Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen

6.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57688

⸱

19 juni 2018

 ,  , 
1Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 2Department of Bioengineering, University of California at San Diego

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een schaalbare methode, met behulp van een eenvoudige combinatie van Activin A en lentivirus-gemedieerde Id1-overexpressie, voor het genereren van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen.

Samenvatting

De generatie van grote hoeveelheden van functionele menselijke pluripotente stamcellen cardiale voorlopercellen en cardiomyocytes van gedefinieerde hart veld oorsprong is een vereiste voor cel-gebaseerde cardiale therapieën en modellering van de ziekte. We hebben onlangs aangetoond dat Id genen zowel noodzakelijk zijn en voldoende om aan te geven van de eerste veld voorlopercellen van het hart tijdens de ontwikkeling van de gewervelde. Deze differentiatie-protocol maakt gebruik van deze bevindingen en Id1 overexpressie gebruikt in combinatie met Activin A potent opgeven signalen te produceren eerste hart veld-achtige (FHF-L) progenitoren. Bovenal differentiëren resulterende progenitoren efficiënt (~ 70-90%) in ventriculaire-achtige cardiomyocytes. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode 1) worden gegenereerd Id1-overexpressing hPSCs en 2) schaalbare hoeveelheden cryopreservable FHF-L progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes onderscheiden.

Inleiding

Grootschalige productie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)-afgeleide cardiale progenitoren en cardiomyocytes is een eerste vereiste voor stamcel gebaseerde therapieën1, modelleren van2,3 en de snelle karakterisering van ziekte nieuwe trajecten regulering van de cardiale differentiatie4,5,6 en fysiologie7,8. Hoewel een aantal studies9,10,11,12,13,14hebben,15 eerder beschreven hoogefficiënte de protocollen van de cardiale differentiatie van hPSCs, geen heeft gericht de hart veld oorsprong van resulterende cardiomyocytes, ondanks de identificatie van moleculaire verschillen tussen links (eerste hart veld) en rechts (tweede hart-veld) ventriculaire cardiomyocytes16 en het bestaan van hart veld-specifieke aangeboren hartziekten; dat wil zeggen, hypoplastic linker hart syndroom17 of arrhythmogenic recht ventriculaire dysplasie18. Dus, de generatie van cardiale voorlopercellen en cardiomyocytes van gedefinieerde hart veld oorsprong van hPSCs wordt steeds een noodzaak teneinde hun relevantie als therapeutische en ziekte modeling tools.

Dit protocol is gebaseerd op de constitutieve overexpressie van Id1, een onlangs geïdentificeerde5 eerste hart veld-opgeven cue thats in combinatie met Activin A, noodzakelijk en voldoende zijn om te starten van cardiogenesis in hPSCs. Met name Cunningham et al. (2017) 5 Toon dat Id1-geïnduceerde progenitoren specifiek express eerste hart-veld (HCN4, TBX5) maar niet het tweede hart veld markeringen (SIX2, ISL1) als ze cardiale differentiatie ondergaan. Bovendien, tonen de auteurs ook dat transgene muis embryo's ontbreekt de hele Id familie van genen (Id1-4), zonder dat zij eerste hart veld cardiale progenitorcellen, terwijl meer mediaal en posterieure cardiale progenitoren (vormen ontwikkelen tweede hart-veld) kan nog steeds vormen, waardoor suggereren dat Id eiwitten essentieel zijn voor het eerste hart veld cardiogenesis geactiveerd in vivo. Gunstig, Id1-geïnduceerde progenitoren kunnen worden cryopreserved en spontaan onderscheiden in cardiomyocytes ventriculaire-achtige kenmerken, met inbegrip van ventriculaire-specifieke markeringen (IRX4, MYL2) expressie weer te geven en ventriculaire-achtige actie potentieel.

