Hier presenteren we een protocol om te testen van de virulentie van de plant met de plant pathogen Magnaporthe grisea. Dit verslag zal bijdragen tot de grootschalige screening van de biotypen van schimmels isolaten en dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het begrijpen van de resistente mechanismen van planten tijdens de moleculaire veredeling.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De Plant infectie Test: Spray en wond-gemedieerde inoculatie met de Plant Pathogen Magnaporthe Grisea
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Planten bezitten een krachtig systeem om zich te verdedigen tegen potentiële bedreigingen door pathogene schimmels. Voor agrarisch belangrijke planten, echter het is gebleken dat huidige maatregelen ter bestrijding van deze ziekteverwekkers te conservatief en, dus, niet voldoende effectief, en ze kunnen potentieel vormen milieurisico's. Daarom is het uiterst noodzakelijke host-weerstand factoren bij het controlerende plantenziektes natuurlijk door de identificatie van resistente kiemplasma, de isolatie en karakterisatie van resistentiegenen en de moleculaire veredeling te identificeren van resistente cultivars. In dit verband is er nodig om een nauwkeurige, snelle en grootschalige beëntingsmethode om te fokken en ontwikkelen van resistentiegenen plant. De rijst blast schimmel pathogeen Magnaporthe grisea oorzaken ernstige ziekte symptomen en verliezen opleveren. Onlangs, M. grisea heeft ontpopt als een modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van plant-schimmel pathogeen interacties. Vandaar, rapporteren we de ontwikkeling van een plant virulentie testmethode die specifiek is voor M. grisea. Deze methode biedt voor zowel spray inoculatie met een conidial suspensie en verwonden inoculatie met mycelium kubussen of druppels van conidial schorsing. De belangrijkste stap van de verwonding beëntingsmethode voor vrijstaande rijst bladeren is om wonden op de bladeren van de plant, die elke storing die wordt veroorzaakt door gastheer penetratieweerstand vermeden. Deze spray/verwonden protocol draagt bij aan de snelle, nauwkeurige en grootschalige screening van de biotypen van M. grisea isolaten. Dit geïntegreerd en systematische plant infectiemethode zal dienen als een uitstekend uitgangspunt voor het verkrijgen van een breed perspectief van onderwerpen in de fytopathologie.
Inleiding
Rijst blast, veroorzaakt door M. grisea, is een van de ernstigste ziekten voor rijst variëteiten wereldwijd1,2. Het proces waarmee M. grisea gastheerplanten infecteert omvat een conidiën productie als oppervlakte gehechtheid, een conidiën kieming en de vorming van appressorium, een formatie van de penetratie peg en besmettelijke schimmeldraad differentiatie, en een ziekte verspreid 3. al deze fasen zijn gebruikelijk in vele andere plant plantpathogene schimmels en, inderdaad, een blokkade van alle ééntraps voorkomt dat de besmetting van waardplanten. Als gevolg van zijn economische belang en de genetische werkwillig, heeft M. grisea ontpopt als een modelorganisme voor het bestuderen van de mechanismen van de plant-schimmel pathogeen interacties1,4. Dus, het bestuderen van de moleculaire basis van deze ontwikkelingsstadia in M. grisea zal helpen ophelderen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de schimmel pathogeniteit en de identificatie van kandidaat-doelgenen voor screening en ontwerpen roman fungiciden5.
