Multi-Color lokalisatie microscopie van één membraaneiwitten in organellen van de cellen van levende zoogdieren

Summary

Hier presenteren we een protocol voor Multi-Color lokalisatie van één membraaneiwitten in organellen van levende cellen. Als u wilt koppelen fluorophores, worden zelf labeling eiwitten gebruikt. Eiwitten, gelegen in verschillende membranen compartimenten van de dezelfde organel, kunnen worden gelokaliseerd met een nauwkeurigheid van ~ 18 nm.

Abstract

Kennis over de lokalisatie van eiwitten in de cellulaire subcompartments is van cruciaal belang te begrijpen hun specifieke functie. Hier presenteren we een super resolutie-techniek die het mogelijk voor de bepaling van de microcompartments die toegankelijk zijn voor de eiwitten maakt door het genereren van lokalisatie en het bijhouden van de kaarten van deze proteïnen. Bovendien, door Multi-Color lokalisatie microscopie, de lokalisatie en bijhouden van de profielen van proteïnen in verschillende subcompartments worden verkregen gelijktijdig. De techniek is specifiek voor de levende cellen en is gebaseerd op de repetitieve beeldvorming van interne mobiele membraaneiwitten. Proteïnen van belang zijn genetisch gefuseerd met specifieke, zogenaamde zelf labeling tags. Deze tags zijn enzymen die met een substraat op covalente wijze reageren. Geconjugeerd met deze substraten zijn fluorescente kleurstoffen. Reactie van de enzym-gelabelde proteïnen met de fluorescentie label substraten resultaten in gelabelde proteïnen. Hier, worden Tetramethylrhodamine (TMR) en silicium Rhodamine (SiR) gebruikt als fluorescente kleurstoffen die zijn aangesloten op de verschillende ondergronden van de enzymen. Met behulp van substraat concentraties in de pM naar nM-bereik, wordt sub stoichiometrische labeling bereikt die tot verschillende signalen leidt. Deze signalen zijn gelokaliseerd met ~ 15 – 27 nm precisie. De techniek maakt het mogelijk voor Multi-Color beeldvorming van afzonderlijke moleculen, waarbij het aantal kleuren wordt beperkt door de beschikbare membraan-permeabele kleurstoffen en het repertoire van zelf labeling enzymen. Laten we de haalbaarheid van de techniek door bepaling van de lokalisatie van de kwaliteitscontrole enzym (Pten)-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) in verschillende mitochondriale compartimenten tijdens de verwerking ervan in relatie tot andere membraaneiwitten. De test voor echte fysieke interactie tussen anders gelabelde interne eiwitten door enkel molecuul FRET of co tracking is echter beperkt, omdat de lage labeling graden de kans verlagen voor het feit dat twee aangrenzende eiwitten label op hetzelfde moment. Terwijl de techniek sterk is voor imaging-eiwitten in het membraan compartimenten, in de meeste gevallen is het niet passend om te bepalen van de lokalisatie van uiterst mobiele oplosbare eiwitten.

Introduction

Het doel van dit protocol is bedoeld als een beeldvorming methode voor het lokaliseren en het bijhouden van één membraaneiwitten in levende cellen. We noemen deze methode Tracking en lokalisatie microscopie (TALM)^1,2. Net als stochastische optische wederopbouw microscopie (STORM)³ en fluorescentie Photoactivation lokalisatie microscopie ((F) PALM)^4,5is TALM een fluorescentie van één molecuul gebaseerde lokalisatie-techniek. Het verschilt echter in de weg dat de mobiliteit van membraaneiwitten in combinatie met repetitieve beeldvorming van hetzelfde label molecuul op verschillende posities onthult de microcompartment dat toegankelijk is voor de mobiele proteïne. Met andere woorden, worden de mogelijke taalversies van de proteïne ingesteld door de architectuur van het organel en de mobiliteit van de eiwit-¹. De methode is complementair aan verschillende andere super resolutie technieken^6,7,8 , omdat hieruit blijkt lokalisatie en traject kaarten door imaging mobiele eiwitten. De etikettering is gebaseerd op het gebruik van genetisch gemanipuleerde fusie-eiwitten die per se niet-belichting fluorescerende. Deze fusie-eiwitten zijn enzymen die covalent met een substraat geconjugeerd met een kleurstof reageren zelf labelen. Deze procedure heeft het voordeel dat de labeling mate kan worden gecontroleerd door de hoeveelheid toegevoegde substraat. Bovendien, u kunt variëren de kleur van de fluorescentie, afhankelijk van de gekozen geconjugeerd kleurstof. Verschillende zelfstandige labeling enzym-tags zijn beschikbaar⁹. Een ander voordeel van het gebruik zelf labelen enzym-tags is, dat de geconjugeerd kleurstoffen meestal zijn stabieler en helderder dan tl eiwitten¹ en individuele eiwitten dus worden meer opgenomen kunnen en meer juist totdat ze worden gebleekt. Dit zorgt voor de opname van de trajecten van mobiele eiwitten en de winning van diffusie coëfficiënten^10,11.

