Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen

8.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57664

⸱

13 juni 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van Li-Fraumeni syndroom (LFS) patiënt afgeleide fibroblasten, differentiatie van iPSCs via mesenchymale stamcellen (MSCs) botcellen te modelleren in vivo tumorigenesis met behulp van LFS patiënt afkomstige botcellen.

Samenvatting

Li-Fraumeni syndroom (LFS) is een autosomale dominante erfelijke kanker aandoening. Patiënten met LFS zijn vatbaar voor een verschillende type van tumoren, met inbegrip van osteosarcoom--een van de meest voorkomende primaire niet-hematologic maligniteiten in de kindertijd en adolescentie. LFS biedt daarom een ideaal model voor het bestuderen van deze maligniteit. Profiteren van iPSC methodologieën, LFS-geassocieerde Osteosarcoom kan met succes worden gemodelleerd door te differentiëren LFS patiënt iPSCs naar mesenchymale stamcellen (MSCs), en vervolgens naar botcellen--de cellen van oorsprong voor osteosarcomas. Deze LFS botcellen recapituleren oncogene eigenschappen van osteosarcoom, biedt een aantrekkelijk modelsysteem voor de pathogenese van osteosarcoom uitgezet. Dit manuscript demonstreert een protocol voor het genereren van iPSCs van LFS patiënt fibroblasten, differentiatie van iPSCs naar MSCs, differentiatie van MSCs botcellen en in vivo tumorvorming met behulp van LFS botcellen. Dit model van de ziekte iPSC kan worden uitgebreid om mogelijke biomarkers of therapeutische doelen voor LFS-geassocieerde Osteosarcoom te identificeren.

Inleiding

Tussen 2006 en 2007 leidde verschillende bevindingen van de doorbraak van de laboratoria van Drs. Shinya Yamanaka en James A. Thomson tot de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)1,2,3. Door herprogrammering van somatische cellen met gedefinieerde transcriptionele factoren aan formulier iPSCs, onderzoekers konden genereren van cellen met belangrijkste kenmerken namelijk, pluripotent, en zelf-vernieuwing, die eerder werd gedacht om alleen bestaan in menselijke embryonale stamcellen (hESCs). iPSCs kan worden gegenereerd op basis van een individu of de patiënt en niet hoefde te worden afgeleid van embryo's, enorm uit te breiden het repertoire van beschikbare ziekten en achtergronden voor de studie. Sindsdien hebben patiënt afkomstige iPSCs gebruikt om te recapituleren het fenotype van verschillende ziekten bij de mens, van de ziekte van Alzheimer4 en Amyotrofische laterale sclerose5 tot lange QT syndroom6,7, 8.

Deze voorschotten in iPSC onderzoek hebben ook nieuwe wegen voor het kankeronderzoek geopend. Verschillende groepen hebben laatstgebruikte geduldig iPSCs tot kankerontwikkeling model onder een gevoelig genetische achtergrond9,10,11, met de succesvolle toepassing blijkt tot op heden in Osteosarcoom9, leukemie10,11,12, en13van de opsporing van colorectale kanker. Hoewel kanker iPSC-afgeleide modellen nog in hun kinderschoenen zijn, hebben ze groot potentieel in phenocopying ziekte-geassocieerde maligniteiten, ophelderen van pathologische mechanismen, en het identificeren van therapeutische stoffen14aangetoond.

Li-Fraumeni syndroom (LFS) is een autosomale dominante erfelijke kanker aandoening veroorzaakt door TP53 germline mutatie15. Patiënten met LFS zijn vatbaar voor een verschillende soort maligniteiten waaronder Osteosarcoom, LFS iPSCs en hun afgeleide cellen met name geschikt voor het bestuderen van deze maligniteit16maken. Een model van iPSC gebaseerde Osteosarcoom werd opgericht in 2015 met LFS patiënt afkomstige iPSCs9 vervolgens gedifferentieerd naar mesenchymale stamcellen (MSCs) en klik vervolgens op botcellen, de van oorsprong cellen van osteosarcoom. Deze LFS botcellen recapituleren Osteosarcoom-geassocieerde osteogenic differentiatie gebreken en oncogene eigenschappen, aan te tonen het model potentieel als een "bot tumor in een schotel" platform. Interessant, genoom-brede transcriptome analyses onthullen aspecten van een Osteosarcoom gene handtekening in LFS botcellen en die de kenmerken van deze LFS genexpressie profiel zijn gecorreleerd met slechte prognose in Osteosarcoom9, waarin de potentieel van LFS iPSCs ziekte modellen te onthullen van de kenmerken van klinische relevantie.