Hier beschrijven we een eenvoudige en schaalbare methode voor het genereren van eerste hart veld-achtige (FHF-L) cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige cardiomyocytes van Id1 overexpressing hPSCs. Een belangrijk kenmerk van dit protocol is de mogelijkheid om het afkoppelen van cardiale voorlopercellen generatie van latere cardiomyocyte productie met behulp van een handige cryopreservatie stap. Kortom, dit protocol gegevens de nodige maatregelen om (1) genereren Id1-overexpressing hPSCs, (2) genereren FHF-L cardiale progenitoren uit hPSCs (3) cryopreserve van de resulterende progenitoren en (4) hervatten FHF-L cardiale voorlopercellen differentiatie en genereren hoogverrijkt (> 70-90%) ventriculaire-achtige cardiomyocytes gewonnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Id1 Virus voorbereiding en infectie

  1. De overexpressing lentivirus Id1 door co transfecting pCMVDR8.74, pMD2.G en pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR genereren (Addgene: plasmide #107735) in HEK293T cellen. Virale deeltjes verzamelen, filtraat zuiveren van het supernatant en opslaan bij-80 ° C zoals Kitamura et al. (2003) 19. als alternatief, produceren Id1 lentivirus commercieel door pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR te sturen naar een lentivirus-producerende leverancier.
    Let op: Volg lentivirale veiligheidsvoorschriften en standaardwerking protocollen.
    Opmerking: Belangrijk: optimale virus titer moet ten minste 108 tot 109 Transducing eenheden/mL (TU/mL).
  2. Jas voorafgaand aan infectie, één putje van een 96 goed plaat met 50 µl van coating reagens, meestal een gelatine-achtige eiwitten mengsel uitgescheiden door Engelbreth-Holm-Swarm muis Sarcoom cellen (Zie Tabel van materialen).
  3. Een putje van pluripotente stamcellen gekweekt in een 6 goed plaat door toevoeging van 1 mL PBS zonder Ca2 + en Mg2 + en met 0,5 mM EDTA distantiëren.
    Opmerking: Dissociatie tijd varieert van 3 – 10 min. Wanneer meer dan 80% van de cellen zijn losgekoppeld van de onderkant van de plaat, verder voor volgende trede.
  4. Celsuspensie met steriele Pipetteer in 15 mL kunststof centrifugebuis verzamelen.
  5. Neutraliseer dissociatie reagens met 5 mL PBS-bevattende Ca2 + en Mg2 +.
  6. Pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).
  7. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick de buis om te verjagen van de pellet.
  8. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de media van de cel van de stam.
  9. Cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller na instructies van de leverancier te tellen.
  10. Plaat 20.000 levensvatbare cellen per well (96-wells-plaat) gecoat in 50 µL van stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer (Zie tabellen 1 en 2).
  11. Na 24u, controleren voor bevestiging van de cel en media te vervangen door 100 µl stamcel media aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer en 6 ng/mL hexadimethrine bromide (Zie tabellen 1 en 2), één h vóór lentivirale infectie.
    Opmerking: Cellen moeten stevig worden gekoppeld aan de onderkant van de plaat.
  12. Ontdooi Id1-lentivirus op ijs.
  13. Voeg 3 µL van gezuiverde lentivirus per putje (virus titer moet tussen 108 tot 109 TU/mL), en breng de plaat terug naar cel cultuur incubator (5% CO2, 37 ° C, 20% O2).
  14. 24u na virale infectie, voeg 100 µL van de cel van de stam van de nieuwe media aan de geïnfecteerde cellen.
  15. 48 h na lentivirale infectie, vervangen virus met media met 200 µL van de cel van de stam van de verse media aangevuld met 1 µg/mL puromycin.
  16. Refresh media dagelijks met 200 µL van stamcel media aangevuld met 1 µg/mL puromycin.
  17. Wanneer culturen 80% confluentie bereikt, distantiëren cellen met behulp van 200 µL van PBS zonder Ca2 + en Mg2 + + 0.5 mM EDTA (voor een put van een 96-wells-plaat).
  18. Celsuspensie in een centrifugebuis verzamelen.
  19. Neutraliseer dissociatie reagens met 5 mL PBS-bevattende Ca2 + en Mg2 +.
  20. Pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).
  21. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick de buis om te verjagen van de pellet.
  22. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.
  23. Alle cellen (1 mL) overbrengen in een gecoate goed van een 12-well-plaat.
  24. Na 24u, monitor voor cel gehechtheid aan de media van het goed en vervangen met 1 mL van stamcel media aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer en 6 ng/mL hexadimethrine bromide, één h vóór transductie.
  25. Ontdooi Id1-lentivirus op ijs.
  26. Voeg 5 µL van gezuiverde virus per putje (12-well plaat).
  27. 24u na lentivirale infectie, vervangen virus met media met 1 mL van de cel van de stam van de nieuwe media, aangevuld met 3 µg/mL puromycin.
  28. 48 h post lentivirale infectie, virus met media met 1 mL van de cel van de stam van de verse media aangevuld met 6 µg/mL puromycin vervangen.
  29. Wanneer culturen 80% confluentie bereikt, distantiëren cellen met behulp van 500 µL van PBS zonder Ca2 + en Mg2 + en met 0,5 mM EDTA (voor één putje van de plaat van een 12-well).
  30. Overdracht van de helft (250 µL) van de celsuspensie aan één putje van een coating reagens gecoat 6-well plaat met 2 mL stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.
  31. Gebruik de andere helft (250 µL) van het monster voor RNA extractie en qRT-PCR om te bepalen lentivirale-gemedieerde Id1 expressie niveaus, zoals Colas et al. (2012) 4.
    Opmerking: Belangrijk: als Id1 mRNA uitdrukking niveaus lager zijn dan 0,005 vouw van GAPDH expressie niveau (Zie tabel 3 voor qRT-PCR inleidingen), herhaal infectie proces zoals hierboven beschreven totdat Id1 expressie niveaus hoger zijn dan de drempel.