Hier, we de haalbaarheid van TALM met mitochondriale membraaneiwitten aantonen, maar het kan ook worden toegepast voor andere intra - en extra - cellular membraaneiwitten, met inbegrip van andere cel typen^12,13. We laten zien dat multi-color TALM verder voor de gelijktijdige onderscheid van proteïnen in verschillende subcompartments in complementatie bestaande super resolutie fluorescentie microscopie technieken^14,15, zorgt ¹⁶. TALM is compatibel met levende cel imaging¹⁷. De foto-fysica van de gekozen rhodamines Tetramethylrhodamine (TMR) en silicium-Rhodamien (SiR), in het bijzonder hun helderheid en stabiliteit, kunt opnemen één membraaneiwitten via meerdere frames bieden lokalisatie (en traject) kaarten. TALM is echter beperkt voor de lokalisatie van oplosbare eiwitten met hoge diffusie coëfficiënten omdat de bewegingsonscherpte te hoog is en de verzamelde fotonen per frame te laag voor goede lokalisatie zijn. Bovendien, TALM vereist minder excitatie-macht dan bijvoorbeeld STORM of gestimuleerd emissie uitputting (STED) microscopie^6,7, vermindering van de fototoxische effecten. Dit is belangrijk, aangezien fototoxische stress vaak organellar morfologie¹⁸ en aldus de mobiliteit analyse^{19 beïnvloedt}. Kortom, we presenteren Multi-Color TALM in levende cellen als een techniek die een leemte tussen de lokalisatie Microscopie methodes STORM/STED vult / (F) PALM en technieken die eiwit mobiliteit zoals fluorescentie herstel na photobleaching analyseren (FRAP)^{20 ,21}, fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS)²²en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCCS)^11,23steken.

Protocol

Het volgende protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van lokale instelling onderzoek.

