In dit onderzoek tonen we een label-vrije neutrofiele scheiding methode van klinische airway afscheidingen met kringloopsysteem bewerking van spiraal inertial microfluidics. De voorgestelde methode zou het uitbreiden van de klinische in vitro tests voor verschillende aandoeningen van de luchtwegen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Label-vrije neutrofiele verrijking van patiënt-afgeleide Airway secretie met behulp van Closed-loop Inertial Microfluidics
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Airway afscheidingen bevatten een groot aantal cellen van het immuunsysteem-gerelateerde, bijvoorbeeldneutrofiele granulocyten, macrofagen en lymfocyten, die kunnen worden gebruikt als een belangrijke bron om te evalueren van een verscheidenheid van longziekten, zowel voor onderzoek en klinische doeleinden. Vanwege de heterogene en viskeuze aard van patiënt slijm is er momenteel echter geen betrouwbare dissociatie-methode die de immune cellen van de gastheer in de patiënt airway afscheiding niet schaden. In dit onderzoek introduceren wij een monster-voorbereiding methode die inertial microfluidics voor de patiënt immuun beoordeling worden gebruikt. Ongeacht de heterogene fluidic eigenschappen van de klinische monsters, de voorgestelde methode herstelt meer dan 95% van de neutrofielen van airway secretie monsters die 1,000-fold zijn verdund met schone zoutoplossing milliliter. Door het opnieuw circuleren de geconcentreerde uitvoerstroom naar het oorspronkelijke monster reservoir, worden een hoge concentratie, herstel en zuiverheid van de immuuncellen verleend; recirculatie wordt beschouwd als een trade-off voor de single-run spuit gebaseerde werking van inertial microfluidics. De werking van het kringloopsysteem van spiraal microfluidics biedt leukocyten zonder fysieke of chemische verstoring, zoals blijkt uit de phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)-geïnduceerde elastase release van gesorteerde neutrofiele granulocyten.
Inleiding
Aangezien cellen zijn ingekapseld in een grote hoeveelheid slijm in luchtwegen afscheidingen, werd de functionele beoordeling van leukocyten door een in vitro assay belemmerd. Dithiothreitol (DTT) is de meest voorkomende lysis-buffermengsel Meng het sputum cytologische analyse-en detectiemethoden voor bemiddelaars/mediators waarbij maximaal toelaatbare levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen1,2te distantiëren. Echter kan DTT interfereren met de oppervlakte-gebonden antigenen van airway neutrofielen, resulterend in de verstoring van neutrofiele functie zoals elastase en myeloperoxidase (MPO) release2,3. Daarom zijn enkele studies van menselijke airway neutrofiele functie uitgevoerd met perifeer bloed neutrofielen, die niet de fysiologische kenmerken van pulmonaire4 onthullen kunnen. Inertial microfluidics heeft intussen vooruitgang geboekt in het isoleren van de cellen van verschillende patiënten biomatrices5,6. Het evenwicht tussen inertial lift krachten en Dean Sleep Hiermee lijnt u de deeltjes/cel volgens hun grootte, die het mogelijk maakt van label-vrije deeltjes scheiding7. Onze fractie eerder introduceerde een monster voorbereiding methode voor circulerende tumor cellen8,9, ziekteverwekkers in bloed8, cellen van een schorsing cultuur10,11, 12, en polymorfonucleaire leukocyten (PMNs) van bloed13,14.
Hier introduceren we een protocol ter voorbereiding van immune cellen van een patiënt airway afscheidingen met behulp van gesloten-lus inertial microfluidics voor een stroomafwaarts in vitro assay, zoals de bepaling neutrophil elastase (NE). Deze methode biedt zowel hoge concentratie en nuttige toepassing, vooral wanneer er een aanzienlijke overlap in de laterale richting van de cel/deeltje waaruit de cel/deeltje-van-belang is om te worden verwijderd, die meestal in klinische monsters waargenomen wordt. Door het opnieuw circuleren van de binnenste muur (IW)-geconcentreerd grote deeltjes of cellen terug naar de input monsterbuisje, het deeltje of de cel-of-interest concentraten in het originele reservoir, terwijl achtergrond vloeistoffen met kleine mucin aggregaten het afval reservoir passeren. Ondanks de heterogene fluidic eigenschappen van klinische monsters, de voorgestelde methode herstelt consequent boven 95% van de neutrofielen van airway secretie monsters die 1,000-fold worden verdund met een schone zoutoplossing (~ 1 mL). Daarentegen, presenteert de lysis methode een breed scala van PMNs herstel tarieven afhankelijk van de conditie van de steekproef. Het voorgestelde protocol vangt leukocyten in een label-vrije manier met geen fysische of chemische ontwrichting, waarin de mogelijkheid om te oogsten van gevoelige cellen uit klinisch uitdagend biometrie met minimaal invasieve procedures.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De sample collectie werd goedgekeurd door de Universiteit van Pittsburgh institutionele Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Alle experimenten worden uitgevoerd onder een kast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bioveiligheid.