2. hPSCsId1 onderhoud

  1. Cultuur hPSCsId1 in gecoate 6 goed-platen en groeien in 3 mL per putje van stamcel media aangevuld met 6 µg/mL puromycin.
  2. Wanneer hPSCsId1 80% confluentie bereikt, passage van de cellen als aggregaten (1:6 splitsingsverhouding) met behulp van enzym-vrije dissociatie reagens volgens richtlijnen van de leverancier en groeien in 3 mL per putje van stamcel media aangevuld met 6 µg/mL puromycin.

3. bereiding van hPSCsId1 differentiatie

  1. Jas van een 12-well plaat met 500 µL per putje coating reagens.
  2. Wanneer hPSCsId1 90% confluentie bereiken cellen distantiëren door toevoeging van 1 mL PBS zonder Ca2 + en Mg2 + en met 0,5 mM EDTA per putje voor 5-10 min. dissociatie proces elke minuut, en eens 80% van de cellen zijn losgekoppeld van de plaat , gaat u verder met de volgende stap.
  3. Celsuspensie in een centrifugebuis verzamelen.
  4. Neutraliseer dissociatie reagens met 5 mL PBS-bevattende Ca2 + en Mg2 +.
  5. Pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).
  6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick de buis om te verjagen van de pellet.
  7. Resuspendeer de cellen in 2 mL zuiver stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.
  8. Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter.
  9. De cellen van de plaat 300.000 per putje in 1 mL van de stamcel media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer en 6 µg/mL puromycin en overdracht plaat in weefselkweek incubator.
  10. Refresh media dagelijks met 2 mL stamcel media aangevuld met 6 µg/mL puromycin culturen tot 90% confluentie. Op dit punt, het initiëren van cardiale differentiatie (volgende stap).

