Een Droplet gebaseerde benadering van het Microfluidic en de microsfeer-PCR versterking voor Single-Stranded DNA waarbij

Samenvatting

Dit werk biedt een methode voor de fabricage van microfluidic druppel gebaseerde platforms en de toepassing van polyacrylamide microsferen voor microsfeer-PCR versterking. De microsfeer-PCR-methode maakt het mogelijk om te verkrijgen van single-stranded DNA waarbij zonder te scheiden van de double-stranded DNA.

Samenvatting

Druppel gebaseerde microfluidics inschakelen de betrouwbare productie van homogene microbolletjes in het kanaal van de microfluidic, die gecontroleerde grootte en morfologie van de verkregen microsfeer. Een copolymerized met een acrydite-DNA-sonde microsfeer werd met succes vervaardigd. Verschillende methoden zoals asymmetrische PCR exonuclease spijsvertering en isolatie op daar beklede magnetische kralen kunnen worden gebruikt voor het synthetiseren van single-stranded DNA (ssDNA). Echter, deze methoden niet efficiënt gebruiken grote hoeveelheden van hoogst gezuiverde ssDNA. Hier beschrijven we een microsfeer-PCR protocol detailleren hoe ssDNA kunnen worden efficiënt versterkt en gescheiden van dsDNA gewoon door pipetteren van een PCR reactiebuis. De amplificatie van ssDNA kan worden toegepast als potentiële reagentia voor de microarray DNA en DNA-SELEX (systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking) processen.

Inleiding

Single-stranded DNA (ssDNA) heeft uitgebreid beschouwd als een element van de moleculaire erkenning (MRE) als gevolg van zijn intrinsieke eigenschappen voor DNA-DNA hybridisatie^1,2. De ontwikkeling van ssDNA synthetische systemen kan leiden tot biologische toepassingen zoals DNA microarrays³, oligotherapeutics, diagnostiek en geïntegreerde moleculaire detectie op basis van aanvullende interacties^4,5.

Tot op heden zijn micrometer-schaal polymeer deeltjes met succes aangetoond met behulp van microfluidic-apparaten. Verschillende technieken van de microfluidic hebben bewezen te krachtig voor het produceren van zeer homogene microsferen op continue stroom in de microchannel milieu^6,7.

In de studie van Lee et al. ⁸, een druppel gebaseerde microfluidic platform voor de microfluidic synthese van copolymerizable oligo-microsfeer en ssDNA versterking werd gemeld. Het microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Polydimethylsiloxaan): een bovenste deel met een microfluidic channel-netwerk voor het genereren van de microsfeer en een bodem plat deel. Deze bestaan uit drie soorten PDMS fluidic kanalen: 1) een stroom focussering kanaal voor druppel-generatie, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van twee oplossingen, en 3) een sequentiële polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. Zodra twee onmengbare stromen in een PDMS fluidic enkellijns worden binnengebracht, kunnen de stromen worden gedwongen door de smalle opening structuur. De stroom gedrag zoals kanaal geometrie, debiet en viscositeit van invloed op de grootte en morfologie van de microsfeer. Daarom is de belangrijkste vloeibare stroom kan worden onderverdeeld in microscale monospheres^9,10.

Hier vindt u een gedetailleerde microsfeer-PCR protocol voor de amplificatie van ssDNA. Ten eerste wordt een druppel gebaseerde microfluidic apparaat ontwerpproces beschreven. Dan, de manier waarop in welke polyacrylamide microbolletjes met willekeurige DNA sjabloon kan worden matiemaatschappij op een complementaire manier wordt uitgelegd. Tot slot wordt een microsfeer-PCR protocol voor het versterken van de ssDNA weergegeven.

