Method Article

2 in 1: stap zuivering van de affiniteit voor de parallelle analyse van eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen

DOI:

10.3791/57720

⸱

August 6th, 2018

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet interacties zijn cruciaal voor alle cellulaire functies. Hierin beschrijven we een protocol waarmee parallelle analyse van deze interacties met een eiwit van keuze. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de plant celculturen en affiniteit zuivering combineert met massa spectrometrie gebaseerde eiwitten en metaboliet detectie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellulaire processen worden gereguleerd door interacties tussen biologische moleculen zoals nucleïnezuren, eiwitten en metabolieten. Terwijl het onderzoek van eiwit-eiwitinteractie (PPI) geen noviteit is, vormen experimentele benaderingen willen karakteriseren van endogene eiwit-metaboliet interacties (PMI) een vrij recente ontwikkeling. Hierin presenteren wij een protocol waarmee gelijktijdige karakterisering van de PPI en PMI van een proteïne van keuze, hierna aangeduid als aas. Ons protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis cel-culturen en affiniteit zuivering (AP) combineert met de Spectrometrie van de massa (MS)-op basis van eiwit en metaboliet detectie. Kortom, zijn transgene Arabidopsis lijnen, uitdrukken van aas eiwit gesmolten tot een affiniteit tag, eerst lysed om een inheemse cellulaire extract bekomen. Anti-label antilichamen worden gebruikt voor pull-down eiwit en metaboliet partners van het aas-eiwit. De complexen affiniteit-gezuiverd worden geëxtraheerd met behulp van een one-step methyl- tert-butyl ether (MTBE) / methanol/water-methode. Terwijl metabolieten in de polar of de hydrofobe fase verdeelt, kunnen eiwitten worden gevonden in de pellet. Zowel de metabolieten en de eiwitten worden vervolgens geanalyseerd door ultra krachtige vloeibare chromatografie-massaspectrometrie (UPLC-MS of UPLC-MS/MS). Leeg-vector (EV) controle lijnen worden gebruikt om uit te sluiten van valse positieven. Het grote voordeel van onze protocol is dat het identificatie van eiwitten en metaboliet partners van een doel-eiwit in parallel in in de buurt van de fysiologische omstandigheden (mobiele lysate) mogelijk maakt. De onderhavige methode is eenvoudig, snel en kan gemakkelijk aangepast worden aan biologische systemen dan plant celculturen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreven de methode beoogt de identificatie van metaboliet en eiwit partners van een proteïne van keuze in de omgeving vanin-vivo cellulaire lysate voorwaarden. Er werd gespeculeerd dat veel meer metabolieten dan vandaag gekenmerkt een belangrijke regelgevende functie1 hebben. Metabolieten kunnen fungeren als biologische schakelaars, wijzigen van de activiteit, functionaliteit, en/of de lokalisatie van hun receptor eiwitten2,3,4. In het laatste decennium geweest verschillende doorbraak methoden, waardoor identificatie van PMI in vivo of in de omgeving vanin-vivo voorwaarden, ontwikkelde5. Beschikbare benaderingen kunnen worden gescheiden in twee groepen. De eerste groep bestaat uit technieken die met een bekende-metaboliet aas beginnen om te val roman eiwit partners. Methoden omvatten affinity chromatografie6, drug affiniteit responsieve doel-stabiliteit assay7, chemo-proteomics8en thermische Proteoom profilering van9. De tweede groep bestaat uit een enkele methode die met een bekende eiwit begint teneinde kleine-molecuul liganden10,11.

AP in combinatie met MS gebaseerde jachtgeweerlipidomics werd gebruikt voor het analyseren van eiwit-lipide complexen in Saccharomyces cerevisiae12. Als uitgangspunt, de auteurs gebruikt giststammen 21 enzymen die betrokken zijn bij biosynthese van ergosterol uitdrukken en 103 kinases gesmolten tot een zuivering van de tandem-affiniteit (TAP) label. 70% van de enzymen en 20% van de kinases bleken te binden verschillende hydrofobe liganden, vergieten van licht in het ingewikkelde eiwit-lipide interactie netwerk.

Voorheen konden we aantonen dat eveneens aan lipiden, polar en semi-polaire verbindingen ook gebonden aan eiwitcomplexen geïsoleerd van de cellulaire lysates13 blijven. Op basis van deze bevindingen, hebben we besloten voor het optimaliseren van de AP-methode, gepubliceerd eerder10,,11 voor plantencellen en hydrofiele stoffen14. Voor dit doel gebruikten we TAP vectoren beschreven door Van Leene et al. 2010, met succes gebruikt in de plant PPI studies15. We besloten om te verkorten van de benodigde tijd voor het verkrijgen van transgene lijnen, Arabidopsis celculturen. Wij werken een one-step methyl- tert-butylether, (MTBE) / methanol/water extractiemethode, waardoor de karakterisatie van eiwitten (korrel), lipiden (organische fase) en hydrofiele metabolieten (waterige fase)16 in één affiniteit-zuivering experiment. EV control lijnen werden geïntroduceerd om uit te sluiten van valse positieven, bijvoorbeeld eiwitten binden aan de tag alleen. Als bewijs van concept we gelabeld drie (van de vijf) nucleoside (III) difosfaat kinases presenteren in het Arabidopsis genoom (NDPK1-NDPK3). Onder andere bevindingen, kunnen wij laten zien dat NDPK1 met glutathione S communiceert-transferase en glutathion. Bijgevolg kunnen wij bewijzen dat NDPK1 is onderworpen aan glutathionylation14.

