 min voor de operatie, zoals beschreven in de stappen 5,1 en 5,2.
    2. Plaats de muis in een kleine plastic container bovenop een warme verwarmingspad zoals weergegeven in Figuur 3a voor ongeveer 15-20 min. het leveren van warmte-ondersteuning voorafgaand aan de procedure beschermt tegen mogelijke sterfte.
    3. Plaats een papieren doekje of papieren handdoek over de bovenkant van de kleine container om de hitte beter te bevatten. De muis moet kalmeren als het verwarmt. Figuur 3 B toont materialen die nodig zijn voor chirurgie.
    4. Plaats de muis in een gesloten container die is aangesloten op de Isofluraan vaporizer in de chemische afzuigkap als u een open systeem gebruikt.
    5. In een open systeem, beheren 5% Isofluraan voor 1-2 min bij een debiet van 2-3.5 L/min. Bewaak continu de status van de muis.
      1. Zodra de muis bewusteloos is of niet meer beweegt, plaatst u de muis op een witte chirurgische pad en past u het hoofd met een neuskegel die is vastgezet op de vaporizer om continue toediening van Isofluraan tijdens de operatie mogelijk te maken.
    6. In een open systeem, beheren 2-3% Isofluraan met dezelfde stroomsnelheid tijdens de operatie en aan te passen aan de stroom van Isofluraan om de diepte van de anesthesie te handhaven.
    7. Minimaliseer zowel de concentratie als de duur van Isofluraan toegediend tijdens chirurgie. db/DB -/- muizen zijn zeer gevoelig voor anesthesie, dus het is het beste om Isofluraan blootstelling tot een minimum te houden. Als de muis nog steeds reageert na 2 min bij 5% Isofluraan, bevestig de neuskegel en dien 3-5% Isofluraan toe voor 15-30 s voordat u begint met de operatie.
      1. Bevestig de juiste anesthetisering voor het Wounding. Diepte van anesthesie wordt bevestigd door gebrek aan reactie op fysieke stimuli zoals sterke teen knijpen. De lengte van de tijd van de muis onder geïnhaleerde anesthesie is minder dan 5 minuten, zodat er geen dierenarts zalf op de ogen wordt aangebracht.
  3. Verwonden
    1. Spray een papieren doekje met 70% ethanol of een klinisch ethanol-doekje en veeg de achterkant van de muis schoon om het gebied van de wond te reinigen. Reinig het oppervlak van de huid zodat de doorzichtige dressing stevig kan hechten, omdat stof uit het strooisel, voedsel of de huid kan voorkomen dat het verband goed vastzit (Figuur 4A). Niet overmatig afvegen, of er zal een risico zijn op het doden van de aanwezige bacteriën op de huid.
    2. Bepaal de positie van de wond plaats. De beste plaats om de wond uit te voeren is aan de rugzijde van de muis, gecentreerd en weg van huid vlekken met een hogere pigmentatie.
      Let op: we hebben bepaald door ervaring dat deze muizen alleen de last van één wond kunnen weerstaan.
    3. Creëer een wond binnen 30-45 s met behulp van een 7 mm huid biopsie Punch, pincet en chirurgische schaar. Druk lichtjes op de biopsie Punch op de gewenste wond plaats en draai de punch rond net diep genoeg om een lichte indruk van de punch te laten (Figuur 4B). Accijns de geschetste huid door het midden van de punch met een pincet omhoog te trekken en langs de omtrek te snijden met een chirurgische schaar (figuren 4c-4e).
    4. Bedek de wond stevig met de helft van een stukje transparante film dressing (6 cm x 3,5 cm).
    5. Stop de toediening van 2% Isofluraan met de muis (Figuur 4F).