1. apparaat fabricage en zachte lithografie
Opmerking: Standaard zachte lithografie technieken15,16 werden gebruikt voor het maken van de microchannel Polydimethylsiloxaan (PDMS).
- Meng de PDMS voorloper in een verhouding 10:1 voor basis en genezen agent.
- Giet 30 g van het PDMS voorloper mengsel op de micro-gefreesd aluminium mal (Zie Figuur 1 voor afmetingen) en 20 g van het PDMS voorloper mengsel over de 100 mm petrischaal.
Opmerking: De petrischaal wordt gebruikt voor het maken van de dikke film voor PDMS (~ 3 mm) voor de ondersteunende laag. De ondersteunende laag van PDMS biedt uniforme fysieke oppervlakte-eigenschappen in de microfluidics. U kunt ook kan een dunne film van het PDMS op het glasplaatje worden gebruikt. De meester mal met specifiek kanaal afmetingen is ontworpen en gefabriceerd door micro-frezen op het blad aluminium. De spiraal-kanaal dat wordt gebruikt in deze studie werd een 8-lus spiraal microchannel met één ingang en twee uitgangen, met de straal steeg van 8 mm tot 24 mm voor efficiënte formaat gebaseerde scheiding. - Plaats de schimmel en de petrischaal in een vacuüm exsiccator tot ontgas zolang geen luchtbellen niet zichtbaar op het oppervlak, meestal 5 tot 10 minuten gebruik een huis-vacuüm voor de exsiccator zijn.
- Laat het vacuüm en de schimmel en de petrischaal plaats in een oven van 90 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: Een kookplaat of andere verwarming hulpmiddelen kunnen worden gebruikt in plaats van een oven. - Verwijder de schimmel en de petrischaal uit de oven en laat ze afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Zorgvuldig uitgesneden van de omtrek en de vloeistof toegang gaten op het apparaat met behulp van een 2 mm perforatie punch.
Opmerking: De grootte van de stoot kan variëren afhankelijk van de grootte van de buizen of vloeibare gids. - Houden van een tape naar de kant van het kanaal van het apparaat en dikke film voor PDMS en schil zorgvuldig met een tang om stof te verwijderen.
- Behandelen zowel de kanaal kant van het apparaat en de gewone PDMS met lucht plasma en band met de bereid ondersteunende laag van gewone PDMS (figuur 1A).
- Plaatsen van een chip op het glasplaatje 50 x 70 mm en plaats deze in een oven van 70 ° C voor minstens 30 min ter verbetering van de sterkte van de binding.
2. De tracheale secretie collectie van mechanisch geventileerde patiënten
Opmerking: Tracheale afscheidingen kunnen worden verkregen bij mechanisch geventileerde patiënten tijdens normale routine airway zorg met behulp van een protocol aangepast ten opzichte van conventionele methodes om de standaard, volwassen geventileerde patiënt tegemoet te komen. Monsters waren-geïdentificeerd en onmiddellijk worden teruggestuurd voor verwerking.
- Als tracheale aspiratie wordt vermeld, gebruikt u een katheter uitpakken airway afscheidingen.
- Vooraf de katheter zorgvuldig halverwege in de Endotracheale tube en 5 mL van de steriele normale zoutoplossing 0,9% van een vooraf ingevulde 10 mL spuit inboezemen.
- Wanneer de katheter is volledig gevorderd of weerstand wordt voldaan, de afscheidingen gecombineerd en verzamelen in een steriele sputum collectie container.
- 10 mL van de tracheale afscheidingen in een steriele sputum container verzamelen en plaats deze op het ijs. Verzenden van monsters onmiddellijk voor verwerking.
3. De tracheale secretie monstervoorbereiding
Opmerking: Alle experimenten moeten worden uitgevoerd onder een kast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bioveiligheid.
- 1 mL van de luchtweg secretie monsters in 9 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een kunststof 10 mL spuit (voor een 10 x verdunning) verspreiden. Gebruik een botte pipet te homogeniseren van het slijm monster.