Kortom, het gepresenteerde protocol is een belangrijk instrument voor het karakteriseren van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine-molecuul interactienetwerken en vormt een belangrijke vooruitgang over bestaande methoden.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorbereiding van transgene Arabidopsis cultuur cellijnen, met inbegrip van klonen, Transformatie selectie en groei voorwaarden kan worden gevonden in17. Merk op dat EV control lijnen worden aanbevolen om te corrigeren voor valse positieven. Bevestig de overexpressie van het aas eiwit door westelijke vlekkenanalyse, bijvoorbeeld met behulp van IgG antilichamen tegen het G-proteïne-deel van de tandem affiniteit tag voorafgaand aan het experiment. Het is belangrijk om te scheiden van de media van de groei van cultuur van de cel plantmateriaal.

1. voorbereiding van de plantaardige cel materiaal voorafgaand aan het Experiment

  1. Een PSB-L A. thaliana cultuur cellijn de proteïne van belang18overexpressing groeien.
    1. Bereiden MSMO medium, dat 4.43 g/L die MSMO gemengd met 30 g/L sacharose bevat. De pH van de buffer 5.7 met 1 M KOH en autoclaaf de oplossing aanpassen. Voorafgaand aan het experiment, een aanvulling op het medium met 0,5 mg/L α-naphthaleneacetic zuur, kinetin van 0,05 mg/L en 50 μg/mL kanamycine.
    2. Cultiveren getransformeerde plant celculturen in 50 mL voor MSMO medium in een maatkolf van 100 mL in een roteerapparaat orbitaal platform met zachte agitatie (130 rpm). Groeien van cellen in een cultuur kamer bij 20 ° C en lichtintensiteit gelijk is aan 80 μmol m-2 s-1.
    3. Subcultuur cellen in verse media elke 7 dagen, ze 1:10 verdunnen.
  2. Het verzamelen van cellen op de logaritmische groeifase met behulp van een glazen trechter met gecombineerd met een vacuümpomp, met behulp van een nylon gaas als filter. De infiltreren wikkel in aluminiumfolie en bevriezen in vloeibare stikstof.
    Let op: Vergeet niet dat de vloeibare stikstof extreem koude is. Onjuiste afhandeling kan brandwonden veroorzaken. Passende persoonlijke beschermingsmiddelen dragen, met inbegrip van thermisch geïsoleerd handschoenen, beschermende bril en een laboratoriumjas.

2. Tik Protocol

Opmerking: De volgende stap is aangepast van de Maeda et al. 201411 en Van Leene et al. 201117.

  1. Meng geoogst en ingevroren cel cultuur plantmateriaal met behulp van een mixer molen (2 min bij 20 Hz) of een mortier en een stamper fijn poeder te verkrijgen. Aliquot 3 g van het materiaal van de grond (overeenkomend met ongeveer 90 mg totaal eiwit) per monster. Vermijd ontdooien van het monster tijdens deze stap met behulp van vloeibare stikstof vooraf gekoeld apparatuur.
    Opmerking: Winkel grond plantaardig materiaal in een tube van 50 mL bij –80 ° C aan het begin van een AP-procedure.
  2. Triturate van het monster in een mortier vloeistof-stikstof-precooled met 3 mL ijskoud lysis-buffermengsel (0,025 M Tris-HCl pH 7.5; 0,5 M NaCl 1,5 mM MgCl20.5 mM DTT; 1 mM NaF; 1 mM nb3VO4; 100 x verdunde commerciële proteaseinhibitor die cocktail; 1 mM PMSF) totdat het materiaal ontdooit. Zodra het monster ontdooit, onmiddellijk overgaan naar de volgende stap.
    Opmerking: Bereiden de lysis buffer fresh. Het introduceren van blancomonsters bij deze stap. Wasmiddelen zijn niet aanbevolen omdat ze leiden problemen in MS detectie tot kunnen.
  3. Als u wilt verwijderen van cellulaire puin, verdeel het materiaal in 2 mL microcentrifuge buizen en centrifuge op 20,817 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. 3 mL van de heldere lysate in een centrifugebuis 15 mL conische verzamelen.
  4. Equilibreer tijdens centrifugeren stap, IgG-Sepharose kralen. Aliquot 100 µL van de kralen per monster en spoel ze met 1 mL lysisbuffermengsel. Vortex aan resuspendeer kralen en flash-spin. Negeren van de lysis-buffermengsel en herhaal de stap tweemaal. Resuspendeer kralen in 400 µL van lysis buffer.
  5. Parels aan de verzamelde plant lysate toevoegen en Incubeer het mengsel op een roterend wiel gedurende 1 uur bij 4 ° C.
  6. Overdracht het mengsel in een injectiespuit gecombineerd via Luer-lock cap met een spin-kolom met filter porie grootte 35 µm. toepassen Druk geschiedde de lysate via. Kralen met bijgevoegde complexen blijft op het filter, terwijl de lysate doorloopt.
    Opmerking: Gebruik eventueel een vacuümsysteem spruitstuk. Zorg ervoor dat zachte pressiemiddelen om niet schadelijk voor de kralen.
  7. Wassen van de kralen eerst met 10 mL buffer te wassen (0,025 M Tris-HCl pH 7.5; 0,5 M NaCl), en vervolgens met 1 mL elutie buffer (EDTA 0.5 mM, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl; 1000 x verdunde E64 en 1 mM PMSF). Het wassen met een injectiespuit gekoppeld aan de kolom of het spruitstuk vacuümsysteem uitvoeren
    Opmerking: Wanneer met behulp van een vacuümsysteem spruitstuk er zeker toe te passen zachte druk om niet te schaden van de kralen.
  8. Incubeer kralen met de 400 µL van elutie buffer met 50 U van een verbeterde versie van de tabak etch protease virus (AcTEV). Gebruik tabel shaker bij 1000 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten bij 16 ° C.
    Opmerking: Vergeet niet om een plug te sluiten de kolom onderaan de elutie-buffer toe te voegen.
  9. Voeg een extra gedeelte (50 U) van het enzym in de kolom en Incubeer het mengsel gedurende de volgende 30 minuten onder dezelfde, hierboven, beschreven voorwaarden.
  10. Verzamelt het eluaat in een tube van 2 mL microcentrifuge, hetzij door middel van centrifugeren (1 min, 20,817 x g) hetzij door vacuüm variëteit. Als u wilt verwijderen van resterende complexen, voeren een extra elutie stap met behulp van 200 µL van elutie buffer.
    Opmerking: Bewaar het monster bij –20 ° C of –80 ° C, of meteen doorgaan met de eiwitten en metaboliet extractie stap. Ontdooi bevroren monsters op ijs.