1. methoden

1. Celcultuur
   1. Cultiveren van cellen, bijvoorbeeld HeLa cellen (menselijke cervix carcinoom), in een T25 cel cultuur kolf met 5 mL groeimedium bij 37 ° C en 5% CO₂.
      Opmerking: Voor imaging, splitst u de cellen op bereid coverslips (zie stap 1.3 en 1.4) en bewaar op imaging medium.
2. Cel transfectie
   Opmerking: Gebruik cellijnen die stabiel uitdrukking geven aan de tagged eiwitten mogelijk²⁴ tot het vermijden van sterke overexpressie. Voorbijgaande Transfectie, aan te passen het bedrag van de plasmide DNA gebruikt voor Transfectie. Bijvoorbeeld, wanneer Ca^{2 +} fosfaat transfectie²⁵ wordt gebruikt, transfect cellen (80 – 90% confluentie) in een 3,5 cm cel cultuur schotel met 2,5 – 5 µg plasmide DNA. Bij het uitvoeren van dubbele transfectie, 2,5 µg per elke plasmide construct gebruiken
   1. Voor dubbele kleur experimenten, gebruik een cellijn met stabiele uitdrukking van één zelfstandige labeling eiwit en Transient transfect met de codering van de andere zelfstandige labeling eiwitten¹⁷plasmide.
      Opmerking: Hier, dubbele kleur experimenten, HeLa cellen werden gebruikt die stabiel de zelf labeling eiwitten PINK1-Halo-Tag en Tom20-fSNAP-Tag uitgedrukt.
3. Reinigen van coverslips
   1. Plaats de coverslips in een bekerglas. Voeg 30 mL H₂O in het bekerglas van de coverslips en voorzichtig schudden om stof te verwijderen van hun oppervlak.
   2. Verzamelen van de coverslips met een pincet en droog ze met een stikstofstroom.
   3. Verwijder organische verontreiniging op het oppervlak van de coverslips, bijvoorbeelddoor het reinigen van het plasma.
      Opmerking: Om te voorkomen dat verdere verontreiniging van de glas-materiaal, Draag handschoenen bij de verwerking van de coverslips.
      Let op: Wanneer coverslips worden schoongemaakt door plasma reinigen, alleen de bovenzijde van de coverslips wordt schoongemaakt; Gebruik deze kant voor coating met poly-L-Lysine-polyethyleen glycol-arginine-glycine-aspartaat (PLL-PEG-RGD) (punt 1.4) en cel (sectie 1.5) zaaien.
4. Dekglaasje aan coating met PLL-PEG-RGD
   Opmerking: PLL-PEG-RGD is een poly-L-Lysine (PLL) derivaat gekoppeld met een polyethyleenglycol (3.000 Da) en een cysteine-glycine-arginine-glycine-aspartate-serine (CGRGDS) peptide. PLL bindt aan de negatief geladen glazen oppervlak en vormt een PEG-borstel. Dit vermindert drastisch aspecifieke binding van geladen fluorescente kleurstoffen. Bovendien, het RGD-motief bootst de peptide van het signaal van de receptor van integrine en daardoor bevordert integrine-gemedieerde hechting van de cellen die anders gemakkelijk niet aanhangen.
   1. PLL-PEG-RGD bereiden als eerder beschreven²⁶. Kortom, Los 0,8 mg PLL-PEG-RGD in 1 mL PBS. Voeg 10 µL van de PLL-PEG-RGD-oplossing op de bovenzijde van een schone dekglaasje aan.
   2. Neem een tweede dekglaasje aan en plaats het met haar schoon oppervlak ondersteboven op de eerste dekglaasje aan (dat heeft de daling van de PLL-PEG-RGD bovenop); Dit resulteert in de klemmen van de PLL-PEG-RGD oplossing tussen twee coverslips.
   3. Zorgvuldig de ingeklemd coverslips Breng in een bekerglas en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een stofvrije droge omgeving.
   4. Voeg 30 mL H₂O het bekerglas werd aan de coverslips met water volledig te dekken na 1 uur.
   5. Voorzichtig schudden het bekerglas totdat de coverslips los van elkaar.
   6. Pincet gebruiken voor het verzamelen van de coverslips uit het water en droog ze onder een stroom van stikstofgas.
      Opmerking: De gecoate coverslips kunnen worden opgeslagen in een droge, steriele glas petrischaal met deksel voor een paar dagen.
5. Voorbereiding van monster voor imaging
   1. Breng de interne gecoate coverslips in een 35 mm schotel voor de cultuur van de cel, met de PLL-PEG-RGD gecoate oppervlak naar boven gericht en voeg toe 2 mL imaging medium bovenop.
   2. ~ 500.000 trypsinized cellen (200-500 µL) die de zelfstandige labeling tags op de respectieve membraaneiwitten aan de 2 mL medium in de cel cultuur schotel met de gecoate dekglaasje aan imaging express toevoegen. Schud zachtjes met de hand om een homogene verdeling van de cellen te verkrijgen een uniform cellaag.
   3. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO₂ cellen tot 80% confluentie is bereikt.
      Opmerking: Celsteekproeven moeten worden ontpit 3 dagen voorafgaand aan beeldvorming en 1 dag vóór de transfectie. Cellen die stabiel express de proteïne van belang, kunnen worden uitgezaaid 2 dagen vóór de beeldvorming. Later, zijn alleen de cellen die zijn geteeld op het dekglaasje aan beeld.
6. Etikettering van tagged eiwitten
   Nota: Meest fluorescerende ondergronden moeten worden opgelost in water-vrije DMSO. Wij adviseren om stamoplossingen van 1 µM fluorescerende coating gebruiken wanneer de labeling eindconcentratie 0,2 – 30 nM^{17 is}. Gebruik voor imaging membraaneiwitten binnen cellen, membraan doorlaatbaar fluorescerende ondergronden.
   1. Opwarmen van de beeldvorming middellange tot 37 ° C in een waterbad.
   2. Pipetteer 1 mL van het voorverwarmde imaging medium in een tube 2 mL met deksel. 0,2 – 30 µL van fluorescerende substraten uit 1 µM stamoplossingen ter voorbereiding van de definitieve labeling oplossing toevoegen (eindconcentratie: 0,2 – 30 nM).
   3. Vortex de labeling oplossing voor 10 s.
   4. Vervangen van het medium in de 35 mm cultuur schotel aan de cellen op een dekglaasje aan (zie stap 1.5) door 1 mL van voorbereide labeling oplossing.
   5. Incubeer de cellen in de labeling oplossing bij 37 ° C en 5% CO₂ voor 20-30 min.
   6. De cellen met eens 2 mL PBS, daarna met 2 mL imaging gemiddeld twee keer wassen. Ten slotte, Pipetteer 1 mL van de verse imaging middellange tot de cel schotel en zet het monster terug in de incubator bij 37 ° C en 5% CO₂ gedurende ten minste 1 uur. Voor imaging, het imaging medium nogmaals uit te wisselen.
      Opmerking: Wanneer u het experiment voor de eerste keer uitvoert, bevestigen juiste targeting van zelf gelabelde proteïnen te organellar membranen door kleuring van de organellen met verkrijgbare organel specifieke kleurstoffen^27,28. In dit geval ook kunt substraat voor de zelfstandige labeling enzymen 100 – 200 nM sterke signalen produceren.
7. Voorbereiding van een monster fluorescerende kraal
   Opmerking: Om de optische drift vast te stellen en aan te passen van de beelden van de verschillende kanalen, Multi-Color fluorescerende kralen (0.1 µm) worden gebruikt. Met de opgenomen beelden, zal een affiene transformatiematrix opgeeft voor de emissie van de twee kanalen worden gegenereerd.
   1. Verdun de oplossing van parels naar 1% met zuivere H₂O.
   2. Plaats 5 druppels van het bereide oplossing met de kralen van de fluorescentie op vijf verschillende posities op een gereinigde dekglaasje aan (zie stap 1.3).
   3. Laat het monster van de fluorescerende kraal drogen op een schone bankje.
      Opmerking: Het monster kan worden hergebruikt; derhalve dient te omvatten het monster met aluminiumfolie om besmetting te voorkomen en houdt het bij een 4 ° C.