7. behandeling en herstel na de operatie

  1. Dien een MSA behandeling toe nadat de operatie is voltooid en het transparante verband wordt toegepast zoals beschreven in stap 5,3. Stort MSA op het wondgebied onder de dressing.
  2. Plaats de muis 30 minuten terug in de kleine container op het verwarmingspaneel om te helpen bij het herstel. Zodra de muis is opgewarmd, zet de muis terug in zijn kooi. Het effect van de Isofluraan is tijdelijk en de muis moet kort daarna bewegen.
  3. Laat muizen niet onbewaakt achter en geef ze niet terug aan de Vivarium totdat de muizen voldoende bewustzijn hebben gekregen om borstbeen recumbency te behouden.
    Opmerking: de verdoving van keuze bij het werken met deze muizen is Isofluraan precies vanwege de snelle inductie en daaropvolgende opkomst van anesthesie.
    1. Huis muizen die afzonderlijk een operatie hebben ondergaan om te voorkomen dat één muis de chronische wond van een ander verstoort. Zoals hierboven vermeld, keren ze niet terug naar de Vivarium totdat ze volledig hersteld zijn.
  4. Dien de tweede dosis Buprenex 6 uur na de operatie toe.
  5. Observeer de muizen zorgvuldig voor de eerste 48 h na de operatie.
    Opmerking: de operatie, in combinatie met de remmers om de chronische wond te creëren, is zeer stressvol op het dier dat al zowel diabetische als zwaarlijvig is. Muizen die de eerste paar dagen na de operatie overleven, zullen meestal de duur van het experiment overleven.

8. gegevensverzameling, overlevingsstrategieën, behandeling van de muizen na het verwonden en aanvullende tips

  1. Gegevensverzameling
    1. Neem Foto's zo vroeg als direct na de operatie. Biofilms worden overal waargenomen tussen 5-10 dagen na Wounding, en al in 3 dagen.
    2. Als bacteriën de focus van de analyse, rol een steriele swap met lichte druk rond de wond voor 10-15 s. Bewaar het wattenstaafje, in een geschikte Vries media voor het kweken of drogen zonder media voor cultuuronafhankelijke sequentieanalyse, bij-80 °C. Verzamel extracellulaire polymere stoffen via een steriele metalen spatel in een micro centrifugebuis en bewaar deze bij-80 °C vóór de analyse.
    3. Geen anesthesie toedienen aan de muis tijdens de behandeling voor biofilm collectie of foto nemen. Tijdens deze procedures, plaats een stukje voedsel voor de muis om de muis naar beneden te kalmeren en te voorkomen dat het uit te lopen. De meeste muizen zullen op de top van het eten klimmen, erop zitten en niet bewegen.
  2. Als secundaire infecties en onbedoelde chronische wonden of zweren kunnen ontwikkelen als de muis niet goed beweegt of als het verband niet correct wordt toegepast, controleer dan periodiek de activiteit van de muis en de ventrale zijde voor zweren. Wrijving tussen de huid en natte bedding (db/DB-/- muizen zijn poly urine) kan de huid verstoren als de kooien niet vaak worden gewijzigd.
    Opmerking: vloeistof opbouw onder de dressing kan ertoe leiden dat de lijm verliest zijn kleverigheid en laat de vloeistof te lekken. Dode huidcellen, beddengoed en fecale materie kan dan vasthouden aan de huid en verharden. Deze gedroogde pleisters en aggregaten op de huid moeten onmiddellijk worden gewist om een secundaire infectie te voorkomen.
  3. Als de muizen staan of op hun achterpoten zitten, verplaats deze muizen dan naar een kooi waar de toegang tot voedsel en water veel lager is. Als de positie van voedsel en water in de kooi hoog is, kan de muis op zijn achterpoten staan of zitten om hem te bereiken. De meeste muizen zullen geen probleem hebben met eten en drinken als ze dit voor de operatie zouden kunnen doen, hoewel er een mogelijkheid is dat sommige muizen op hun rug kunnen omdraaien. Deze "flippers" kunnen grote moeilijkheden hebben om over te schakelen, dus ze zullen hulp en verdere controle nodig hebben.
  4. Laat het transparante verband op de huid gedurende maximaal 20 dagen als de huid vrij is van vuil, flauw huid en haar. Als een van deze zich op de huid voordoet, verwijder dan de oude dressing en breng een nieuw stuk aan.
    1. Om het verband af te nemen, knijp je de huid lichtjes direct achter het hoofd en trek je de dressing van het hoofd weg in één vloeiende beweging.
    2. Om een stukje dressing veilig te plaatsen, moet de muis zo stil mogelijk blijven. Het is belangrijk dat de huid schoon en vrij is van schilferige dode huidcellen, stof uit het strooisel en stukjes voedsel. Plaats en druk vervolgens op de dressing in de huid rond de wond om te beveiligen.
    3. Als het plaatsen van een stukje voedsel voor de muis de bewegingen niet beperkt, plaats dan de muis bovenop de draad kooi. Zodra de muis een rail op de kooi heeft vastgedraaid, houdt u de staart zo dicht mogelijk bij het lichaam en trekt u met minimale kracht. Als de muis naar voren trekt, zal de achterkant strekken en rechttrekken voor eenvoudige toepassing; plaats het verband op dit punt veilig.
    4. Gebruik nooit een oude dressing opnieuw. Breng altijd een nieuwe dressing aan op de rug voor de grootste hechting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 5 toont een voorbeeld van een wond zonder behandeling van remmers die zich ontwikkelen naar wondsluiting en een wond met behandeling van remmers die zich naar de kroning ontwikkelen. De transparante dressing is op zijn plaats gelaten op de chronische wond zodat biofilm en vochtophoping te zien zijn.