3. westelijke vlekkenanalyse

  1. Controleer de aanwezigheid van het aas eiwit in het verzamelde eluaat gebruiken 10 µL van het eluaat – metaboliet eiwithoudende SDS-pagina en westelijke vlekkenanalyse. Gebruik de muis primaire antilichamen tegen streptavidine-bindend-proteïne (1:200), een deel van de TAP-tag die overblijven na de TEV protease decollete, zoals beschreven in Van Leene et al. 201117voor de identificatie van de proteïne van belang zijn. Gebruik vervolgens de secundaire geit anti-muis-antilichamen HRP wordt gekoppeld.

4. metaboliet en eiwit extractie

Opmerking: Dit protocol is aangepast van Giavalisco et al. 201116.

Opmerking: Gebruik vanaf deze stap vanaf UPLC-MS-grade oplossingen.

  1. Voeg vervolgens 1 mL van methyl- tert-butyl ether (MTBE) / methanol/water oplosmiddel (3:1:1) om de verzamelde eluaat en meng het monster door inversie. Zorg ervoor dat het oplosmiddel wordt gekoeld tot –20 ° C vóór de extractie stap.
    Let op: MTBE en methanol zijn schadelijke stoffen. De extractie stap onder de zuurkast uitvoeren en passende persoonlijke beschermingsmiddelen, bijvoorbeeld handschoenen dragen.
  2. 0.4 mL methanol: water 1:3-oplossing toevoegen aan elk monster en meng de inhoud van het monster door inversie.
    Opmerking: Suppletie van het mengsel met methanol: water oplossing resulteert in fase-separatie zichtbaar. De bovenste fase bevat lipiden, lagere fase bevat polaire en semi-polaire metabolieten en eiwitten kunnen worden gevonden in de pellet.
  3. Aparte fasen, Centrifugeer het monster bij 20,817 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur, dan de bovenste fase voor lipide metingen (niet gedaan in dit protocol) verzamelen met behulp van een pipet vloeibare manueel met de capaciteit van het volume van de 1 mL.
  4. Het toevoegen van 0,2 mL van methanol en meng door inversie.
  5. Centrifugeer het monster bij 20,817 x g gedurende 2 min op RT, dan verzamelen de polar fase voor metaboliet metingen (polar en semi-polaire verbindingen). Voorkom verstoring van de eiwit-pellet, laat ongeveer 50 µL van de vloeibare fase aan de onderkant van de buis.
  6. Droge verzamelde monsters voor metaboliet metingen overnachting in een centrifugale verdamper. Vermijd te veel drogen de eiwit pellets door het verwijderen van monsters van de verdamper na 30-60 min.
    Opmerking: Bewaar monsters bij –20 ° C of –80 ° C, of meteen doorgaan met de voorbereiding van eiwitten voor LC-MS/MS-analyse.

5. voorbereiding van monsters voor analyse van Proteomic

Opmerking: Deze stap is aangepast van Olsen et al. 200419 en de technische handleiding voor de Mix trypsine/Lys-C (Zie Tabel van materialen).