2. microscopie

1. Experimentele opstelling
   Opmerking: Een fundamentele microscopie systeem voor dual-kleur enkel molecuul imaging is gebaseerd op een omgekeerde Microscoop: het is uitgerust met twee lasers gekoppeld via een multi-mode-optische polarisatie handhaving van monomode vezel in een één totale interne reflectie (TIR) condensor, een olie-immersie doel ontworpen voor TIRF, een polyband emissie filters, een afbeelding splitter en een zeer gevoelige camera (Figuur 1). Een TIR-condensor is nodig dat voorziet in continue afstemming van het incident hoek om te schakelen tussen de epi-, zeer geneigd en gelaagd optische blad (zeer geneigd dunne verlichting (HILO)²⁹), en de TIRF excitatie modus met geoptimaliseerd indringingsdiepte. Afbeeldingen zijn verworven met een zeer gevoelige gekoelde detector systeem, bijvoorbeeld een rug-verlicht elektron te vermenigvuldigen belast gekoppelde apparaat (EMCCD) camera (quantum efficiency QE > 90%) of een sCMOS camera (QE > 80 – 90%).
   1. Bepaal de optische drift door imaging fluorescerende kralen (zie stap 2.2) onder dezelfde voorwaarden als degenen die later zal worden gebruikt voor het experiment, bijvoorbeeldwanneer 10.000 frames worden opgenomen in het experiment, opnemen ook 10.000 frames met het monster van de kraal. Voor de bepaling van de optische drift, vergelijken de positie van de parels in het eerste frame en het laatste verworven frame (figuur 1B). Indien nodig, later corrigeren de afbeelding serie voor optische drift³⁰ en/of drift stabiele omgevingen gebruiken.
   2. Rusten de filter kubus met de juiste dichroïde balk splitter, bijvoorbeeldvoor Oranje en rode fluorescentie plus de voldoende emissie filters voor Oranje fluorescentie en rode fluorescentie. De afbeelding splitter voorzien van de geschikte filters. Controleer het mogelijk lekken van signalen van één kanaal naar het andere kanaal door de opname van één kleur monsters in beide kanalen (Figuur 1 c).

Figuur 1 : Optische lay-out voor Multi-Color bijhouden en localisatie microscopie (TALM) met oranje en rode vervuilers. (A) Inverted Microscoop setup met ten minste twee excitatie lasers, een TIRF condensor, een geschikte doelstelling van TIRF, een beeld-splitter en een gevoelige camera. Inzet: om te prikkelen organellen binnen cellen, de hoek van de invallende lichtbundel moet instellen kleiner dan de kritische hoek voor TIRF tot zeer geneigd en gelamineerd optische blad verlichting (HILO). DC1: Dichroïde spiegel 1; DC2: Dichroïde spiegel 2. EF: emissie filter. (B) Test op optische drift door imaging posities van een fluorescerende kraal voor 10.000 frames met de dezelfde framesnelheid vanaf de volgende experimenten (hier: 15 Hz). Aangesloten standpunten van de eerste 500 frames en de laatste 500 frames tonen de drift. Ook, een samengevoegde beeld met de positie van het eerste en het laatste frame in rode en blauwe tonen een minimale drift. De drift is dat de afstand tussen het centrum van de signalen gedeeld door de totale opnametijd, hier 125 pm/s. (C) controle van de duidelijke scheiding van signalen, hier TMR en SiR. Voor beide kanalen, zijn cumulatieve som beelden van 3.000 frames (TMR in kanaal 1) en SiR in Channel 2 gegenereerd. SiR^HTL was gehecht aan Tom20-HaloTag en TMR^HTL te OxPhos complexe V-HaloTag. Kleuren zijn valse kleuren. Schaal bars = 100 nm (B) en 1 µm (C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