Chronische wond initiatie vindt plaats in minder dan 6 uur en de wond marge is zichtbaar veran...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zodra er chronische wonden zijn ontstaan op de muizen, kan het model worden gebruikt om een verstoorde wond genezingsprocessen te bestuderen die betrokken zijn bij de inleiding van de kroning. Het model kan ook worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van een breed scala van chemicaliën en geneesmiddelen die chronische wond ontwikkeling en verstoorde genezing kunnen omkeren en leiden tot wondsluiting en genezing. Verschillende tijdpunten na het begin van de kronings periode kunnen worden bestudeerd: bijvoo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen erkenningen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
B6.BKS(D)-Leprdb/J The Jackson Laboratory 00697Homozygotes en heterozygotes beschikbaar 
Nair Hair Remover Lotion met kalmerende Aloë en LanolienNaireen chemisch ontharingsmiddel
Buprenex (buprenorfine HCl)Henry Stein Animal Health0591220,3 mg/ml, Klasse 3
3-Amino-1,2,4-triazool (ATZ)TCIA0432
Mercaptobernsteenzuur (MSA)Aldrich88460
Fosfaat buffer oplossing (PBS)autoclaaf gesteriliseerd
IsofluraanHenry Schein Animal Health029405NDC 11695-6776-2
ZuurstofTank moet compatibel zijn met het verdampingssysteem
Isofluraan verdamperJA Baulch & Associates 
Wahl haartrimmerWahlLithium Ion Pro
Acu Punch 7 mm huidbiopsie punchAcuderm Inc.P750
Tegaderm 3MRef: 1624WTransparante film dressing (6 cm x 7 cm)
VerwarmingskussenConairMoist Dry Verwarmingskussen
Insuline-spuitenBD3294610,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Pincet
Scherpe chirurgische schaar
Dunne metalen spatel
Slangen
Muisneuskoker
Handschoenen
Kleine plastic bakjes
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23(2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462(2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326(2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chronisch wondmodelinductie van oxidatieve stresswondgenezingsprocesbiofilmvorminginhibitie van antioxidantenzymenDb db muizenprocedure voor wondverzorgingPseudomonas aeruginosaEnterobacter cloacae

Gerelateerde artikelen