Kras Assay voor In Vitro testen van cel migratie met een geautomatiseerde optische Camera geoptimaliseerd

Summary

Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.

Abstract

Cel migratie is een belangrijk proces invloed op vele aspecten van de gezondheid, zoals wondgenezing en kanker, en het is dus cruciaal voor de ontwikkeling van methoden om te bestuderen van de migratie. De kras assay is al lang de meest voorkomende in vitro methode voor het testen van verbindingen met de eigenschappen van de anti - en pro - migration vanwege zijn lage kosten en eenvoudige procedure. Een vaak gemeld probleem van de test is echter de accumulatie van cellen over de rand van de kras. Bovendien, om gegevens te verkrijgen van de bepaling, beelden van verschillende belichtingen moeten worden genomen over een periode van tijd op exact dezelfde plek om te vergelijken van de bewegingen van de migratie. Analyse van de verschillende programma's kunnen worden gebruikt voor het beschrijven van de kras sluiting, maar ze zijn arbeidsintensief, onjuist, en krachten cycli van temperatuurveranderingen. Wij tonen in deze studie, een geoptimaliseerde methode voor het testen van het migratie-effect, bijvoorbeeld met de natuurlijk voorkomende eiwitten mens - en runderen-lactoferrine en hun N-terminale peptide Lactoferricin op de epitheliale cellijn HaCaT. Een cruciale optimalisatie is te wassen en kras in PBS, die de bovengenoemde accumulatie van cellen langs de rand elimineert. Dit kan worden verklaard door de verwijdering van kationen, waarvan is gebleken dat een effect op Keratinocyt cel verbinding. Om te zorgen voor echte detectie van migratie, werd vooraf behandelen met mitomycine C, een DNA-synthese-inhibitor, toegevoegd aan het protocol. Tot slot tonen wij de geautomatiseerde optische camera, die elimineert buitensporige temperatuur cycli, handenarbeid met kras sluiting analyse, terwijl de verbetering op de reproduceerbaarheid en het waarborgen van de analyse van identieke secties van de kras na verloop van tijd.

Introduction

Migratie is een belangrijk proces die invloeden van verschillende fysiologische aspecten. In de wondgenezing vergemakkelijkt de migratie opnieuw epithelization van de huid. In niet-genezende wonden, zoals chronische wonden, opportunistische bacteriën veroorzaken infectie van de wond en open wonden zijn ideaal voor bacteriën groei en vorming van biofilms^1,2. Biofilm is een van de oorzaken van de ontwikkeling van resistente bacteriën, één van de grootste bedreigingen voor onze moderne samenleving-³. In de wondgenezing, kunnen niet de immuuncellen de biofilm doordringen. Bij kanker is migratie van de kankercellen een cruciale stap van metastase, die de belangrijkste doodsoorzaak voor patiënten met stevige tumors^4,5. Het is daarom van cruciaal belang om de studie van de migratie te kunnen.

De kras bepaling wordt vaak gebruikt voor het testen van cel migratie, want het is goedkoop en gemakkelijk uit te voeren op aanhangend cellijnen, zoals fibroblast, endotheel, en^6,7van de lijnen van de epitheliale cellen. Vandaag, er bestaan verschillende methoden voor het uitvoeren van krassen⁸, en verschillende materialen hebben gemeld moet worden gebruikt, met inbegrip van tandenstokers⁹, cel schrapers¹⁰, lasers¹¹en¹²van de elektrische stromen. Alle methodes hebben verschillende voor- en nadelen, en de methode moet worden vastgesteld volgens de cel type, begroting en analyse tool. Als voorbeeld, als het gebruikte celtype vereist coating, manuele druk verwijdering, bijvoorbeeld met een tandenstoker of pipette uiteinde, invloed zal hebben op migratie binnen het gebied, een andere methode moet worden gebruikt. In deze studie zullen we ons richten op handmatige schrapen.