Recente verslagen over M. grisea infectie hebben gericht op de moleculaire mechanismen van de stadia van de pre-penetratie, met name de conidiation, de appressorium-vorming, de penetratie pinnen en de besmettelijke groei3, 6. het is daarom essentieel voor de ontwikkeling van een gedetailleerd protocol om te testen van M. grisea infectie. Hierin presenteren wij een gedetailleerde methode voor een infectie-test die maakt gebruik van de spray-gemedieerde infectie testen met een conidial vering en de inoculatie van wonden met mycelial stekkers van M. grisea. In dit verslag, het protocol is gericht op de cultuur van stammen, de voorbereiding van de conidiation oplossing voor het spuiten, en de mycelial plug-gemedieerde inoculatie van planten met M. grisea. Deze stappen worden beschreven in detail hieronder, en een schematische weergave van de volledige workflow van de methode en een typische laesie worden weergegeven in de figuren 1 en 2, respectievelijk.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. spray inoculatie met een suspensie van M. grisea conidiën
-
Schimmel cultuur voor M.grisea
- Het kweekmedium havermout tomaat agar (OTA) voorbereiden op schimmel stammen.
- Weeg 30-50 g havermout, voeg dit toe aan 800 mL gedestilleerd/gedeïoniseerd water (ddH2van O) en kook het mengsel gedurende 30 minuten in de elektrische pot.
- Filtreer het gekookte havermout SAP in het bekerglas door een stuk van gaas.
- 150 mL tomatensap en 20 gram agar aan het filtraat in het bekerglas toevoegt ddH2O en vul aan tot 1000 mL.
-
Voorbereiding van experimentele materialen
- Geniet van ongeveer 50 zaden van rijst (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) in ddH2O voor 3 d of geniet van ongeveer 50 zaden van gerst (Hordeum vulgare cv Golden beloof) in ddH2O voor ongeveer 1 d.
- Wikkel de zaden van rijst of gerst in vochtig gaas en ontkiemen hen op vochtige filterpapier in ongeveer 30 petrischaaltjes met een diameter van 10 cm x 10 cm bij 28 ° C. De rijst zaad kiemkracht tijd is ongeveer 2-3 d, de gerst zaaitijd kiemkracht is ongeveer 2 d. De relatieve vochtigheid in de kas is ongeveer 70%.
- Plant de zaailingen van de rijst of gerst in potten met behulp van gesteriliseerde met autoclaaf potgrond en drenken en dan bedek ze met een laagje vermiculiet.
- Plaats de planten in een geschikte kas of groei kabinet bij 25 ° C gedurende ongeveer 1 ~ 2 weken.
- Snijd 3 lagen filtreerpapier in cirkels met een steriele chirurgische schaar (elke cirkel moet hebben een diameter van 8 cm) en leg ze op 100 mm steriele kunststofplaten.
- DdH2O toevoegen aan elk gerecht om te genieten van het koffiefilter.
- Zorg ervoor dat het filter papier volledig nat is, maar geen extra water toevoegen.
- Verwijder overtollig water met een vacuümpomp.
- Plaats 2 steriele tandenstokers in de cultuur-schotel ter ondersteuning van de rijst/gerst verlaat; de tandenstokers ruimte ~ 2-3 cm uit elkaar.
- Verzamelen van de bladeren van de rijst 2 weken na het zaaien de zaden of neem de bladeren van de gerst 7 d na het zaaien de zaden.
- Met behulp van 4 - tot 6-blad zaailingen van rijst/gerst, knip het onderste deel van de stengel op ~ 5 cm van de bovenkant en verzamelen van de bladeren.
-
Spray inoculatie protocol
- Cultuur van de schimmel druk op OTA platen in een thermostatische incubator (25 ° C) voor ~ 4 d.
- Voeg ~ 2 mL ddH2O met behulp van een 0,5 - 5 mL pipet aan elke 4 dagen oude plaat.
- Schraap met een inenting lus, de mycelia van de stam van de wild-type M. grisea en de gemuteerde stam in mycelia puin.
- Het puin mycelia verzamelen en overbrengen naar een nieuwe OTA-plaat. Neem de mycelia puin en klap droog in de schone Bank.
- De afdekplaat met 3 lagen van gaas om de vochtigheid nodig voor de groei van de conidiën in een kas bij 25 ° C in de dag (14u) en 23 ° C in de nacht (10 h) voor 24-48 h.