Dit manuscript bevat een gedetailleerde beschrijving van het gebruik van LFS patiënt afkomstige iPSCs naar model Osteosarcoom. Het overzicht van de generatie van LFS iPSCs, differentiatie van iPSCs naar MSCs en vervolgens naar botcellen, en het gebruik van een in vivo xenograft model met behulp van LFS botcellen. Het model van de ziekte LFS omvat verschillende voordelen, met name de mogelijkheid om het genereren van onbeperkte cellen in alle stadia van ontwikkeling van osteosarcoom mechanistische studies, biomerker identificatie, en drug screening9,14, 16.

Kortom biedt het LFS iPSC gebaseerde Osteosarcoom model een aantrekkelijke aanvullende systeem ter bevordering van osteosarcoom onderzoek. Dit platform biedt ook een bewijs-van-concept voor kanker modellering met behulp van de patiënt-afgeleide iPSCs. Deze strategie hieronder beschreven kan gemakkelijk worden uitgebreid tot model maligniteiten andere genetische aandoeningen met kanker predisposities is gekoppeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit werk werd goedgekeurd door de University of Texas Health Science Center in Houston (UTHealth) het Comité van de welzijn van de dieren. De experimenten worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de normen die zijn vastgesteld door het UTHealth Center voor laboratoriumgeneeskunde dier & zorg (CLAMC) die is geaccrediteerd door de American Association for Laboratory Animal Care (AAALAC International). De proefpersonen in dit onderzoek vallen onder Scenario een ("geen menselijke onderwerpen onderzoek"), zoals gedefinieerd door de NIH SF424 documentatie. Dus hoeft het niet elke goedkeuring door UTHealth menselijke onderzoek ethisch comité.

1. generatie van LFS iPSCs (figuur 1A)