Een nadeel voor handmatige schrapen is de variatie van de grootte, vormen van de krassen en accumulatie van cel aan de randen van de kras. Er zijn veel protocollen, en een zeer geciteerde papier adviseert verhoogde snelheid en/of grondig wassen na het krassen van¹³. Bovendien hebben verschillende methoden zijn gebruikt om te minimaliseren van proliferatie, aangezien de proliferatie van de cellen kan niet onderscheiden van migratie worden en daarom vals-positieve resultaten van de migratie geven kan. Sommige meldden methoden zijn serum honger voorafgaand aan de kras¹⁴ en daalt de hoeveelheid serum¹⁵. Geen van deze methoden kan er echter voor zorgen dat er geen wildgroei is. Daarom, rapporteren we een voorbehandeling van de cellen met mitomycine C om echte resultaten van de migratie. Mitomycine C is een antibioticum dat remt de synthese van DNA door de vorming van een covalente binding met het DNA, die verhindert dat het DNA scheiden van¹⁶. Door vooraf te behandelen met mitomycine C en wassen met PBS voor krassen, toont de gedetecteerde sluiting van de kloof de echte migratie van de cellen (Figuur 1).

Een kenmerk van alle methoden is de noodzaak van een systeem voor het analyseren van het proces van migratie¹⁷. Een gemeenschappelijk en een goedkope methode voor het analyseren van de vooruitgang is het gebruik van een licht-veld microscoop om beelden te nemen van de kras op vooraf bepaalde tijdstippen, gevolgd door een analyse van de sluiting van de kloof in een afbeelding software^18,19. Deze methode is tijdrovend, onbetrouwbaar met betrekking tot het nemen van foto's op de zelfde plek en de focus, en de beweging van incubator naar camera dwingt cycli van temperatuurveranderingen terwijl foto's zijn genomen. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren van migratie door het meten van de stroom. De huidige veranderingen, cellen bestrijken meer ruimte op de plaat, die wordt gelezen als een verhoging van de impedantie-²⁰. De omgeving van de cellen wordt niet beïnvloed door het meten van impedantie, en de methode wordt daarom beschouwd als niet-invasieve. Deze methode berust op gespecialiseerde platen met gouden elektroden, die duur zijn, maar ze inschakelen detectie van vele processen, zoals de naleving van de cellulaire, proliferatie, migratie en celdood. Een groot nadeel van deze methode is dat de impedantie-meting geeft niet direct aan migratie, aangezien factoren zoals temperatuur een grote impact op de impedantie hebben. Wijzigingen in de impedantie kunnen worden veroorzaakt door verschillende factoren die niet worden beoordeeld door de software, de analyse van de gegevens moeilijker te maken. Het ontbreken van visualisatie vereist daarom een conventionele lichte Microscoop om te controleren of de migratie.

Om te overwinnen veel van de nadelen van de beschikbare technieken, we gebruiken een real-time automatische optische camera. De optische camera is een detectiesysteem met een hoge gegevensdoorvoer Microscoop in een klein platform met een lens, verlichting unit en een digitale camera. Het heeft een ingebouwde software, die migratie en proliferatie o.a. kunt testen. U wilt opsporen migratie, worden twee algoritmen gebruikt om de groei en de kinetiek van de migratie van de cellen, die de verspreiding en de wond genezing analyse, respectievelijk heten te analyseren. De proliferatie analyse is gebaseerd op een in twee stappen afbeelding segmentatie algoritme dat textuur analyse om te detecteren het verschil tussen cel bedekte gebieden (getoond in het geel) van toepassing is en lege achtergrond gebieden door geavanceerde histogram analyse. De wond genezing analyse is gebaseerd op een drie-stappen-algoritme dat de cel enkelgelaagde detecteert, zoekt de kloof van de wond en bepaalt de breedte van de tussenruimte. Deze stappen zijn uitgevoerd op gebruiker-bepaald tijd-punten, en de gegevens worden gepresenteerd als overdekte ruimte, Breedte tussenruimte en gap omgeving. Een van de grote voordelen van deze machine is dat hierdoor beeldvorming van Adherente cellen door vloeistof vanwege de hoek van de camera-²¹. De camera lenstakes bewogen beelden die worden geprojecteerd naar een z-stack van een enkel z-vliegtuig genereren om ervoor te zorgen dat de foto's in-focus (Figuur 2 zijn). z-stacks worden gegenereerd door het samenvoegen van de reeks van foto's (bijvoorbeeld 40) genomen loodrecht naar de rand van de wond, en over de gehele wond. De z-stacks kunt vastleggen van de diepte van de cellaag evenals een vliegtuig in-focus over de wond. Bovendien kan de reeks beelden samen worden gebracht aan een video-collectie van de beelden, met de klik van een knoop.