- Voeg 2 mL ddH2O toe aan elk gerecht en schraap de conidiën zachtjes met steriel katoenen wissers gevolgd door een filtratie door 2 lagen papier van de lens. Wees voorzichtig niet om krassen op het oppervlak van het kweekmedium.
- Spoel de conidiën suspensie in een nieuwe 50 mL-buis met een 100-1000 µL pipet.
- Centrifugeer gedurende 5 min op een minimum van 5.000 x g bij 25 ° C.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet te geven 2 x 104 conidiën per mL in een 0,025% (v/v) Tween-20 oplossing. De oplossing van Tween-20 is meestal ongeveer 10-20 mL.
- Giet de entsuspensie in een hand-held sproeier.
- Spay ongeveer 10 mL van de conidial ophanging op de bladeren van de rijst 2-week-oude rijst zaailingen of gerst bladeren van 7-dag oude gerst zaailingen en uit te broeden ze bij 25 ° C in een donkere, vochtige kamer voor ~ 24 h. Spray de planten van de controle met de 0,025% (v/v) Tween-20 oplossing.
- Breng de bladeren in een andere vochtige kamer onder tl-licht bij 25 ° C voor een fotoperiode van 12u.
- De symptomen van de ziekte bij 5 d na de inoculatie opnemen. Onderzoeken van het zieke rijst/gerst bladen van ~ 6 cm in lengte. De standaard beoordeling is volgens het scoresysteem voor blast weerstand van de International Rice Research Institute (IRRI). De details van het scoresysteem voor blast weerstand zijn vermeld in tabel 1.
- Foto van de bladeren te evalueren van de infectie van de geteste soorten. De infectie werd beoordeeld door het aantal laesies per 3,6 cm2.
2. het verwonden van inoculatie met Mycelium kubussen of druppels van Conidial opschorting van M. grisea
- Met behulp van een anatomische naald, schraap drie 2-3 cm lange wonden in de belangrijkste aderen van vrijstaande rijst/gerst bladeren; Wees voorzichtig niet te doordringen van de bladeren.
- De geschraapt bladeren zetten tandenstokers en spray een 0,02% (v/v) Tween-20 oplossing op de bladeren vormen een laag van druppels.
- Snijd een mycelial stekker van 0,5 x 0,5 cm voor elke stam M. grisea (wild-type, mutant, aanvulling stammen, of andere teststammen) van een OTA-plaat.
- Zet de mycelial stekkers of 25 µL druppels conidial vering op de gewonde bladeren en de bladeren bij 25 ° C in een vochtige kamer voor 3-8 d uit te broeden.
- De letsels op 5-7 d na inoculatie onderzoeken. De methode van onderzoek is het zelfde zoals het was voor de spray beëntingsmethode (zie stap 1.3.13).
- Onderzoeken van het zieke rijst/gerst bladen van ~ 6 cm in lengte en fotograferen om te evalueren van de infectie van de geteste soorten. De infectie werd beoordeeld door het aantal laesies per 3,6 cm2.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De volledige werkstroom voor de techniek is afgebeeld in Figuur 1. De plant infectie testen werden uitgevoerd op 14-dag oude gevoelig rijst zaailingen (O. sativa cv CO-39) of gevoelig 7 dagen oude gerst verlaat (H. vulgare cv Golden beloof)7,8,9. Om te testen voor een infectie op de rijst bladeren, een conidial suspensie (1.0 x 105 sporen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Plant ziekte resistentiegenen spelen een essentiële rol bij het voorkomen van infecties door ziekteverwekkers, met inbegrip van schimmel ziekteverwekkers1,12. Rijst blast is gebruikt als een model te begrijpen van de aard van pathogen bevolking structuren en genen4van de weerstand van de plant. Daarom is het noodzakelijk de ziekte weerstand genotype en avirulentie genotypen van de belangrijkste soorten vezelgewassen op grote schaal om ziek...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesteund door de speciale wetenschappelijke onderzoeksproject van de Universiteit van Peking landbouw (YQ201603) en het Wetenschappelijk Project van de educatieve Commissie van Peking (KM201610020005).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Filterpapier | GE Healthcare merk(Zweden) | 10311387 | |
| 50-mL buis | CORNING(Amercia) | 430290 | |
| Centrifuge | Eppendorf(Amercia) | 5804R | |
| Kweekschaal | Thermofisher(Amercia) | 150326 | |
| 0,5-5 mL pipet | Eppendorf | 4920000105 | |
| 100-1000uL pipet | Eppendorf | 4920000083 | |
| Vacuumpomp | Leybold | D25B | |
| Dissectie naald | FST | 26000-35 | |
| Incubator | MEMMERT | PYX313 | |
| Inoculatiering | Greiner Bio One | 731175 |
Referenties
- Li, W. T., et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance. Cell. 170 (1), 114-126 (2017).