  1. Plaat op dag -2, 2 x 104 LFS patiënt fibroblasten in één putje van de plaat van een 6-well, en cultuur van de cellen met fibroblast medium (tabel 1) bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator. Zorg ervoor dat de fibroblasten samenvloeiing van 50-60% op de dag van de transductie (dag 0) bereiken.
  2. Sendai virus transductie uitvoeren op dag 0. Om dit te doen, door het gebruikte medium te vervangen door voorverwarmde fibroblast medium. Ontdooi de commerciële Sendai virus herprogrammering kit (Zie Tabel van materialen) op ijs. Infecteren LFS fibroblasten met gemengde Sendai virussen volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Onderhoud van de getransduceerde cellen in fibroblast medium (dag 1-6):
    1. Op de dag 1, 24 uur na de signaaltransductie, het medium van de fibroblast met resterende Sendai virus verwijderen en vervangen met 2 mL verse fibroblast medium. Cultuur van de getransduceerde fibroblasten bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
    2. Wijzig het medium met de fibroblast medium om de andere dag van de dag 2-6.
  4. Onderhoud van de getransduceerde cellen in de feeder cultuur voorwaarde (dag 7-28):
    1. Bereiden bestraalde CF1 muis embryonale fibroblast (MEF) cultuur gerechten op dag 6. Voer deze jas gecombineerd zes 100 mm weefselkweek gerechten door toevoeging van 5 mL 0,1% gelatine aan elke plaat bij kamertemperatuur voor 30 min. de gelatine 0,1% na coating.
    2. MEFs Verwijder uit vloeibare stikstof container. Ontdooi MEFs met behulp van de verkrijgbare dooiende systeem volgens de instructies van de fabrikant. Plaat de cellen op de gelatine beklede platen met voedingsbodem MEF/MSC (tabel 1) bij een seeding dichtheid van rond 6,7 x 105 cellen per 100 mm weefselkweek schotel.
    3. Beënt de getransduceerde cellen op MEF platen (dag 7): Trypsinize van de getransduceerde cellen met behulp van 0,25% 1 mL trypsine-EDTA per 100 mm schotel voor 2-4 min bij kamertemperatuur. Neutraliseer trypsine met 9 mL fibroblast voedingsbodem. Overdracht cellen conische buizen en centrifuge cellen bij 230 x g bij 37 ° C gedurende 4 min. Plate van de getransduceerde fibroblasten op de zes MEF gerechten bereid op dag 6 en cultuur hen in 8 mL fibroblast voedingsbodem per schotel.
      Opmerking: De confluentie van MEFs is ongeveer 20% vóór het zaaien van getransduceerde cel op MEF platen.
    4. Op de dag 8, negeren de fibroblast medium en vervangen met hESC medium (tabel 1).
    5. Wachten voor het ontstaan van iPS klonen van dagen 9-28 (Figuur 1C). Wijzig het verbruikte hESC medium om de andere dag en controleren de opkomst van iPS klonen onder de Microscoop. Wacht tot iPSCs klonen groot genoeg om te worden waargenomen met het blote oog en gaat u verder met het uitbreiden van iPS klonen in feeder-vrije cultuur staat.
  5. Uitbreiding van de naar voren gekomen iPS klonen in feeder-vrije cultuur staat (dag 29-79 ~ 99 van het Reglement):
    1. Ter voorbereiding van de matrix beklede plaat, jas een 48-well plaat met 120 µL van de kelder membraan matrijs coating oplossing (tabel 1) per putje. Zorg ervoor dat de kelder membraan matrijs coating oplossing dekt de put en jassen van het oppervlak van de schotel cultuur. Laat het op kamertemperatuur voor 1 h. Aspirate de coating oplossing vlak voor gebruik en voeg 250 µL van hESC medium per putje met 2 µM ROCK remmer Thiazovivin.
    2. Op de dag 28, gecombineerd het verbruikte hESC medium en wassen van iPS klonen met 1 x DPBS. Pick-up zichtbaar iPS klonen met een 1 mL pipet tip en overdracht in een putje van een behandelde 48-well plaat (stap 1.4.1). Zaad één kolonie per putje van 48-well plaat.
    3. Centrifugeer de plaat bij 230 x g gedurende 4 min ter vergemakkelijking van de bijlage van de cel. Cultuur iPS klonen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator.
    4. De volgende dag (dag 29), verwijder het medium van de gebruikte hESC en voeg 250 µL van het medium verkrijgbare iPSC in elk putje.
    5. Handhaven van iPS klonen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator en wijzig het iPSC medium om de andere dag.
    6. Wanneer iPS klonen 85% samenvloeiing bereikt, subcultuur cellen op een 1:10 verhouding door cultuur gebied. Voeg 60 µL van de commerciële passaging oplossing loskoppelen van de cellen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten.
    7. Beënt de helft van de vrijstaand iPSCs op een kelder membraan matrix beklede 12-well plaat in 1 mL van hESC medium met 2 µM ROCK remmer Thiazovivin. IPS klonen in een 12-well plaat met 1 mL van het medium van de verkrijgbare iPSC per goed en subcultuur iPSCs cultuur op een 1:10 verhouding totdat ze passage 10.
      Opmerking: iPSCs zijn sub gekweekte elke 5-7 dagen op een 1:10 verhouding. Het duurt maximaal 10 weken voor iPS klonen te bereiken passage 10. iPSC karakterisaties waaronder cel morfologie, alkalische fosfatase (AP) activiteit en de uitdrukking van pluripotent factoren en hESC de markeringen, kunnen worden onderzocht na het bevestigen van de verwijdering van Sendai virus in iPSCs (meestal aangetoond na ongeveer 10 passages) (figuur 1B-E). Informatie over antilichaam en primer voor iPSC karakterisering zijn opgenomen in tabel 2 en 4.