Protocol

1. fabricage van een PDMS Microfluidic Platform

1. Bereid 20 mL vloeibare PDMS prepolymeren door het mengen van de basis polymeer en katalysator in een volumeverhouding van 10:1. Giet 10 mL van de vloeistof PDMS op een schimmel SU-8 bereid op een silicium wafer voor het bovenste deel van het microfluidic netwerk. Voor het onderste gedeelte plat, giet u dezelfde hoeveelheid vloeibare PDMS op het silicium wafer zonder de structuur van een schimmel.
   Opmerking: Het microfluidic-netwerk is ontworpen in een CAD-programma en vervolgens omgezet in een photomask om het fabriceren van een model met behulp van de typische fotolithografie proces (Zie Aanvullende cijfers). Dit model bestaat uit de negatieve fotoresist SU-8 schimmel op de silicium wafer¹¹.
2. Plaats twee silicium wafers bekleed met vloeibare PDMS prepolymeren op de hete plaat en uitharding bij 75 ° C gedurende 30 minuten.
   1. Handmatig naar de uitgeharde laag van het PDMS van de SU-8 mal afschilferen. Hiermee lijnt u een diameter van 1,5 mm ronde hole punching gereedschap op de poort van de olie van de gerepliceerde microfluidic netwerk voor interfacing micron-schaal stroom kanalen met de macro vloeistof monsters. Punch handmatig uit het via-gat.
   2. Herhaal dit proces drie keer voor de vorming van de twee oplossingen en de retourzijde ponsen.
3. Hydrofiele oppervlaktebehandeling uitvoeren op zowel de bovenste en de onderste PDMS lagen met behulp van een hand-held corona treater¹² gedurende enkele seconden per monster.
   1. Stapel twee plasma-behandelde PDMS lagen en warmte bij 90 ° C gedurende 30 minuten met behulp van een warmhoudplaat voor het PDMS-naar-PDMS hechting proces. De hydrofoor watervoorziening met behulp van de spuitpomp op drie inlaat poorten voor de structurele lijmen en lekken testen van het gefabriceerde apparaat.

2. productie van Polyacrylamide Oligo-microsferen

1. Bereiden kraal-mengsel gedetailleerd in tabel 1.
2. Vortex en kort centrifuge de standaard ssDNA acrydite label sonde (Ap, 100 μM) en acrylamide:bis (19:1) stamoplossing.
3. Bereid oplossing ik door het mengen van 25 μL van 40% acrylamide bis oplossing, 10 μL van ssDNA (acrydite sonde), 10 μL van 5 x TBE buffer (900 mM boraat, 1.1 M Tris; 25 mM EDTA) en 5 μL van water. Bereid met 50 μl van 20% ammoniumnitraat persulfate-oplossing II.
4. Twee opstellen spuiten individueel gevuld met oplossing ik en oplossing II, en mount ze op de pomp in te voeren oplossing stromen in het microfluidic platform. Bereiden van minerale olie gemengd met 0,4% TEMED voor oppervlakte stollen van de microsfeer.
   Opmerking: TEMED is bekend als een vrije radicalen stabilisator. Vrije radicalen kunnen versnellen het tempo van de polymeer formatie met ammonium persulfate (APS) om te katalyseren acrylamide polymerisatie.
5. Vul een glazen fles met 4 mL van de minerale olie voor het genereren van een continue stroom.
6. Invoegen van twee buizen naar twee poorten in de dop van de fles als een reservoir van de microfluidic: de pneumatische poort voor de toepassing van de samengeperste lucht in de fles van de luchtcompressor en de vloeistof haven voor de aardolievoorziening van de onder druk staande aan de micro channel-netwerk uit de fles. Verbinding buizen tussen de fles en de poort van de olie in het microfluidic-apparaat.
   1. De buizen verbinden met de oplossing van de twee havens in het microfluidic-apparaat om de twee oplossingen van de injectiespuit pompen. Invoegen buizen naar de retourzijde wilt overbrengen, moet de gegenereerde microsfeer af in het bekerglas.
7. Stel het debiet van de spuitpomp op 0,4 - 0,7 mL/h. aanpassen samengeperste luchtdruk van de compressor met een regulator (82-116 kPa). Stel de draaisnelheid (500 rpm) van de magneetroerder bar in het bekerglas van het glas op een hete plaat. De spuitpomp bedienen en leveren de samengeperste lucht gegenereerd door een externe compressor in de glazen fles met behulp van de ON/OFF controle van een elektromagnetische klep¹³.
8. Observeer de vorming van microbolletjes in de stroom-focusing geometrie en stollen van gegenereerde microbolletjes in het bekerglas van glas met een digitale Microscoop.
   Opmerking: De snelheid van het formaat en de productie van de microsfeer hangt het debiet van oplossingen en de druk toegepast voor de minerale olie-stroom (tabel 2).