2. Fysieke uitlijning van afbeelding splitter gegenereerde afbeeldingen
   Opmerking: Voor de montage van het model voorbereid op een dekglaasje aan, kan de houder van een zelfgemaakte monster worden gebruikt (figuur 2A). Voorkom stof, etc. vallen voor het monster, plaats het deksel van de schotel cultuur losjes op de top van de zaal, als gemonteerd. Dezelfde steekproef-houder kan worden gebruikt voor het monteren van het dekglaasje aan met fluorescerende kralen of cellen; wanneer cellen zijn beeld, voeg toe 0,5 – 0,8 milliliters imaging medium. De afbeelding splitter splitst het beeld in twee of meer spectraal gescheiden kanalen en projecteert ze side-by-side op dezelfde camera. Dit proces potentieel introduceert systematische verstoringen tussen de kanalen te wijten aan verschillende optische paden doorkruist en directe colocalization analyse wordt belemmerd. Daarom eerst uitvoeren fysieke uitlijning en ten tweede, na correctie van de aanpassing aan een transformatiematrix opgeeft. Voor beide processen uitlijning, moeten fluorescerende kralen homogeen verspreid worden in het gezichtsveld.
   1. Monteren van het voorbereide monster met de fluorescerende kralen, in de monsterhouder tussen de polytetrafluorethyleen (PTFE)-ring en de rode rubberring (figuur 2A).
   2. Start de Microscoop alle hardwareonderdelen en alle software die nodig is voor microscopie.
   3. De doelstelling en de onderkant van het dekglaasje aan schoon met een pluisvrije weefsel doekje dat bevochtigd met isopropanol. Vervolgens droog beide onderdelen met een verse pluisvrije weefsel. Plaats een droplet immersie-olie op de leerling van het objectief.
   4. Plaats de monsterhouder met de kraal monster op het podium van de Microscoop zodat de onderkant van het dekglaasje aan contact op met de olie. Focus op kralen met behulp van transmissie licht of een laser lijn.
   5. Aanpassen van de kracht van de twee excitatie lasers om soortgelijke signaalsterkte in de twee kanalen van de fluorescentie. Zoekt u een gebied met vele verschillende TL signalen.
   6. Genereer een samengevoegde weergave van de TL-zenders met behulp van de software van de controle van de camera. Vervolgens wees de schroeven op de splitter afbeelding handmatig de interne spiegels van de afbeelding splitter te bereiken de beste overlay van de signalen van de twee fluorescerende kanalen (figuur 2B).
      Opmerking: aandacht! Het dynamisch bereik van de camera niet overschrijden.
3. Uitlijning van spectraal gescheiden kanalen door software uitvoeren van ruimtelijke transformatie
   Opmerking: Het volgende deel toont de na correctie uitlijning en lokalisatie procedure met onze software-plugin (beschikbaar op aanvraag).
   1. Start de TIRF Microscoop software beheren en wilt weergeven van de afzonderlijke kanalen in de modus van de live gegevensstroom. Neem een momentopname afbeelding spannende fluorescentie in alle kanalen (figuur 2C).
   2. Deze momentopname afbeelding gebruiken voor de productie van de transformatiematrix opgeeft (Zie Figuur 2).
      Opmerking: De transformatiematrix opgeeft wordt gebruikt voor een ruimtelijke transformatie, meestal een affiene degene, die voor vertaling (divergentie van signalen vanuit één punt bron tussen twee kanalen corrigeert).
   3. Start de software analyse plugin (op verzoek van onze lab kan worden verkregen, Zie figuur 2C).
   4. De beelden van de eerder opgenomen dubbele kleur (zie stap 2.2) van fluorescerende kralen in de software laden. De gebruikte richting van de fluorescerende kanalen kiezen.  Klik op 'ja' wanneer wordt gevraagd voor 'afbeeldingen kalibreren' en selecteer de eerder genomen momentopname.
   5. Open de "UNIT MANAGER" als u wilt definiëren eenheid conversiefactoren (pixelgrootte, framerate, foton conversiefactor).
   6. Open de "LOCALIZATION MANAGER". Bepalen van dat het punt verspreiden functie (PSF) eerst. Druk op de knop: "PSF radius". In de "PSF Estimator"-venster dat wordt geopend, definiëren de numerieke diafragma en de maximale emissie. Start "raming PSF straal" door te klikken. Accepteer de verkregen experimentele PSF definiëren het vak evaluatie, aantal deflatie loops en hoeveel kernen van de computer worden gebruikt voor de berekening. Druk op "lokaliseren" om te beginnen met de verdeling van de intensiteit van de enkele deeltjes montage door een 2D symmetrische Gauss functie (figuur 2C).
   7. "Accept" de verkregen experimentele PSF definiëren het vak evaluatie, aantal deflatie loops en hoeveel kernen van de computer worden gebruikt voor de berekening. Druk op "lokaliseren" om te beginnen met de verdeling van de intensiteit van de enkele deeltjes montage door een 2D symmetrische Gauss functie (figuur 2C).
   8. Open de "kalibratie-MANAGER". In de gerenderde samengevoegde afbeelding van de twee kanalen, worden de originele signalen en de gelokaliseerde centra weergegeven. Kies de "affiene" modus. Handmatig verbinding de overeenkomstige paren van gelokaliseerde centra in de twee kanalen die zijn afkomstig uit de dezelfde fluorescerende kraal door het tekenen van de lijn van een verbinding.
   9. Sluit de overeenkomstige signalen verdeeld over het gezichtsveld. Druk hierna op "accepteren". Sla de kalibratie.
      Opmerking: De ruimtelijke transformatie is bemonsterd op elke fluorescerende kraal en geïnterpoleerd tussen. De uitgepakte transformatie functie vertegenwoordigt een verplaatsing veld Δr(x,y) dat wordt gebruikt voor de taalversies van de experimentele dual-kleur enkel molecuul vervolgens corrigeren zodat zij binnen hun localisatie precisie overlay. De ruimtelijke transformatiematrix opgeeft is meestal een affiene die voor vertaling, schaal en rotatie tussen kanalen met nanometer nauwkeurigheid corrigeert, en het kan worden afgeleid uit deze handmatige ééntoewijzing (figuur 2C).