4. differentiatie van hPSCsId1 in eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren (FHF-L CPs)

  1. Voor 12-well plaat formaat, starten differentiatie (dag 0) door vervanging van de stamcel media met 1,5 mL inductie media (tabel 1) aangevuld met Activin een (100 ng/mL) (Zie tabel 2 voor aanbevolen volumes en Activin A concentraties voor verschillende plaat formaten).
  2. Op dag 1 (24 h na differentiatie wordt gestart), door media te vervangen door 2 mL inductie media zonder Activin A (per putje van de plaat van een 12-well).
  3. Op dag 3, door media te vervangen door 2 mL inductie media zonder Activin A (per putje van de plaat van een 12-well).
  4. Op dag 5, verzamelen FHF-L CPs voor cryopreservatie (volgende stap).
    Opmerking: Belangrijk: Cryopreservatie heeft de voorkeur op dit punt, omdat het in staat stelt om het afkoppelen van de cardiale voorlopercellen generatie van latere cardiomyocyte productie en biobank grote batches van cellen. Opmerking dat ook dag 5 FHF-L CPs kan worden doorgegeven aan een vers beklede plaat voort te zetten van differentiatie, gelieve te verwijzen naar stap 5.1-5.5 naar passFHF-L CPs en gaat u verder met stap 6.5 voor differentiatie.

5. cryopreservatie van FHF-L CPs

  1. Alle media uit putten met dag 5 gecombineerd FHF-L CPs en snel Voeg 1 mL warm (37 ° C) 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens (Zie Tabel van materialen). Plaats de plaat in de weefselkweek incubator.
  2. Na 1 minuut, schud het plaat van links naar rechts in de incubator.
  3. Na 2 min (totaal tijd), verwijder plaat uit de incubator en voeg 1 mL 10% FBS media.
  4. Zachtjes Pipetteer cellen op en neer met een 5 mL-pipet om mobiele-detachement van de plaat.
  5. Verzamelen van celsuspensie naar een centrifuge buis en pellet cellen door centrifugeren bij 200 x g gedurende 3 min
  6. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver cryopreservatie reagens.
  7. Cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter.
  8. Cryopreservatie reagens toevoegen (Zie Tabel van materialen) op een voldoende volume aan het cryopreserve van de cellen op de gewenste concentratie (gewoonlijk 5-10 x 106 cellen/mL).
  9. Overbrengen van cellen naar cryopreservatie flesjes en plaats van flesjes in koeling apparaat (1 ° C/min) en plaats koeling apparaat in de vriezer-80 ° C's nachts.
  10. Na 24u, door bevroren flesjes te overbrengen in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag.
    Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.