  1. Enzymatische spijsvertering van het monster uit te voeren.
    Let op: Oplosmiddelen gebruikt tijdens de enzymatische vertering en ontzouten van het monster schadelijk zijn. Werken onder de zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen, bijvoorbeeld handschoenen dragen.
    1. Ontbinden eiwit pellet in 30 µL van vers bereide denaturatie buffer (40 mM Ammoniumbicarbonaat wordt met 2 M thioureum/6 M ureum, pH 8). Om betere oplosbaarheid van eiwitten, een 15-min ultrasoonapparaat stap uit te voeren. Herhaal de stap totdat de pellet oplost.
    2. Centrifugeer het monster bij 20,817 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, dan het supernatans naar een nieuwe microcentrifuge buis.
    3. Bepalen eiwitconcentratie met behulp van de analyse van Bradford eiwit.
    4. Voor verdere analyse, aliquoot een volume gelijk is aan 100 µg voor eiwit en vul het monster tot 46 µL met denaturatie buffer.
    5. Voeg aan het monster 2 µL van vers bereide vermindering buffer (50 mM DTT in H2O opgelost) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Behandeling van het monster met 2 µL van vers bereide alkylatie buffer (150 mM iodoacetamide opgelost in 40 mM Ammoniumbicarbonaat buffer) en laat het mengsel in het donker gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
    7. Verdun het monster met 30 µL van 40 mM Ammoniumbicarbonaat buffer en Voeg 20 µL van LysC/trypsine Mix.
    8. Na 4 uur incubatie bij 37 ° C, Verdun het monster met 300 µL van 40 mM Ammoniumbicarbonaat buffer.
    9. Ga verder met overnachting incubatie bij 37 ° C.
    10. Breng het monster met ongeveer 20 µL van 10% trifluorazijnzuur (TFA) verkrijgen van pH < 2. Controleer monster pH met behulp van een pH-strip.
      Opmerking: Opslaan van het monster bij –20 ° C of ga naar de volgende stap.
  2. Desalt de verteerd eiwitten.
    Opmerking: Gebruik bij voorkeur een vacuümsysteem spruitstuk. Vermijd te veel drogen van de kolom.
    1. Spoel de C18 SPE kolom (Zie Tabel van materialen) met 1 mL van 100% MeOH en vervolgens met 1 mL 80% acetonitril (ACN) met 0,1% TFA verdund in water. Gebruik, hier en in de verdere eiwit-ontzouten stappen, een spruitstuk vacuümsysteem om het proces te versnellen. Vermijd te veel drogen van de kolom.
    2. De kolom equilibreer door wassen tweemaal met 1 mL 0,1% TFA verdund in water.
    3. Het laden van het monster op de kolom. Spoelen buis met extra 200 µL van 0,1% TFA en overdracht van de oplossing op de kolom. De oplossingen die doorlopen in de kolom.
    4. Was de kolom tweemaal met 1 mL 0,1% TFA.
  3. Elueer ontzout peptiden uit de kolom met 800 µL van 60% ACN, 0,1% TFA oplossing. Droog de verzamelde Fractie in een centrifugale verdamper, het vermijden van te veel drogen van de eiwitoplossing door het verwijderen van monsters van de verdamper na 30-60 min.
    Opmerking: Bewaar monsters bij –20 ° C of –80 ° C of onmiddellijk overgaan tot de volgende stap. Houd de monsters op ijs in opeenvolgende stappen.

6. meting bereid EiwitSteekproeven met UPLC-MS/MS.

Opmerking: Voordat proteomic en metabolomic metingen, filteren (0,2 µm poriegrootte) en ontgas alle buffers met behulp van een vacuümpomp gedurende 1 uur.

  1. Resuspendeer gedroogd peptide pellet opgeslagen in 2 mL microcentrifuge buis in 50 µL van het gebruik van buffer C (3% v/v ACN, mierenzuur van 0,1% v/v) manueel vloeibare hanteren pipet met 200 µL volumecapaciteit. Bewerk ultrasone trillingen ten monsters gedurende een 15 minuten in een ultrasoonbad met 35 kHz ultrasoon frequentie.
    Let op: ACN en mierenzuur zijn schadelijke stoffen. Werken onder de zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen, bijvoorbeeld handschoenen dragen.
  2. Centrifugeer het monster bij 20,817 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, dan 20 µL van het supernatans dat naar een glazen ampul.
  3. Aparte verteerd peptiden met een C18 reversed-phase kolom verbonden met een vloeibare chromatografie en verwerven van massaspectra met behulp van een massaspectrometer.
    1. Scheiden op de kolom 3 µL van het monster met behulp van een 300-nl/min debiet. Gebruik voor een mobiele fase, buffer C en D (63% v/v ACN, mierenzuur van 0,1% v/v), vormen een verloop van 3% speedramp ACN tot 15% ACN meer dan 20 min en dan naar 30% ACN over de volgende 10 min.
      Opmerking: Bewaar de rest van het monster bij –20 ° C of –80 ° C tot enkele maanden. Refreeze vóór proteomic de meting, het monster op het ijs.
    2. Verontreinigende stoffen wassen gedurende 10 minuten met behulp van 60% ACN en de kolom met 5 µL van buffer C voor meting van het volgende monster equilibreer.
    3. Krijgen massaspectra met gegevens-afhankelijke MS/MS methode met resolutie set bij 70.000, AGC doelgroep van 3e6 ionen, maximale injectie tijd van 100 ms en een m/z variërend van 300 tot 1600. Verwerven van maximaal 15 MS/MS scans op een resolutie van 17.500, AGC doelgroep van 1e5, maximale injectie tijd van 100 ms, underfill ratio van 20%, met een venster van de isolatie van 1.6 m/z en m/z variërend van 200 tot 2000. Apex trigger (6-20 s), set dynamische uitsluiting tot 15 s, en exclusief kosten van 1 en 5 > inschakelen.