Figuur 2 : Workflow voor dubbele kleur uitlijning. (A) het dekglaasje aan met de fluorescerende kralen is gemonteerd in een monsterhouder tussen een PTFE en een rubberring. Vervolgens worden de bovenste en onderste deel van de kamer samen vastgeschroefd. (B) fysieke uitlijning van de kanaal-weergaven die worden gegenereerd door de afbeelding splitter. Fluorescerende signalen van kralen (0.1 µm) opgenomen in twee kanalen (groen en rood, valse kleuren) worden samengevoegd. De bijbehorende schroeven op de optische splitter zijn handmatig ingeschakeld totdat de beste overlay van de verschillende signalen wordt bereikt (gele kleur, lagere paneel). (C) generatie van een transformatiematrix opgeeft voor post-processive kanaal uitlijning. Voor precieze lokalisatie van een deeltje is het noodzakelijk om te bepalen van dat het punt verspreiden functie (PSF) in afhankelijkheid van de golflengte van de emissie en de numerieke diafragma van de doelstelling. Het midden van een PSF kan worden bepaald door haar intensiteit profiel geanalyseerd door een symmetrische tweedimensionale Gaussiaan passen. De resulterende lokalisatie van de piek van het signaal wordt vervolgens geprojecteerd op de oorspronkelijke, wazig signalen. In een samengevoegde afbeelding, de gelokaliseerde centra van de signalen van de twee kanalen voor het genereren van een transformatiematrix die later wordt gebruikt voor de post-processive aanpassing van de experimentele gegevens verbonden. Schaal bars = 1 µm (B, C). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