We tonen een geoptimaliseerde protocol voor de detectie van de migratie in de Keratinocyt cellijn HaCaT. We testten lactoferrine en de N-terminale peptide, Lactoferricin, van mens en koeien, voor het analyseren van hun effect op de migratie, zoals deze moleculen hebben aangetoond dat tal van toepassingen als antimicrobiële en immune modulerende moleculen^{22 , 23}. de vier stoffen werden vergeleken met onbehandelde HaCaT cellen en epidermale groeifactor (EGF) werd gebruikt als positieve controle.

Protocol

De experimentele opzet geen ethische en juridische beperking en werd uitgevoerd in overleg met de Universiteit van Roskilde. Een overzicht van de experimentele opstelling kan worden gezien in Figuur 1 en de mechanismen van de optische camera in Figuur 2.

1. voorbereiding

1. Voer alle stappen in een steriele laminaire flow-bench door het reinigen van de Bank en alle apparatuur met 70% ethanol vóór de aanvang van het experiment.
2. Plaats de optische camera in een conventionele incubator bij 37 ° C met 5% CO₂ om optimale omstandigheden voor de cellen.
3. HaCaT cellen in DMEM media met 10% FBS en 1 x antibiotica (penicilline en streptomycine) in een maatkolf van T75 groeien.
4. Met 1 mL 1 x trypsine kunt loskoppelen van de cellen en sub kweken elke 3-4 dagen, door het te verspreiden over de cellulaire laag. Verwarm tot kamertemperatuur vóór gebruik.

2. het genereren van een Monolayer van HaCaT cellen in een 48-wells microtiterplaat plaat

1. Verwijder het medium van de T75 kolf met een pipet van Pasteur.
2. Wassen de Adherente cellen in de kolf door toevoeging van 5 mL 1 x steriel PBS aan op de maatkolf T75.
   Opmerking: Zorg ervoor dat de PBS vrij van calcium en magnesium.
3. De PBS circuleren en verwijderen met een pipet van Pasteur.
4. Herhaal stap 2.2-2.3.
5. 1 mL 1 x trypsine Voeg aan de maatkolf en het verspreiden over de cellaag.
6. Incubeer de kolf bij 37 ° C in een conventionele incubator totdat de cellen zijn vrijstaand (5-8 min is voldoende voor de meeste cellijnen).
7. Bekijken onder de Microscoop als de cellen worden losgemaakt. Zodra de cellen worden losgemaakt, voeg 9 mL van de reguliere media cultuur met 10% FBS voor inactivering van de trypsine 1 x.
8. Tellen van de cel met ofwel een hemocytometer, een coulter-teller of soortgelijk.
   Opmerking: Trypan blauw kan worden gebruikt om dode cellen weer te geven. Echter, in 1 x trypsine HaCaT cellen zijn perfect ronde als levend.
9. 7.5 x 10⁴ cellen per putje in 250 µL 10% FBS media overbrengen in een rondbodemkolf van 48-well weefselkweek plaat (standaard plaat).
   Opmerking: Assay kan ook worden ingesteld in 6-, 12-, 24- of 96-wells-platen, die alle onder de optische Microscoop kunnen worden bepaald.
10. Ga voorzichtig de plaat van kant naar kant om ervoor te zorgen dat de cellen zijn even verspreid in de putjes of de cellen zal verzamelen in het midden van de putten. Inspecteer onder een lichte Microscoop om ervoor te zorgen dat de cel is gelijkmatig verdeeld in de media
11. Zet de plaat in een conventionele CO₂ incubator bij 37 ° C's nachts of totdat de cellen aan de onderkant van de putten hebben gehouden.