2. differentiatie van LFS iPSCs aan de mesenchymale stamcellen (MSCs) (figuur 2A)

  1. Cultuur iPSC klonen op MEF platen voor ten minste 2 weken (dag ~-14-0): bereidt de gerechten MEF (100 mm weefselkweek gerechten), zoals hiervoor is beschreven (1.3.1 - 1.3.2). Handhaven van iPSCs in hESC medium en medium om de andere dag veranderen. Wanneer iPSCs bereiken 90% samenvloeiing, subcultuur iPSCs door 1:10 verdunning.
  2. Verwijdering van MEFs van iPSCs (dag 0):
    1. Cultuur iPSCs in 100 mm weefselkweek gerechten tot cellen bereikt na handhaving van iPSCs op MEFs voor 2 weken, samenvloeiing van 80-90%. Verwijder het medium van de gebruikte hESC en wassen iPSCs met 5 mL van de 1 x DPBS. Voeg vervolgens 1 mL van de cel detachement oplossing loskoppelen van de cellen en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    2. Voeg 9 mL MEF/MSC kweekmedium aan de plaat neutraliseren de mobiele-detachement oplossing-activiteit en het overbrengen van de vrijstaande cellen naar een nieuwe 100 mm weefselkweek schotel zonder enige coating.
    3. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de MEFs te hechten aan de plaat.
    4. Zorgvuldig verzamelen het supernatant waarin niet-vastgemaakte iPSCs en centrifuge bij 230 x g bij 4 ° C voor 4 min.
      Opmerking: Onzorgvuldig blozen plaat onder leidt tot een detachement van MEFs.
  3. Differentiatie van de iPSCs richting MSCs (dag 0 - 28):
    1. Jas drie putjes van de plaat van een 6-well met 1 mL 0,1% gelatine per putje bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
    2. Verwijder het supernatant van de verzamelde iPSCs uit 2.2.4.
    3. Resuspendeer iPSCs in 6 mL van MSC differentiatie medium (tabel 1) en zaad-cellen in de drie gecoate putten met 2 mL per putje (dag 0).
    4. Wijzigen het MSC differentiatie medium om de twee dagen om het verwijderen van niet-vastgemaakte en/of dode cellen (dag 1 - 28).
  4. Rijping van iPSC afkomstige MSCs (dag 28-45):
    1. Verwijder het verbruikte MSC differentiatie medium en wassen van cellen met 1 mL van de 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs met 0,25% 0,5 mL trypsine-EDTA per putje bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten.
    3. Trypsine neutraliseren door 1,5 mL gestolde voedingsbodem MEF/MSC en MSCs van drie putten in een conische tube van 15 mL verzamelen. Centrifugeer bij 230 x g bij 4 ° C gedurende 4 min.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer MSCs in 3 mL MEF/MSC kweekmedium en plaat op een 60 mm 0,1% gelatine beklede plaat (dag 28).
    5. Cultuur MSCs MEF/MSC kweekmedium en veranderen gemiddeld om de twee dagen. Wanneer de cellen bereikt 100% samenvloeiing, subcultuur MSCs bij een verhouding van 1:3 met behulp van 0,25% trypsine-EDTA.
      Opmerking: De MSCs weergegeven een fibroblast-achtige morfologie (figuur 2B). Wanneer MSCs in een hoge dichtheid groeien, kunnen langwerpige MSCs vormen een werveling-achtig patroon (figuur 2B).
    6. Voeren de immunefluorescentie kleuring ter evaluatie van iPSC afkomstige MSCs door onderzoek van MSC oppervlakte markeringen, CD44, CD73, CD105 en CD166 (figuur 2C).
      Opmerking: De verdunning van de antilichamen zijn weergegeven in tabel 2. Immunefluorescentie kleuring van levende cellen wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant.
    7. Na bevestiging, vouw MSCs bij een verhouding van 1:3 in 100 mm weefselkweek gerechten. Bevriezen naar beneden flesjes (3 flesjes per 100 mm weefselkweek schotel) via het bevriezen die DMSO van 10% en 90% FBS.
      Opmerking: Om te verrijken de MSC-bevolking, MSCs kunnen gesorteerd worden met behulp van CD105+, CD24-criteria door stroom cytometry9,17. iPSC afkomstige MSCs gedifferentieerd met behulp van de methode PDGF AB-gebaseerde vaak kunnen worden gehandhaafd voor 2-3 maanden in cultuur zonder verlies van MSC identiteit9. Bevriezen MSCs van een vroege overgang nummer na het bevestigen van MSC kenmerken.