7. verwerking van Proteomic gegevens

  1. Download de nieuwste Arabidopsis thaliana Proteoom database van http://www.uniprot.org/ en hun gehalte aan verontreinigingen database bevatten. Analyseren van de ruwe gegevens die zijn verkregen van de LC-MS wordt uitgevoerd met behulp van MaxQuant met de geïntegreerde Andromeda peptide zoekmachine met behulp van de standaardinstelling met ingeschakeld LFQ normalisatie20,21,22. Gedetailleerde informatie over de parameters die worden gebruikt in de Tabel S1.
  2. Open het uitvoerbestand "eiwit groups.txt". Voor verdere analyse, filteren eiwit groepen geïdentificeerd met ten minste twee unieke peptiden. Eiwit groepen die zijn gedefinieerd door MaxQuant als potentiële contaminanten en filter voor A. thaliana (ARATH in Fasta headers kolom) aanwezige eiwitten in de database verwijderen.
  3. Om te testen de betekenis van eiwitverrijking tussen monsters, gebruiken LFQ genormaliseerd intensiteiten en uitvoeren van de ongepaarde, tweezijdige Student t-toets, gevolgd door meerdere vergelijking correctie (bijvoorbeeld Benjamini & Hochberg valse ontdekking tarief (FDR) correctie of Bonferroni correctie).
    1. P-waarde berekenen door het vergelijken van LFQ intensiteiten verkregen voor EV controle- en NDPK1. Alle onbepaalde waarden wegfilteren. P-waarden in oplopende volgorde sorteren en R script of online rekenmachine (bv https://www.sdmproject.com/utilities/?show=FDR) gebruiken om te berekenen FDR correctie. Filter voor FDR waarden onder 0.1.
      Nota: Beschouw de vorm van data-analyse geschikt is voor het onderzoek. Voor kwantitatief onderzoek (analyse van eiwitverrijking tussen monsters) de "LFQ" intensiteitswaarde, gebruiken terwijl voor kwalitatief onderzoek (aan- of afwezigheid van bepaalde eiwitten) de waarde van de "Intensiteit" kiezen.
    2. Filter voor eiwit-groepen die meer overvloedig zijn in de NDPK1 vergelijken met EV controle. Lokalisatie van potentiële eiwit partners met behulp van de database SUBA23 bepalen en een juiste voor eiwit mede gelokaliseerde met NDPK1.

8. meting van de monsters met Polar fase met UPLC-MS.

  1. Resuspendeer gedroogde polar fase van stap 4.5 in 200 µL van water en bewerk ultrasone trillingen ten het monster gedurende 5 minuten.
  2. Centrifugeer het monster bij 20,817 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, waarna het supernatant overbrengen in een glazen ampul.
    Opmerking: Bewaar de rest van het monster bij –20 ° C of ° C voor de –80 tot enkele maanden. Refreeze vóór de meting van de metabolomic, het monster op het ijs.
  3. Uitvoeren van een stap van de scheiding met behulp van UPLC gekoppeld aan C18 reversed-phase kolom en het verwerven van massaspectra met MS.
    1. Laden op de kolom 2 µL van het monster per injectie voor elke ionisatie-modus (positief en negatief) en scheiden van de breuk met behulp van 400 µL/min debiet. De vereiste om verloop te maken voor het meten van de metaboliet, bereid mobiele fase-oplossing als volgt: een (0,1% mierenzuur in H2O) buffer en buffer B (0,1% mierenzuur in ACN).
    2. Aparte metabolieten bij 400 µL/min en de volgende helling: 1 min 99% van de buffer A, 11-min lineair verloop van 99% van buffer A tot en met 60% van de buffer A, 13-min lineair verloop van 60% van de buffer A tot en met 30% van de buffer A, 15-min lineair verloop van 30% van buffer A tot en met 1% van buffer A, Houd 1% concentratie tot 16 min. vanaf 17 min, gebruik lineair verloop van 1% van de buffer A 99% van de buffer A. equilibreer opnieuw de kolom voor 3 min met 99% concentratie van buffer A voor meting van het volgende monster.
    3. Verwerven van massaspectra die massa scala tussen de 100 en 1500 m/z met resolutie ingesteld op 25.000 en laadtijd beperkt tot 100 ms. instellen AGC doel tot en met 1e6, capillaire spanning te 3kV met een schede gas flow en ondersteunende gas waarde van 60 en 20 , respectievelijk. Capillaire temperatuur ingesteld op 250 ° C en skimmer spanning te 25V.