3. uitvoeren van Polyacrylamide Oligo-microsferen telt

1. Voor hemocytometer de kwantificering, nemen een kleine hoeveelheid (ongeveer 100 μl) van waterige oplossing van polyacrylamide oligo-microsferen en plaats op de hemocytometer van het glas, en zachtjes Vul de opschorting van de microsfeer het goed van de tellen kamer.
   Opmerking: Voor nadere bijzonderheden, zie http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Gebruik een microscoop en hand tally teller wilt tellen microbolletjes in één set van 16 vierkantjes. Vervolgens plaatst u de hemocytometer met de volgende reeks van de kamer en voort tellen totdat alle vier sets van 16 hoeken worden geteld.
3. Bepalen van de gemiddelde microsfeer telling en bereken het aantal microbolletjes in de originele kraal suspensie.
4. 100 μl van microsferen overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Verwijder het supernatant via zachte centrifugeren (400 x g) en pipetteren.

4. het uitvoeren van DNA hybridisatie op het oppervlak van Polyacrylamide Oligomicrosphere

Opmerking: Een identiek DNA sonde met een 5'-NH₂-groep in plaats van 5'-acrytide wijziging wordt toegevoegd in de oplossing die ik en getest voor Ap-bevattende microbolletjes in parallel. DNA hybridisatie resultaten worden weergegeven in Figuur 2. De oplossing van Cy3-geëtiketteerden complementaire oligonucleotide sondes (GLB) moet worden geplaatst in een donkere kamer.

1. Resuspendeer Cy3-cAp met 100 μl van 1xTE buffer (TE buffer: 10 mM Tris en 1μM EDTA, pH 8,0) met het oog op een eindconcentratie van 100 μM. Bijvoorbeeld resuspendeer 1 pmol van GLB in 100 mL TE buffer en overdracht aan een microcentrifuge buis bedekt met aluminiumfolie.
   Opmerking: Voor strand sequenties, Zie tabel 3.
2. 100 μM van Cy3-cAp aan een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis met microsferen Ap-copolymerized toevoegen.
3. Tik op de buis een paar keer om te mengen en Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 1 uur.
4. Verwijder het supernatant en verwijder residuele buffer via pipetteren.
5. Spoel driemaal met 500 μL van TE buffer.
6. Resuspendeer microsferen door zachtjes te tikken op de microcentrifuge buis. Herhaal vervolgens stap 4.4.
7. Plaats microsferen op het glasplaatje (75 x 50 mm) en bedek met de aluminiumfolie voorafgaand aan de beeldvorming.

5. asymmetrische PCR voor het versterken van de ssDNA

1. Voorbereiden op een asymmetrische PCR reagens mix sturen ssDNA te analyseren. Ontdooi de reagentia in tabel 4 op het ijs. Houd niet het Taq polymerase enzym (50 U/µL) op het ijs, maar eerder opgeslagen bij-20 ° C totdat het nodig is.
2. Zachtjes vortex alle reagentia en vervolgens kort centrifugeren buizen bij 10.000 x g gedurende 10 s.
3. Alle reagentia combineren zoals beschreven in tabel 4.
4. Leg monsters in een thermocycler en beginnen de asymmetrische PCR onder de volgende voorwaarden: 25 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s), 85 ° C gedurende 5 min, houd bij 4 ° C.

6. microsfeer-PCR voor het versterken van de ssDNA

Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor het versterken van de ssDNA in een PCR reactiebuis. Microsfeer-PCR reacties werden uitgevoerd in 50 μl van reactie volume. De gedetailleerde sequenties gebruikt om te vergroten van ssDNA zijn vermeld in tabel 5. In dit geval, kan Ap op het oppervlak van de microsferen ontharden aan willekeurige DNA sjablonen complementair. Dit is een zeer belangrijke stap voor de productie van complementaire DNA-strengen (antisense bundel van DNA, Figuur 3). Het DNA uitgebreid wordt gebruikt als een sjabloon voor microsfeer-PCR versterking.