3. differentiatie van LFS MSCs op botcellen (figuur 3A)

  1. Voorbereiding van MSCs op het osteogenic differentiatie (dag -1)
    1. Om ervoor te zorgen een voldoende hoeveelheid cellen om te voltooien van het protocol van osteogenic differentiatie, beginnen met MSCs gekweekt in 100 mm weefselkweek gerechten tot 95% samenkomst. Verwijder het gebruikte kweekmedium en MSCs wassen met 5 mL van de 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs met 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA per schotel van 100 mm bij kamertemperatuur gedurende 3 minuten. Om ervoor te zorgen dat de cellen zijn niet meer dan trypsinized, stop trypsinebehandeling wanneer 50% van het mobiele-detachement onder de Microscoop wordt waargenomen.
    3. Trypsine neutraliseren door 9 mL MEF/MSC kweekmedium en verzamelen van MSCs uit 3 putten in een conische tube van 15 mL. Centrifugeer bij 230 x g bij 4 ° C gedurende 4 min.
    4. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer MSCs in 5 mL van MSC medium tellen van het aantal cellen door een hemocytometer.
    5. Juiste nummerplaat van MSCs op een plaat van de cultuur.
      Opmerking: Het detail van cel aantallen 12-well plaat, 6 well-plate en 100 mm weefselkweek gerechten zijn samengevat in tabel 3.
  2. Inductie van osteogenic differentiatie door osteoblast differentiatie medium (ODM) (tabel 1) (dag 0 - 24):
    1. Gecombineerd MEF/MSC kweekmedium en vervangen door de juiste hoeveelheid ODM (schotel met 1 mL en 2 mL 8 mL voor elk putje van de plaat van de 12-well, elk putje van 6-well plaat en weefselkweek 100 mm, respectievelijk) te onderscheiden van MSCs op botcellen (dag 0).
    2. De verbruikte ODM gecombineerd en vervangt door de juiste hoeveelheid ODM elke twee dagen tijdens het osteogenic differentiatie.
    3. Het uitvoeren van de alkalische fosfatase (AP) en de Alizarine rood S (ARS) vlekken te sporen bot-geassocieerde alkalische fosfatase geproduceerd door preosteoblasts en minerale afzetting geproduceerd door oudere botcellen, respectievelijk op dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 en 24 ( Figuur 3B).
      Opmerking: AP kleuring en ARS kleuring worden uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgbare kit volgens protocol van de fabrikant.
    4. Onderzoeken van de niveaus van de expressie van preosteoblast en volwassen osteoblast markers (ALPL en COL1A1 voor preosteoblasts; PTH1R en BGLAP voor volwassen botcellen) door qRT-PCR (Figuur 3 c).
      Opmerking: Positieve AP kleuring verwachting na dag 9 van osteogenic differentiatie en positieve ARS kleuring na dag 21 van osteogenic differentiatie kan worden verwacht. De MSCs groeien in een kweekvloeistof MEF/MSC kunnen worden geserveerd als een negatieve controle van AP kleuring en ARS vlekken.

4. het Xenograft-Model om te studeren In Vivo tumorvorming van LFS MSC afkomstige botcellen (figuur 4A)