9. verwerking van metabolomica gegevens

  1. Proces verzameld chromatogrammen verworven van beide modi ionisatie. Gebruik software om te pakken van massa kosten verhouding (m/z), de retentietijd (RT) en de intensiteit van gekoppelde pieken, bijvoorbeeld commerciële software (Zie Tabel van materialen) of alternatieve24.
    1. Processing software start door te dubbelklikken op het .exe-bestand
    2. Nieuwe werkstroom maken, zoeken naar activiteit "Load from File" en verplaatsen deze activiteit "drag and drop" in de workflow van de lege ruimte. Druk op de activiteit met de rechter muisknop en open instellingen van de activiteit.
      1. In het tabblad "Algemeen" instellingen met een naam van het experiment instellen in het veld 'Naam' en klik vervolgens op 'Selecteer bestanden en mappen' en ruwe chromatogrammen markeren.
      2. In het tabblad "Geavanceerd" instellingen met, kunt u het "Profiel gegevens Cutoff" instellen door 0 intensiteit. Klik op "Apply" en "OK".
    3. Zoeken en toevoegen van activiteit "Gegevens vegen". Druk op de activiteit met de rechter muisknop en open instellingen van de activiteit.
      1. In het tabblad "Algemeen" instellingen met markeren "zwaartepunt" en "MS/MS gegevens". Verwijder alle gegevens van de MS/MS door het selecteren van "Everything" in de jury.
    4. Zoeken en toevoegen van de activiteit "Chromatogram chemische lawaai aftrekken". Druk op de activiteit met de rechter muisknop en open instellingen van de activiteit.
      1. In het tabblad "Algemeen" instellingen met mark "Chromatogram glad" en stel aantal scans "3" en "Estimator" naar "Moving average". "RT venster" ingesteld op 51 scans, "Kwantiel" tot 50%, aftrekken "Methode" en 750 intensiteit "Drempel".
      2. In het tabblad "Geavanceerd" instellingen met mark "RT structuur Removal" en "RT minimumlengte" Stel tot 5 scans.
      3. In het tabblad "Geavanceerd" met mark "m/z structuur verwijderen" en "Minimum m/z lengte" ingesteld op 3 punten.
    5. Zoeken en toevoegen van de activiteit "Chromatogram RT uitlijning". Druk op de activiteit met de rechter muisknop en open instellingen van de activiteit.
      1. Stel in het tabblad "Algemeen" instellingen met "Uitlijning Scheme" naar "Paarsgewijs uitlijning Base Tree" en "RT Zoek Interval" op 0,5 min.
      2. In het tabblad "Geavanceerd" instellingen met de standaardparameters te gebruiken.
    6. Zoeken en toevoegen van de activiteit "Peak detectie" in "Chromatogram" groep van activiteiten. Druk op de activiteit met de rechter muisknop en open instellingen van de activiteit.
      1. In het tabblad "Algemeen" instellingen met, kunt u het "Sommatie venster" instellen door 0.09 min, "Een piek van een minimumformaat" aan 0.03 min, "Strategie samenvoegen" tot "Centra" en "Samenvoegen maximumafstand" op 5 punten. In de "Peak RT Splitting" wordt in vak "Gap/piek Ratio" ingesteld op 50%.
      2. Stel in het tabblad "Geavanceerd" instellingen met "Smoothing venster" op 5 punten, "Verfijning drempel" tot 80% en "Consistentie drempel" tot 1. Stel "Center Computation" als "Intensiteit-gewogen" met "Intensiteit drempel" vastgesteld op 70%.
    7. Zoeken en toevoegen van de activiteit "Isotoop Clustering" in "Chromatogram" groep van activiteiten. Druk op de activiteit met de rechter muisknop en open instellingen van de activiteit.
      1. Stel in het tabblad "Algemeen" instellingen met "RT tolerantie" 0,015 min te "m/z tolerantie" tot 5 ppm.
      2. Op het tabblad met "Envelop montage", ingesteld "Methode" als "No Shape beperking" en "Ionisatie" als "Protonering (voor positieve modus) en"Deprotonering"(voor negatieve modus). Ingesteld "Minimum en Maximum laden" op 1 en 4, respectievelijk.
      3. In het tabblad "Geavanceerd" instellingen met de standaardparameters te gebruiken.
    8. Zoeken en toevoegen van activiteit "Singleton Filter".
    9. Als u wilt exporteren resultaten van gegevensverwerking, zoeken en toevoegen van de activiteit "Analist" in de groep van activiteiten "Exporteren".
      1. Stel in het tabblad "Algemeen" instellingen met "Type" als "Clusters" en "Waarneembare" als "Vatte intensiteit". Kies "Aangepaste bestemming" en geef map op voor het exportbestand.
      2. In het tabblad "Geavanceerd" instellingen met de standaardparameters te gebruiken.
  2. Aantekeningen massa functies met behulp van in-house referentie-samengestelde database.
    1. Analyseren een of meerdere MS rang referentie-samengestelde met UPLC-MS. gebruik dezelfde LC-MS methode voor analyse van referentiestoffen en metabolieten mede gezuiverd met proteïne van belang.
      Opmerking: Voor deze studie, een verzameling van bijna 300 dipeptides was geanalyseerd en gebruikt als referentie-samengestelde bibliotheek.
    2. Gebruik analyse (Zie Tabel van materialen) software om te openen van ruwe chromatografische bestand, en zoek voor specifieke m/z en RT gekoppeld gemeten referentie-compound (zie User Guide).
      Opmerking: Secundaire metabolieten verschillen in soorten ionisatie. Controleer de aanwezigheid van het gemeenschappelijk adducten door te zoeken naar ion massa gelijk is aan M-1.007276, M + 1.007276, M + 18.033823 en M + 22.989218 voor [M-H], [M + H], [M + NH4] en [M + nb], respectievelijk.
    3. Gebruik werkblad openen geëxporteerd "Analist" bestand verkregen na verwerking van chromatogrammen en zoek naar specifieke ion massa. Vergelijk RT van de massale functie gemeten in de experiment en RT van de referentie-compound. Toestaan van een afwijking van 0,005 Da voor m/z en 0.1 min voor RT.
  3. Om te testen de betekenis van metaboliet verrijking mede gezuiverd met bijzonder eiwit tussen monsters (lijn met overexpressie proteïne van belang vs EV controle), piekwaarden met behulp van tweezijdige niet-gepaarde t-toets gevolgd door meerdere vergelijken de correctie van de vergelijking (b.v. Benjamini & Hochberg valse ontdekking tarief correctie of Bonferroni correctie).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de oorspronkelijke studie, werden drie A. thaliana NDPK genen overexpressie in PSB-L schorsing celculturen onder de controle van de constitutieve 35S promotor14 (Figuur 1). Tandem affiniteit label was gesmolten aan weerszijden carboxy - of amino-terminal van een aas-eiwit. De affiniteit-gezuiverd complexen werden onderworpen aan MTBE/methanol/water winning16. Affiniteit-trok eiwitten en kleine moleculen werden geïdentificeerd met behulp van MS (tabellen S2 en S3).