3. de toevoeging van Stimuli voor migratie effecten

1. Controleren of de putten 90-95% heuvels onder een lichte Microscoop zijn.
2. Bereiden van 10 µg/mL mitomycine C in een passend bedrag van het medium.
   Opmerking: In deze studie, wordt mitomycine C bewaard bij 4 ° C in een stamoplossing bij 1 mg/mL. Mitomycine C in oplossing kan worden opgeslagen op één week in het donker bij 2-8 ° C.
3. Verwijder het verbruikte medium met een pipet van Pasteur van elk putje.
4. Voeg 250 µL van 5 µg/mL mitomycine C toe aan elk putje.
5. Incubeer de plaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO₂.
6. Stimuli van peptiden bereid door verdunning van hen in een passend bedrag van het medium.
   Opmerking: In deze studie, werden zowel de menselijke als boviene lactoferrine en Lactoferricin getest op 25 µg Mo/mL in een volume van 250 µL
7. Verwijder het medium met mitomycine C met een pipet van Pasteur.
8. Was de putjes 1 x met 250 µL 1 x PBS (kamertemperatuur) en verwijder het wassen met een Pasteur Pipetteer.
9. Voeg 250 µL van 1 x PBS en handmatig kras de putjes verticaal met een 200 µL pipette uiteinde. Gebruik een nieuwe Pipet tip voor elk putje.
10. Verwijder van de PBS en voeg 250 µL peptide prikkels.
11. Monteer de plaat in optische camerasysteem door de schroeven aan beide zijden van de plaat aan te passen. Laat het deksel op de plaat van de microtiterplaat.
    Opmerking: De camera kunt bedienen met het deksel open indien nodig.

4. het programma instellen voor de optische Camera op de Computer

1. Klik op ophalen in de taakbalk aan de linkerkant.
2. Kies de functie wondgenezing in de taakbalk aan de linkerkant.
3. Kies de plaat type door hieronder de plaat illustratiete klikken.
4. Unselect wells, niet in gebruik, door deze te markeren en klikt u op inschakelen op de bovenste links op het scherm.
   Opmerking: Alle putjes zijn standaard geselecteerd.
5. Pas de focus van de lens op de putten aan de positie van de cellen door met de rechtermuisknop op een van de putten.
   Opmerking: Autofocus kan ook handmatig worden aangepast door de balk te verplaatsen naar de rechterzijde van de illustratie van de plaat.
6. De tijdsperiode voor afbeeldingen onder Afbeelding Interval instellen (bijvoorbeeld (00: 30:00)).
7. Stel het aantal herhalingen te passen de gewenste periode (bijvoorbeeld 97 herhalingen).
8. De run start door te klikken op de knop Start in de lagere juiste hoek.

Results

HaCaT is een Keratinocyt cellijn, een van de meest voorkomende soorten van de cellen in de huid. Wanneer een wond optreedt, wordt de huidcellen beginnen te vermenigvuldigen en migreer over aan het bed van de wond te sluiten van de wond (Figuur 3). Beide processen zijn daarom van het grootste belang voor een goede genezing.

De optische camera kunt beide processen in real-time volgen. Voor migratie, h...

Discussion

Het belang van de migratie in studies van de ontwikkeling, wondgenezing, immunologie en kanker heeft geleid tot verschillende methoden om te studeren van migratie. Migratie kan een expressie van de uitbreiding of de sluiting van de kloof door de cellen. Meestal de sluiting van de kras wordt getest, zoals het is makkelijker om te groeien van cellen in een enkelgelaagde en breng een kras dan groeit de cellen in een specifiek formulier⁸. Onze studie toont een geoptimaliseerde methode voor handmatige ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS		Opticale camera
UniExplorer software	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))
HaCaT cel			Gedoneerd door Bispebjerg Ziekenhuis
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Medium voor HaCaT
FBS	Gibco	10270	Fétaal bovien serum
PBS	Gibco	D837	Zonder Mg+ en Ca2+
Penicilline-Streptomycine	Sigma	P0781	Antibiotica
Trypsine (10x)	Sigma	T3924
Mitomycin C	Tocris	3258	Remt proliferatie
Microtiterplaat	Greiner Bio-one	677 180
Incubator	Panasonic		37°C, 5% CO2
Hemocytometer	Assistent		Türk (0.1 mm)
Pipet boy	Accu-Jet pro