4. Enkel molecuul beeldvorming van mitochondriale membraaneiwitten
   Opmerking: Alle experimenten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. T-cellen of niet-aanhanger cellen moeten worden geïmmobiliseerd in agarose vóór³¹imaging.
   1. Monteren van het model met aanhangend cellen op het dekglaasje aan tussen de rubber- en PTFE ringen (figuur 3A). De kamer vullen met 0,5 – 0,8 mL imaging medium.
   2. Herhaal stappen 2.2.2–2.2.5.
   3. Aanpassen van de verlichting hoek TIRF Microscoop controle software voor het maken van een incident hoek die kleiner is dan de kritische hoek voor TIR-modus om te wekken van het specifieke gebied van belang via een HILO blad³² (HILO modus, figuur 1A).
      Let op: Vermijd direct oogcontact met de laserstraal!
   4. De EM-winst en kiest u een belichtingstijd geschikt voor het experiment dat voldoende fotonen per frame verzamelt.
   5. Stel de macht van de laser te bereiken van een hoog signaal ruisverhouding (S/N) (figuur 3B), aangezien de lokalisatie precisie direct correspondeert met S/N³³ (Figuur 3 c).
   6. Zoek een gebied in de periferie van de cel met de niet-overlappende, langwerpige mitochondriën en enkel molecuul signalen (figuur 3D; Aanvullende Video 1). Als geen enkel molecuul signalen zichtbaar zijn, wachten tot het bleken van resultaten in de weergave van één molecuul signalen (3E figuur).
   7. Record tot het aantal signalen is te laag voor redelijke voortzetting (meestal 1.000 – 10.000 beelden afhankelijk van het bleken gedrag van de fluorescente kleurstof, figuur 3F).
   8. Start de beeldvorming verwerking software en controleren op mitochondriale structuren door het genereren van een afbeelding van de cumulatieve gesmolten som van ten minste 1.000 opgenomen frames (Figuur 3 g).
      Opmerking: De snelste mogelijke framesnelheid wordt bepaald door de uitlezing gebied. Het gezichtsveld voor één kanaal wordt verminderd met een dual-kleurenafbeelding splitter (512 x 512 pixels) 256 x 512 pixels en een Quad-color naar 256 x 256 pixels. Voor het gebruik van een afbeelding-splitter voor twee kleuren, is dit dus 30 Hz. Stel de overdrachtsmodus frame om de laagste mogelijke uitlezing tijd.
   9. Start software analyse plugin en belasting onbewerkte gegevens. Selecteer het kanaal oriëntatie en laden afbeeldingen. Gebruik de transformatiematrix opgeeft vanaf stap 2.3.9 gevraagd voor "Afbeeldingen kalibreren". Kanalen worden afzonderlijk weergegeven.
   10. Open de "UNIT MANAGER" als voorheen als u wilt definiëren eenheid omrekeningsfactoren voor elk kanaal. Open de "LOCALIZATION MANAGER" voor elk kanaal. Definiëren van het vak evaluatie, aantal deflatie lussen, voeg vervolgens de theoretische PSF de voorwaarden gebruikt en instellen hoeveel kernen van de computer worden gebruikt voor de berekening. Druk tot slot op "lokaliseren" om gelokaliseerde enkele deeltjes (Figuur 3 H; Aanvullende Video 2).
   11. Opmerking dat het programma genereert ten slotte een afbeelding van de cumulatieve super-resolution toont gelokaliseerde alle deeltjes (figuur 3I).
   12. Analyse, bijvoorbeelddoor open bronsoftware of onze software beschikbaar op aanvraag.
   13. De afzonderlijke moleculen in beide gelokaliseerde kanalen, bijvoorbeeldmet de doelsoort zijn meerdere tracer¹⁰ bijhouden
       Opmerking: Stap 2.4.13 moet (experimenteel) voorkennis over de diffusibility van de eiwitten van belang zijn voor de randvoorwaarden juist ingesteld. Meestal vinden van de juiste randvoorwaarden is een iteratief proces.

Figuur 3 : Stappen tijdens één molecuul lokalisatie microscopie. (A) A dekglaasje aan met het monster is gemonteerd tussen het bovenste en onderste deel (grijs) van de zelfgemaakte monsterhouder (ontworpen door J. Bereiter-Hahn). Een rubberring (rood) en een PTFE-ring (wit) zegel het systeem van boven en onder het dekglaasje aan, wanneer de monsterhouder onderdelen bout samen zijn. (B) signaal / ruisverhouding van de TMR-signaal. (C) berekend lokalisatie precisie histogram voor alle gelokaliseerde deeltjes. (D) de keuze van een redelijke regio voor imaging, hier, de rand van de cel met duidelijk gescheiden mitochondriën. (E) opname en beeldverwerking: één frame met verschillende enkel molecuul signalen wordt weergegeven (hier, afzonderlijke moleculen van CV-HaloTag/TMR^HTL waren opgenomen). (F) intensiteit van TMR over de opnametijd. (G) cumulatieve som beeld van 3.000 frames, niet verwerkt. (H) deeltjes van CV-HaloTag/TMR^HTL gelokaliseerd met een 2D Gauss functie van één frame. (ik) cumulatief, som afbeelding toont alle gelokaliseerde CV-HaloTag/TMR^HTL deeltjes van 3.000 frames gerenderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Results

Multi kleur beeldvorming en colocalization analyse kan helpen om te bepalen van de sub-organellar lokalisatie van eiwitten. We toonden dit eerder met de cytosolische fosfatase en Tenzin homologe, PINK1, die verschillende sub-mitochondriale locaties als gevolg van de verwerking ervan door mitochondriale proteasen^{17 heeft}. PINK1 is een belangrijke factor die mitochondrial functionaliteit^34,35te garanderen. Om...