6. FHF-L CP differentiatie in ventriculaire-achtige Cardiomyocytes

  1. Pipetteer dag 5 FHF-L CPs bevroren flesjes uit de opslag van vloeibare stikstof in droog ijs container.
  2. Plaats flesjes in het waterbad 37 ° C gedurende 2 à 3 minuten, tot celsuspensie is volledig ontdooid.
    Opmerking: Belangrijk: het ontdooien proces is tijdgevoelig. Cellen tot de cryopreservatie media bloot voor een buitensporige hoeveelheid tijd (dat wil zeggen, 10 min) levensvatbaarheid van de cellen zal afnemen.
  3. Cellen naar 15 of 50 mL centrifugebuis, afhankelijk van het aantal ontdooide flesjes overbrengen.
  4. Afzien van dropwise (5 druppels elke 30 seconden) voorverwarmde (37 ° C) cardiogeen media (tabel 1) tot de oplossing van de cel. Herhaal dit proces tot een 1:3 cryopreservatie media: cardiogeen media verhouding wordt bereikt. Op dit punt, de cardiogeen media toevoeging tarief te verhogen tot een 1:10 cryopreservatie media: cardiogeen media verhouding wordt bereikt.
    Opmerking: Belangrijk: snelle osmolariteit wijzigingen zal toenemen celdood tijdens het ontdooien; Daarom, dropwise toevoeging van cardiogeen media zoals hierboven beschreven wordt sterk aanbevolen.
  5. Centrifugeer cel schorsing en pellet cellen door middel van centrifugeren (200 x g gedurende 3 minuten).
  6. Verwijder de bovendrijvende vloeistof en zachtjes flick centrifugebuis te verjagen cel pellet.
  7. Resuspendeer de cellen met cardiogeen media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.
    Opmerking: Levensvatbaarheid van de cellen kan variëren van dooi te ontdooien, en in het algemeen, > 65% levensvatbaarheid voorspelt goed plating efficiëntie.
  8. Verdunde geconcentreerd celsuspensie met cardiogeen media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject-remmer te verkrijgen van de gewenste cel concentratie voor beplating (Zie tabel 2 voor verschillende plaat formaten).
    Opmerking: Belangrijk: cardiale differentiatie efficiëntie kan weigeren als cellen worden overgeënt te dun.
  9. Zaad-cellen op plaat.
  10. Houd plaat in de kap van de weefselcultuur voor 20 min alvorens over te dragen aan weefselkweek incubator.
  11. Controleren op dag 6 van differentiatie, cel bijlage.
    Opmerking: Cardiac progenitoren zijn cryopreserved op dag 5 van de differentiatie. 24 h na het ontdooien van de cellen wordt vastgesteld op dag 6 van de differentiatie.
    Opmerking: De aanwezigheid van zwevende (dode) cellen is gemeenschappelijk.
  12. Op dag 7, gecombineerd van 50% van de media en vervangen met een gelijke hoeveelheid verse cardiogeen media.
    Opmerking: De toevoeging van RHO/ROCK traject remmer aan de cardiogeen media is niet nodig na dit punt.
  13. Vervangen door 50% van de media cardiogeen media om de andere dag.
  14. Opmerking spontane verslaan die wordt weergegeven tussen dag 11 en dag 13.
  15. Op dag 15, cardiale differentiatie efficiëntie te kwantificeren met immunofluorescentie met behulp van de DAPI (nucleus vlek) en ACTC1 (pan-cardiale marker).

7. passeren en het onderhoud van ventriculaire-achtige Cardiomyocytes

Opmerking: Door de dag 14 – 16: een monolayer van spontaan aanbestedende ventriculaire-achtige cardiomyocytes moet worden verkregen. Op dit punt wordt voorgesteld te distantiëren en opnieuw cardiomyocytes Meng de cultuur te voorkomen dat cellen loskoppelen van de plaat plaat.