- Chi, M. H., Park, S. Y., Kim, S., Lee, Y. H. A novel pathogenicity gene is required in the rice blast fungus to suppress the basal defenses of the host. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000401(2009).
- Jia, Y., Valent, B., Lee, F. N. Determination of host responses to Magnaporthe grisea.on detached rice leaves using a spot inoculation method. Plant Disease. 87 (2), 129-133 (2003).
- Ebbole, D. J. Magnaporthe as a model for understanding host-pathogen interactions. Annual Review of Phytopathology. 45, 437-456 (2007).
- Hamer, J. E., Talbot, N. J. Infection-related development in the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Current Opinion in Microbiology. 1 (6), 693-697 (1998).
- Howard, R. J., Valent, B. Breaking and entering: host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 50, 491-512 (1996).
- Chen, X. L., et al. N-Glycosylation of Effector Proteins by an α-1,3- Mannosyltransferase Is Required for the Rice Blast Fungus to Evade Host Innate Immunity. The Plant Cell. 26 (3), 1360-1376 (2014).
- Zhang, Y., et al. M.ARG1, MoARG5,6 and MoARG7 involved in arginine biosynthesis are essential for growth, conidiogenesis, sexual reproduction, and pathogenicity in Magnaporthe oryzae. Microbiological Research. 180, 11-22 (2015).
- Du, Y. X., et al. A serine/threonine-protein phosphatase PP2A catalytic subunit is essential for asexual development and plant infection in Magnaporthe oryzae. Current Genetics. 59 (1-2), 33-41 (2013).
- Yang, J., et al. A novel protein com1 is required for normal conidium morphology and full virulence in Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 23 (1), 112-123 (2010).
- Cao, Z. J., et al. An ash1-like protein MoKMT2H null mutant is delayed for conidium germination and pathogenesis in Magnaporthe oryzae. BioMed Research International. 2016, 1575430(2016).
- Bryan, G. T., et al. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. The Plant Cell. 12 (11), 2033-2045 (2000).
- Zhou, J. M. Plant pathology: a life and death struggle in rice blast disease. Current Biology. 26 (18), 843-845 (2016).
- Guo, M., et al. MoGrr1, a novel F-box protein, is involved in conidiogenesis and cell wall integrity and is critical for the full virulence of Magnaporthe oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (19), 8075-8088 (2015).
- Talbot, N. J. On the trail of a cereal killer: Exploring the biology of Magnaporthe grisea. Annual Review of Microbiology. 57, 177-202 (2009).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews Microbiology. 7, 185-195 (2009).
- Jia, Y. L., Lee, F. N., McClung, A. Determination of Resistance Spectra of the Pi-ta and Pi-k Genes to U.S. Races of Magnaporthe oryzae Causing Rice Blast in a Recombinant Inbred Line Population. Plant Disease. 93, 639-644 (2009).
- Peng, Y. L., Shishiyama, J. Temporal sequence of cytological events in rice leaves infected with Pyricularia oryzae. Canadian Journal of Botany. 66 (4), 730-735 (1988).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