Discussion

Hier, werd een techniek voor het dubbele kleur enkel molecuul lokalisatie van mobiele membraaneiwitten gepresenteerd. Na het protocol, de membraaneiwitten worden gesmolten tot zelf labelen van eiwitten die met de kleurstoffen rhodamine TMR en SiR geconjugeerd met hun respectieve substraten reageren. Rhodamine kleurstoffen zijn helder en photostable en dus zorgen voor de repetitieve imaging¹. Voor succesvolle prestaties moeten verschillende voorwaarden en kritische onderwerpen in gedachten worden g...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M) (HEPES)	Biochrom	#1104E
DC1: Dichroic beam splitter	Chroma	640 dcxr	NC506031
DC2: Polychroic Mirror, beamsplitter	Chroma	zt405/488/561/640rpc	discontinued
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x (w/o Ca & Mg)	Sigma-Aldrich & Co.	#RNBF8311
Earle´s MEM without phenol red, without L-Glutamine and without NaHCO3 containing 1% FBS, 0.1% HEPES, 0.1% NEAA, 0.1% Alanyl-L-Glutamine and 34.78% sodium hydrogen carbonate (NaHCO3 0.75g/l)			Imaging medium
Earle´s minimum essential medium (MEM) with phenol red, containing 1% Fetal Bovine Serum Superior (FBS), 0.1% HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethanesulfonic acid, 1 M), and 0.1% non-essential amino acids (NEAA)			Growth medium
EF: Emission filter quadbandpass	AHF analysentechnik	F72-866	Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
EMCCD camera	Andor	Andor iXON 897	EMCCD camera
Emission filter QuadView filter cubes, orange	AHF analysentechnik	F39-637	bandpass 582 - 619 nm
Emission filter QuadView filter cubes, red	Chroma		bandpass 655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Fetal bovine serum) superior	Biochrom	S0615
Fluorescent beads: TetraSpeck™ Microspheres, 0.1 µm, fluorescent blue/green/orange/dark red	Thermo Fisher Scientific	T7279	fluorescent microspheres
Glutamine	Biochrom	#0951C
HeLa cells	DSMZ	ACC-57	Cervical carcinoma cells from patient Henrietta Lacks
Hela cells CI::paGFP, stable	Muster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stable	Appelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stable	Appelhans et al., NanoLett 2012
Image splitter	Photometrics	Dual-View QV2	image splitter emission
Imaging processing software	ImageJ2 / Fiji	freeware
Immersion Oil - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)	Carl Zeiss Jena GmbH	444960-0000-000
Inverted epifluorescence microscope	Olympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mW	CrystaLaser	CL-561-200	561 nm emission
Laser 642 nm, 140 mW	Omicron	Luxx-642-140	642 nm emission
MATLAB	MathWorks	version R2013a
MEM with Earle's Balanced Salt Solution 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine w/o PR	Biochrom	FG-0385
MEM with Earle's Balanced Salt Solution with 2.2 g/L NaHCO3, stable glutamine, Phenolred	Biochrom	FG-0325
MitoTracker® Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	dye
MitoTracker® Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	dye
Multi-mode-optical polarization maintaining monomode fiber	Pointsource/Qioptiq		KineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer	Rapp Polymere GmbH Tübingen		coverslip coating
non-essential amino acids (NEAA)	Biochrom	#0802E
PEG 800 (Polyethylene glycol) 10 %	Carl Roth GmbH	Art No. 0263.1	coverslip coating
Penicillin/Streptomycin	Biochrom	#0122E
Plasmid for PINK1-Halo7-Tag expression	Beinlich et al., ACS Chemical Biology 2015
Poly-L-lysine (1.2 mg/ml)	Sigma-Aldrich & Co.	Cat. No.P9155	coverslip coating
RGD Peptide (Ac-CGRGDS-COOH)	Coring System Diagnostix GmbH, Gernsheim		coverslip coating / Intergrin receptor motif
Silicon Rhodamine linked to HaloTag®-Ligand (SiRHTL)	personal gift from Kai Johnson		dye
Software analysis plugin	self-written C. P. Richter, Biophysik Osnabrück	SLIMFAST 16g
Tetramethylrhodamine / SNAP-Cell® TMR-Star linked to SNAP-Ligand (TMRstar)	New England Biolab®	S9105S	dye
Tetramethylrhodamine linked to HaloTag®-Ligand (TMRHTL)	Promega	G8251	dye
TIRF condensor	Olympus	Cell^TIRF MITICO System	TIRF condensor
TIRF microscope controlling software	Olympus cellSens 1.12
TIRF objective	Olympus	150x oil objective (N.A. 1.45; Olympus UAPO)
Trypsin/EDTA 10x	Biochrom	#0266
Water H2O 99,5 % Rotipuran® Low organic	Carl Roth GmbH	Art. No. HN57.1