Om te corrigeren voor valse positieven, werden blancomonsters gebruikt om het uitsluiten van kleine-molecuul verontreinigingen van de chemicaliën en Laboratorium verbruiksartikelen. Bovendien, metabolieten en eiwitten die binden aan hetzij een affiniteit tag of hars alleen waren goed voor met behulp van de EV control lijnen. Om op te halen waar positieven, tweezijdige niet-gepaarde Student t-test- en Benjamini & Hochberg valse ontdekking tarief werd correctie toegepast om metabolieten (Tabel S4) en eiwitten (Tabel S5) aanzienlijk verrijkt in de NDPKs AP te identificeren experimenten (N - en C-terminaal gelabeld NDPKs) in vergelijking met de EV control lijnen (FDR < 0.1). Merk op dat we in de vorige werk, afwezigheid/aanwezigheid criteria af te bakenen eiwitten en kleine-molecuul interactors gebruikt.

Representatieve resultaten gegeven voor NDPK1, terwijl de metaboliet gegevens focus op dipeptides, een nieuwe klasse van de regelgevers van de kleine-molecuul studeerde in onze fractie. Proteoom analyse bleek 26 putatief eiwit partners van NDPK1. Door verdere filtering voor eiwitten mede gelokaliseerd in hetzelfde subcellular compartiment als NDPK1 (cytosol), de lijst verkleinde tot 13 putatief eiwit interactors. Onder de geïdentificeerde eiwitten waren glutathione S-transferase, twee rek initiatie factoren, tubuline en aconitate hydratase. Metabolomic analyse bleek vier dipeptides Val-Leu, Ile-Glu Leu-Ile en Ile-Phe die specifiek geëlueerd samen met NDPK1 (Figuur 2). Merk op dat alle vier dipeptides een hydrofobe residu in hun N-terminus delen, suggereren gedeelde bindende specificiteit.

Op zoek naar bekende eiwit-eiwit en eiwit-metaboliet complexen we geïdentificeerd opgevraagde 13 eiwitten en vier dipeptides tegen de Stitch database25 (Figuur 3). Verscheidene opmerkingen kunnen worden gemaakt: (i) geen van de interactors voorheen werd gerapporteerd voor NDPK1. (ii) APX1 ortholog werd gemeld om te interageren met aldehyde dehydrogenase familielid ALDH7B4, terwijl de vertaling initiatie factor FBR12 met een andere vertaling initiatie factor gecodeerd door gen AT2G40290. (iii) de geïdentificeerde dipeptides hebben eiwit partners niet gemeld. Co geëlueerd dipeptides werden niet gemeld eerder als geassocieerd met alle opgehaalde plantaardige eiwitten. Echter, ze spelen een belangrijke rol in andere organismen: Leu-Ile, bijvoorbeeld, heeft een Neurotrofine-activeren effect in een menselijke cel lijn26. Merk op dat het experiment niet toelaat de exacte topologie van het systeem identificeren. Bijvoorbeeld, een dipeptide kan directe interactie met NDPK1 maar kan goed worden veroorzaakt door een van de mede gezuiverde eiwitten.