  1. Differentiatie van LFS MSCs op botcellen:
    1. Zaad 3-4.5 x 105 MSCs in 100 mm weefselkweek schotel. Vijf gerechten te bereiden voor een subcutane injectie.
    2. Cultuur MSCs in ODM MSCs differentiëren naar botcellen zoals beschreven in punt 3.2 tot en met dag 14.
  2. Voorbereiding van gedifferentieerde botcellen subcutane injectie:
    1. Los 1 g type II collagenase in 1000 mL van αMEM medium om de collagenase II oplossing (1 mg/mL) te maken als voorbereiding hierop osteoblast detachement oplossing (tabel 1). Bewaar de collagenase II oplossing bij-20 ° C. Mix van 0,25% trypsine-EDTA en de collagenase II oplossing bij een 1:1 verhouding te maken de botcellen detachement oplossing.
    2. Verwijder de verbruikte ODM en wassen van gedifferentieerde botcellen met 5 mL van de 1 x DPBS per schotel van 100 mm.
    3. Voeg 1,5 mL osteoblast detachement oplossing per schotel van 100 mm en incubeer gerechten bij 37 ° C gedurende 30 min. onderzocht en zorgen van het detachement osteoblast door microscopie.
    4. Neutraliseren van de botcellen detachement oplossing door ODM en verzamelen de vrijstaande botcellen in een conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 230 x g bij 4 ° C gedurende 5 min.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 25 mL van ODM medium. De cellen doorlopen in een 70 µm cel zeef samengevoegde cellen verwijderen. Tel de getallen van de cel met behulp van een hemocytometer.
    6. 1 x 107 botcellen per subcutane injectie en centrifuge cellen bij 230 x g bij 4 ° C voor te bereiden voor 4 min.
    7. Resuspendeer de 1 x 107 botcellen in 50 µL ijskoude 1 x DPBS. Mix gedifferentieerde botcellen met 50 µL van fenol-rood gratis kelder membraan matrix (botcellen schorsing en kelder membraan matrix werden gemixt in een 1:1 verhouding) en onderhouden van botcellen op ijs vóór injectie.
  3. In vivo xenograft tumor model van botcellen LFS MSC-afgeleide:
    1. Anesthetize 8-week-oude vrouwelijke immuungecompromitteerde NU/NU muizen in een kamer leveren van 5% (v/v) ingeademd Isofluraan in 1 L/min. van zuurstof (geleverd door CLAMC). Nadat het dier wordt ligfiets, de verdoving uitvoeringssysteem overschakelen naar de neus kegel, levering van 2% (v/v) ingeademd Isofluraan in 200mL/min. van zuurstof (geleverd door CLAMC). De diepte van de verdoving controleren door na het hoornvlies te en pedaal reflexen te maken van de muizen zijn voldoende verdoofd en niet lijden ongemak tijdens de procedure.
    2. Desinfecteer het gebied worden ingespoten met afwisselend swabs van chloorhexidine en 70% isopropanol. Gebruiken 26 G naald voor subcutane injectie van kelder membraan matrix-gemengde LFS botcellen in één kant van de achterpoten van 8 weken oude immuungecompromitteerde NU/NU muizen (figuur 4A).
    3. Monitor muizen door te voeren per palpatie op injectie sites voor groei van subcutane nodulair dichtheden. Vorming van de tumor waarneembaar ongeveer 6-10 weken na injectie (figuur 4B).
    4. De muizen door kooldioxide verstikking methode gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren. Ontleden de ontwikkelde tumoren. Bepalen van de graad van de tumor en de differentiatie index, preosteoblasts en volwassen botcellen door verschillende kleuring methoden (bijvoorbeeld haematoxyline en eosine (H & E) kleuring, Picro Sirius rode kleuring en von Kossa respectievelijk kleuring).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol stelt de procedures met inbegrip van LFS iPSC generatie, MSC differentiatie osteoblast differentiatie en in vivo tumorvorming assay met behulp van LFS MSC afkomstige botcellen.

Regeling voor de generatie van LFS iPSCs van fibroblasten met behulp van een commercieel beschikbare Sendai virus herprogrammering kit is afgebeeld in figuur 1A. Sendai virus gebaseerde levering van de Y...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Om te bereiken hoger MSC differentiatie efficiëntie, staan verschillende aspecten kritisch tegenover. Een is de conditie van de cultuur van de iPSCs voordat de MSC differentiatie. Het protocol gepresenteerd in het manuscript is gebaseerd op eerdere studies 9,17. iPSCs moeten worden gekweekt op MEFs voor ten minste 2 weken. Behoud van iPSCs in goede staan voorwaarden op MEFs kritisch tegenover voor cellen te hechten op de gelatine beklede plaat voor MSC differenti...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