1. Bereiden microsfeer-PCR reagens mix. Ontdooi de reagentia in tabel 6 op het ijs; echter houd niet het enzym Taq polymerase op ijs. Bewaar het bij-20 ° C totdat het nodig is.
2. Zachtjes vortex alle reagentia en vervolgens kort centrifugeren buizen bij 10.000 x g gedurende 10 s.
3. Verkrijgen door middel van microscopische tellen ongeveer ~ 25 microsferen.
   Opmerking: Het aantal microbolletjes in één reactiebuis worden berekend met behulp van een lichte Microscoop met 40 X vergroting. Ongeveer 25 ~ microsferen worden gebruikt voor microsfeer-PCR versterking. Meer gedetailleerde informatie is in stap 3.
4. Alle reagentia combineren zoals beschreven in tabel 6.
5. Leg monsters in een thermocycler en beginnen de asymmetrische PCR onder de volgende voorwaarden: 25 cycli (95 ° C gedurende 30 s, 52 ° C gedurende 30 s, en 72 ° C gedurende 30 s), 85 ° C gedurende 5 min, houd bij 4 ° C.
6. Volgende versterking, voeg 8 l 6 x laden buffer en laadt 15 μL van elk monster in 2% agarose gel. Voer de Elektroforese bij 100 V gedurende 35 min. in 1 x TAE (Tris-acetaat-EDTA, 40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA, pH 8.2) buffer.

7. confocale microscopie overname

Opmerking: De resultaten van de microsfeer-DNA sonde hybridisatie zijn beeld onder een confocal microscoop. Beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van ImageJ.

1. Corrigeer gehybridiseerde microsferen tot het stadium van de Microscoop in een houder.
2. Selecteer de laser (laser Helium/Neon, 543 nm lijn) en zet hem aan in laser controle.
3. Selecteer het objectief in Microscoop controle.
4. Selecteer het gewenste filter voor Cy3 en kanaal in configuratiecontrole.
5. Start van het experiment en observeren van het monster. Instellingen voor de confocal microscoop zijn samengevat in tabel 7.

Resultaten

Het verzonnen polymere druppel gebaseerde microfluidic platform bestaat uit twee lagen van het PDMS (Figuur 1a). Drie soorten microfluidic kanaal netwerken worden gebruikt voor het genereren van microsferen: 1) Flow-focusing geometrie zoals weergegeven in Figuur 1b, 2) een serpentine kanaal voor het mengen van oplossing ik en oplossing II en 3) een polymerisatie-kanaal voor microsfeer stollen. De hoogte van alle kanalen was 60 μm...

Discussie

Verontreinigingen van dsDNA zijn een belangrijk thema in de versterking van de ssDNA. Blijft het moeilijk om te minimaliseren dsDNA versterking in conventionele asymmetrische PCR versterking¹⁵. Bovendien, hoewel technische verbeteringen voor het genereren van ssDNA we het verhogen van de efficiëntie van monsters worden verwerkt kunnen, is ssDNA isolatie nog steeds problematisch vanwege de hoge kosten en opbrengsten van de onvolledige zuivering.

Asymmetrische PCR is een ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Componenten van chip
40% Acrylamide:bis oplossing (19:1)	Bio-rad	1610140	Componenten van copolymeriseerbare oligo-microsfeer
Ammoniumpersulfaat, APS	Sigma Aldrich	A3678	Verharder van acrylamide:bis oplossing
N,N,N′,N′-Tetramethylethyleendiamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Katalysator van ammoniumpersulfaat
Mineralolie	Sigma Aldrich	M5904	Tabel 1. Oplossing III. Component van microsfeer reagentia
Cy3 gelabelde complementaire oligonucleotide proben	Bioneer	gesynthetiseerd	Tabel 3. Sequentie-informatie
ssDNA acrydide gelabelde sonde	Bioneer	gesynthetiseerd	Tabel 1. Oplossing I. Component van microsfeer reagentia
Tris	Biosesang	T1016	Componenten van TE buffer, pH buffer oplossing
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Componenten van TE buffer, verwijdering van ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplificatie
Confocale microscoop	Carl Zeiss	LSM 510	Identificeren van oligonucleotiden blootstelling van microsfeeroppervlak
Lichtmicroscoop	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Berekenen van het aantal microsferen
T100 Thermische Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplificatie
Handbediende Corona-behandelaar	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrofiele oppervlaktebehandeling
Hot plate	As one	HI-1000	verwarmingsplaat voor het uitharden van vloeibaar PDMS
Spuitpomp	kd Scientific	78-1100	Uniforme stroming van Oplossing I en Oplossing II
Compressor	Kohands	KC-250A	Stromingscontrole van Oplossing III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Berekenen van het aantal microsferen