- Stam de verdunningsmiddel met een 40 µm nylon cel zeef grote brokken of bloedstolsels, die de microfluidics toegang gat of het kanaal blokkeren kan te verwijderen. Leg het monster op het ijs na verwerking.
- Verspreiden de verdunningsmiddel van elk monster met behulp van een 100 x volume van PBS buffer, wat resulteert in een 1.000 x verdunde schorsing. Leg het monster op het ijs tijdens het gehele dissociatie.
4. experimentele opstelling
Opmerking: Alle experimenten moeten worden uitgevoerd onder een kast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bioveiligheid.
- Monteer de PDMS chip met de vloeistof gids voor uniforme stroming toepassen op elk van de vier spiraal microchannels (figuur 1B).
Opmerking: Vier kanalen werden gebruikt om de doorvoer te verhogen door paralellisatie, alsmede de optimalisatie van de dichtheid van het volume en de cel van de resulterende schorsing. De vloeistof gids is ontworpen en gemaakt met een stereolithography type 3D-printer met heldere hars. De inlaat en de uitlaat-poort van de vloeistof gids gebruiken vrouwelijke Luer-aansluitingen voor het gemak van de verbinding en stabiele afdichting tijdens de operatie. - Sluit een 1/16-inch male Luer connector aan de inlaat, het innerlijke stopcontact (IW) en de buitenmuur (OW) retourzijde van de vloeistof gids en een silicone slangen tot de schorsing van de steekproef.
- Invoegen van botte tips aan elk uiteinde van de inlaat- en uitlaatopeningen te bereiken van de bodem van het reservoir van de steekproef.
- Sluit de peristaltische pomp met de inlaat buis.
- Plaats van het einde van de inlaat buizen en IW uitlaat slang in het monster reservoir en plaats het einde van de OW uitlaat slang in het afval reservoir (Figuur 1 c, D).
- Plaats de tube 50 mL van gefilterde PBS zonder calcium en magnesium aan het monster reservoir.
- Beginnen met pompen in een laag debiet (~ 1 mL/min) naar het apparaat prime.
Opmerking: Wanneer bubbels worden vastgelegd in het kanaal, druk op de top van het kanaal met de pincetten te destabiliseren en te elimineren luchtbellen. Wanneer het apparaat is volledig gevuld met bufferoplossing, wijzigen de PBS buis ter voorbereiding van de luchtweg secretie monsterbuisje. - Wanneer het monster wordt geplaatst in het reservoir van de steekproef, zet de peristaltische pomp en het debiet vastgesteldop 4 mL/min (Figuur 1 c, D).
- Wanneer het monstervolume bereikt het aangewezen volume (~ 1 mL), de operatie stoppen en koppel de Siliconen slang.
Opmerking: De voorgestelde methode is efficiënter om een grote hoeveelheid oplosmiddel (> 50 mL) tot een micro-centrifuge buis volume (~ 1 mL) (Figuur 2).
5. Stroom Cytometry analyse
Opmerking: Om te vergelijken de dissociatie-methoden (microfluidics en lysis), stroom cytometry met immunofluorescentie werd gebruikt.
- Voeg fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) - geconjugeerd muis anti-menselijke CD66b monoklonaal antilichaam en allophycocyanin (APC) - geconjugeerd muis anti-menselijke CD45 monoklonaal antilichaam aan de initiële schorsingen (stap 3.3) en de resulterende schorsingen (stap 4.9) (200 µL van elke antilichaam) in een verhouding van 1:25 v/v.
- Incubeer de monsters bij 4 ° C in het donker gedurende 30 minuten.
- Het analyseren van beide monsters op een cytometer van de stroom te kwantificeren van de PMNs.
Opmerking: De bevolking thats FITC-APC dubbele positief, CD66b positieve en CD45 positief werd beschouwd als neutrofiele granulocyten. Herstel werd berekend door de verhouding van de cel totaal getallen voor de input en de resulterende schorsing.
6. NE Release analyse
Opmerking: Als u wilt vergelijken de functionaliteit van de geïsoleerde neutrofiele door de microfluidics en de lysis methode, een NE assay kit werd gebruikt.
- PMA (meegeleverd in de kit assay) toevoegen aan elke resulterende schorsing (verkregen bij stap 4.9) om een eindconcentratie van 50 nM.
- Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer de schorsingen bij 300 x g gedurende 10 minuten.