R. Z. wordt ondersteund door UTHealth innovatie voor kanker preventie onderzoek opleiding programma Pre-Doctoral Fellowship (kankerpreventie en onderzoek instituut van Texas verlenen van RP160015). J.T. wordt ondersteund door het Ke Lin-programma van de eerste aangesloten ziekenhuis van Sun Yat-sen-universiteit. D.-F.L. is de CPRIT geleerde in kankeronderzoek en ondersteund door de NIH weg naar onafhankelijkheid Award R00 CA181496 en CPRIT Award RR160019.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kunststof artikelen
100 mm SchaalCorning430107
60 mm SchaalCorning430166
6-well PlaatFalcon353046
12-well PlaatFalcon353043
48-well PlaatFalcon353078
1 mL Pipet TipUSA Scientific1111-2721
200 µL Pipet TipUSA Scientific1111-0706
10 µL Pipet TipUSA Scientific1111-3700
5 mL Serologische PipetSARSTEDT86.1253.001
10 mL Serologische PipetSARSTEDT86.1254.001
25 mL Serologische PipetSARSTEDT86.1685.001
50 mL Buis, PPSARSTEDT62.547.100
15 mL Buis, PPSARSTEDT62.554.100
Kweekmaterialen en Reagentia
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming KitInvitrogenA16517Commercieel Sendai virus reprogrammeringskit
Corning hESC-Qualified MatrixCorning354277Basement membrane matrix
CF1 MEFs, geïrradieerdThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM/F12Corning10-090-CV
αMEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Commercieel iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
KnockOut Serum ReplacementThermoFisherA3181502
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333
MEM Nonessential Amino AcidsCorning25-025-CI
L-Glutamine SolutionSigma-AldrichG7513
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148
Human FGF-basic (bFGF)PEPROTECH100-18B
Recombinant Human PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
β-GlycerofosfaatSigma-AldrichG9422
DexamethasonSigma-AldrichA4902
Ascorbic AcidSigma-AldrichA5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XFMiltenyi Biotec130-104-688Commerciële passageeroplossing
Accutatse CelloslatingsoplossingCorning25-058-CICell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor)Calbiochem420220
0.25% Trypsin-EDTA OplossingSigma-AldrichT4049
Collageenase, Type II  ThermoFisher17101015
Human NANOG AntibodyR&D SystemAF1997
OCT4 Antibody (H-134)Santa Cruzsc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-geconjugeerd AntibodyR&D SystemFAB1435P
Alexa Fluor 555 Muis Anti-Human TRA-1-81 AntigenDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 Ezel Anti-Geit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Geit Anti-Konijn IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE Muis Anti-Human CD105eBioscience12-1057-42
FITC Muis Anti-Human CD44DB Biosciences555478
PE Muis Anti-Human CD73DB Biosciences550257
PE Muis Anti-Human CD166DB Biosciences560903
FITC Muis Anti-Human CD24DB Biosciences555427
Ezel SerumJackson ImmunoResearch017-000-121
Geit SerumJackson ImmunoResearch005-000-121
Alkaline Fosfatase Kleuringskit IIStemgent00-0055
Alizarine Rood SSigma-AldrichA5533
TRIzol ReagensThermoFisher15596018
ChloroformThermoFisherC298-500
2-PropanolThermoFisherA416-4
Ethanol, Absoluut, Moleculaire Biologie GradeThermoFisherBP28184
DNase I, RNase-vrij (1 U/xL)ThermoFisherEN0521
iScript cDNA SynthesekitBioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel Matrix Hoge Concentratie (HC), Fenol-RoodvrijCorning354262
1 mL Slip Tip Spuit, 26 Gauge x 5/8 InchDB Biosciences309597

Referenties

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

iPSC differentiatiemesenchymale stamcellenosteoblastdifferentiatiein vivo tumorigenesealkalische fosfatasekleuringalizarinerood S kleuringimmunofluorescentiekleuringsubcutane injectienaaktmuismodel
Modelleren van osteosarcoom met behulp van Li-Fraumeni syndroom geïnduceerde pluripotente stamcellen patiënt-afgeleide cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.