  1. Alle media uit putten gecombineerd en snel Voeg 1 mL voorverwarmde (37 ° C) 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens.
    Opmerking: 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens volumes variëren, afhankelijk van de indeling van de plaat, maar moet volledig bedekt de bodem van het goed oppervlak.
  2. Pipetteer plaat in een incubator weefselkweek.
  3. Voorzichtig schudden plaat links naar rechts om de 2 min binnen de incubator te versnellen detachement.
  4. Na 5 – 15 min, wanneer 80% tot 100% van de cellen zijn losgekoppeld van de onderkant van de plaat, verwijderen de plaat uit de incubator en 1 x enzym-bevattende dissociatie reagens activiteit remmen door een gelijk volume van 10% FBS media toe te voegen.
    Opmerking: Incubatietijd met 1 x enzym-bevattende dissociatie voor dit proces zal variëren van batch tot batch.
  5. Verzamelen celsuspensie een centrifugebuis.
  6. Meng celsuspensie met pipet en het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde cel counter.
  7. Verdun celsuspensie gewenste cel concentratie (Zie tabel 2 voor verschillende plaat formaten) met onderhoud media, aangevuld met 2 µM RHO/ROCK traject remmer.
  8. Na het zaaien cardiomyocytes op het bord, de cellen verdelen en laat de cellen koppelen voor 10 – 20 min vóór de overbrenging van plaat tot weefselkweek incubator.
  9. 24 h na opnieuw plating, controleren cel gehechtheid en herstel.
    Opmerking: De aanwezigheid van zwevende (dode) cellen is gemeenschappelijk. 48-72 uur na het opnieuw plating, cardiomyocyte moet hervatten spontane contractie.
  10. Als u wilt behouden cardiomyocyte cultuur, vervangen door 50% van de media de media onderhoud om de andere dag tot gebruik van ventriculaire-achtige cardiomyocytes voor latere experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Generatie van hPSCs Id1 lijnen
hPSCs zijn besmet met een lentivirus bemiddelen Id1 overexpressie(Figuur 1). Zodra hPSCId1 worden gegenereerd, wordt transgenic expressie gekwantificeerd door qRT-PCR (Figuur 1B). Alleen hPSCId1 regels uitdrukken Id1 mRNA niveau groter is dan 0,005 vouw die van GAPDH<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voor succesvolle differentiaties, zorg ervoor dat instructies boven op de voet volgen. Bovendien, markeren we hier sleutelparameters die differentiatie resultaten sterk te beïnvloeden. Voordat u begint een differentiatie, de volgende drie morfologische parameters moeten worden nageleefd: de morfologie van een stam van hPSCsId1, een hoge cellulaire verdichting en een hoge samenloop (> 90%) van de cultuur op dag 0. In dat opzicht optimale differentiatie voorwaarden zijn beste gemaakt door beplating los gezien hP...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken de leden van de lab Colas voor nuttige discussies en kritieken van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de NIH/NIEHS R44ES023521-02 en CIRM DISC2-10110 verleent aan Dr. Colas.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ACTC1 antibodySigmaA7811
Activine AStem Cell TechnologiesHu Recom Activin A
Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti)Thermo Fisher Scientific15240062
B27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
B27 supplement zonder - insulineThermo Fisher ScientificA1895601
B27 supplement zonder - vitamine AThermo Fisher Scientific12587001
CDH5 antibodyR&D SystemsAF938
CryoStor CS10Stem Cell Technologies7930Cryopreservation reagent
DMEM met hoge glucoseMediatech10-013-CV 
DPBS met Ca & MgCorning21-030-CV
EDTAThermo Fisher Scientific15575-038
FBSVWR89510-186
FluoVolt membraanpotentiaal kit  Thermo Fisher ScientificF10488Voor optische actiepotentiaalregistratie, zie McKeithan et al. 2017
KnockOut Serum ReplacementGibco10828010
Matrigel, Growth Factor ReducedCorning356231Coating reagent
mTeSR1 media kitStem Cell Technologies5850
PBS zonder Ca & MgCorning21-040-CV
Penicilline-StreptomycineGibco
Puromycin Acros227422500
ReLeSRStem Cell Technologies5872Enzymevrije dissociatiereagent
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875-093
TAGLN antibodyAbcamab14106
ThiazovivinStem Cell Technologies72254RHO/ROCK-route-remmer
TrypLE ExpressThermo Fisher Scientific12605 -0101X enzym-bevattend dissociatiereagens
Tyrodes oplossing mix-pakketten  SigmaT2145-10X1L(Voor optische actiepotentiaalregistratie, zie McKeithan et al. 2017)

Referenties

  1. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  2. Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
  3. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
  4. Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
  5. Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
  6. McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , Chapter 1, Unit 1F 13(2012).
  7. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766(2017).
  8. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
  9. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
  10. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
  11. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
  12. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
  13. Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
  14. Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
  15. Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
  16. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
  17. Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
  18. Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
  19. Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Progenitoren van het eerste hartveldId1 overexpressieActivine A differentiatielentivirale infectiecryopreservatieprotocolcardiale differentiatieventriculaire markersactiepotentiaalanalyse
Generatie van eerste hart veld-achtige cardiale progenitoren en ventriculaire-achtige Cardiomyocytes van menselijke pluripotente stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.