- 10 µL van elke supernatans overbrengen in een 96-wells-plaat (waarin de assay kit).
Opmerking: Een 96-Wells-microplate met een vlakke bodem en een zwarte polystyreen kan ook worden gebruikt. - Voeg 90 µL van verdunde assay buffer (meegeleverd in de kit assay) toe aan elk putje.
- Voeg 10 µL van het elastase substraat (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, waarin de assay kit).
- Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C.
- Lees de 96-wells-plaat met behulp van een Fluorimeter bij een golflengte van de excitatie van 485 nm en een golflengte van de emissie van 525 nm.
Opmerking: Het niveau van NE werd gedeeld door de PMN-graaf van de stroom cytometry analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We bereikt transparante immuun-cel suspensies met beide DTT mucolysis en microfluidics dissociatie (figuur 3A). Microfluidics dissociatie verzameld 4,40 x 105 PMNs gemiddeld (2.1 x 104 tot 5,60 x 105 PMNs, n = 6) uit de luchtwegen secretie monsters verdunde 1,000-fold (50 mL totale volume) in 1 mL schoon schorsing. In vergelijking met de aanvankelijke verdunningsmiddel, 94,0% PMNs (CD66b+/CD45+) werden te...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In inertial microfluidics localiseren deeltje en cellen op een bepaalde laterale positie in een micro-kanaal op basis van hun grootte5,18,19,20. Als gevolg van het gecombineerde effect van de decaan Sleep kracht en de kracht van de traagheids lift in de gebogen microchannel, grote deeltjes of neutrofiele granulocyten (> 10 µm) bevinden zich in het kanaal en kleine deeltjes, slijm aggregaten en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben een octrooiaanvraag geplaatst op de hier beschreven technologie.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door NIH/NIAID (R21AI119042) en NIH U24 monster Sparing assay programma (U24-AI118656).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 verhouding van basis en uitharder |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor om in 90 grade te harden. |
| 100mm petrischaal | VWR | 89000-324 | Fabricage van PDMS ondersteunende laag |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2 mm diameter of anders afhankelijk van de slangmaat |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Oppervlakteplasmabehandeling voor PDMS apparaat naar ondergrond. |
| 2” x 3” glasplaatje | TED PELLA, INC. | 2195 | Om PDMS apparaat te ondersteunen |
| Masterflex spoel platina-gecureerde siliconen slang, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Slang voor microfluïdica en peristlatische pomp |
| 1/16 inch Luer-aansluiting, mannelijk | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Aansluiting voor vloeistofgeleiding |
| 50mL Falcon buis | Corning | 21008-940 | Monsterverzameling & voorbereiding |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing, 1X zonder calcium en magnesium | Corning | 45000-446 | Bufferoplossing om monster te verdunnen |
| Halyard Gesloten zuigkatheter, Elleboog, 14F/kanaal 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceatie zuigkatheter |
| 0.9% Steriele Normale zoutoplossing, 10mL voorgevulde spuit | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | Voor tracheale seceatie verzameling van de patiënten |
| SecurTainer™ III Monstercontainers, 20mL | Simport | 1176R36 | Steriele sputum (luchtwegsecretie) verzamelcontainer |
| Spuit met Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | Om de slijmmonster te homogeniseren en de bodem van het monsterbuisje te bereiken |
| BD Blunt Fill Naald, met BD Luer-Lok Tip | BD | Om het slijmmonster te homogeniseren en de bodem van het monsterbuisje te bereiken | |
| 40µm nylon celzeef | Falcon | 21008-949 | Om grote stukken of bloedstolsels te verwijderen, die de microfluïdica toegangsopening of het kanaal kunnen blokkeren. |
| Peristaltische pomp (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | Werking van microfluïdica |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Kwantificering van celherstelratio |
| Fluoresceïne isothiocyanate (FITC)-geconjugeerd muis anti-humaan CD66b monoklonaal antilichaam | BD Bioscience | 561927 | Immunokleuring van neutrofielen voor Flow cytometer analyse |
| Allophycocyanine (APC)-geconjugeerd muis anti-humaan CD45 monoklonaal antilichaam | BD Bioscience | 561864 | Immunokleuring van neutrofielen voor Flow cytometer analyse |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader voor neutrofiel elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrofiel elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrofiel functionaliteitsbeoordeling |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescente deeltjes om de witte bloedcel traject in microfluïdica uit te drukken |
Referenties
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001(2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018(2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703(2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475(2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319(2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