Tezamen, onze resultaten tonen aan dat de vastgestelde procedure, AP dienst samen met de Spectrometrie van de massa, vergemakkelijkt de identificatie van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine-molecuul interactors en helpt genereren uitgebreide informatie over de interactome van het target-eiwit.

figure-results-1
Figuur 1. Schema van de AP-MS werkstroom. (A) voorbereiding van een inheemse oplosbare fractie uit de cultuur van de cel van de plant. (B) volgende stappen in de procedure van de AP. Na het laden van het monster op de kolom, bindt de proteïne van belang (POI's), gesmolten tot een TAP-tag aan de IgG-antilichamen geïmmobiliseerd op de agarose parels. Wassen van de kolom vergemakkelijkt verwijdering van niet-afhankelijke eiwitten en metabolieten. Na het uitvoeren van AcTEV decollete, worden POI eiwit-metaboliet complexen geëlueerd. (C) scheiding van complexen in eiwit en metaboliet fractie gevolgd door semi-kwantitatieve analyse van MS. Deel van dit bedrag is opgenomen van Luzarowski et al. 201714. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-2
Figuur 2. Dipeptides specifiek mede eluerende met NDPK1. Gemiddelde intensiteiten van vier dipeptides Val-Leu (A), Ile-Glu (B), Leu-Ile (C)en Ile-Phe (D) gemeten in AP experiment werden uitgezet. Alle vier dipeptides aanzienlijke verrijking in NDPK1 monsters in vergelijking met EV controle weergeven (sterretjes vertegenwoordigen FDR < 0.1). Foutbalken vertegenwoordigen standaardfout voor 6 metingen (3 replicatieonderzoeken van N- en 3 C-terminaal gelabeld eiwitten). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

figure-results-3
Figuur 3. Netwerk van de interactie van alle moleculen samen met NDPK1, eluerende opgevraagd tegen STITCH database overwegen alleen vorige experimentele en database bewijzen (vertrouwen > 0.2). Hogere vertrouwen geeft hogere kans op interactie en is berekend op basis van de neergelegde gegevens. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Tabel S1. MaxQuant uitgang tabel "parameters.txt". Tabel bevat drempelwaarden voor identificatie en kwantificering, evenals informatie over de databases die worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel S2. Informatie uit MaxQuant uitgang tabel "proteinGroups.txt". Deze tabel bevat een lijst van alle groepen van de geïdentificeerde eiwit, intensiteiten en aanvullende informatie zoals het aantal unieke peptiden en score. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel S3. Output-bestand met de analyse van polar metabolieten. Tabel bevat een lijst van alle geïdentificeerde massa eigenschappen gekenmerkt door specifieke m/z, RT en intensiteit. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel S4. Dipeptides gevonden in AP monsters waarvan NDPK1, de NDPK2 of de NDPK3 werden gebruikt als aas. Dipeptides in blancomonsters aanwezig waren uitgesloten van de lijst. Twee onafhankelijke lijnen (gelabeld in beide N - of C-terminus) voor elke NDPK zijn uitgevoerd in drievoud. Student t-test en na correctie van de p-waarde met behulp van Benjamini & Hochberg methode werden gebruikt om te bepalen van aanzienlijk verrijkt gegevensstroomdiagrammen partners van NDPKs (FDR < 0.1). Gegeven is ΔRT berekend op basis van de referentiestoffen en Δppm met betrekking tot de exacte massa gegeven in Metlin27. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Tabel S5. Eiwitten gezuiverd samen met NDPK1. Twee onafhankelijke lijnen (gelabeld in beide N - of C-terminus) voor elke NDPK zijn uitgevoerd in drievoud. Student t-test en na correctie van de p-waarde met behulp van Benjamini & Hochberg methode werden gebruikt om te bepalen van aanzienlijk verrijkt gegevensstroomdiagrammen partners van NDPKs (FDR < 0.1). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De gepresenteerde protocol kunnen parallelle identificatie van PP en PM complexen van een doel-eiwit. Van klonen te eindresultaten, kan het experiment worden afgerond in minder dan 8-12 weken. Volledige AP duurt ongeveer 4-6 h voor een set van 12 tot en met 24 monsters, waardoor ons protocol geschikt voor mid doorvoer analyse.

Het protocol, ondanks het feit dat over het algemeen eenvoudig, heeft een aantal kritische stappen. (i) voldoende hoeveelheid input eiwitten en affiniteit kralen is cruciaal voor het bereiken van een dynamisch scala aan metaboliet detectie. Efficiënte cellysis is daarom een essentiële stap in de procedure. Slechte eiwit opbrengsten kunnen een gevolg zijn van onvoldoende verpulvering van het materiaal of van de verhouding tussen suboptimaal lysis-buffer/materiaal. (ii) moet worden gezorgd dat gebruikte reagentia MS-vriendelijk zijn. Agressieve schoonmaakmiddelen, glycerol, of grote hoeveelheden zout moeten worden vermeden als zij met MS detectie interfereren. (iii) Agarose kralen mag niet overdreven gedroogde tijdens het wassen stappen, en bij het gebruik van een vacuüm variëteit is het belangrijk een langzame stroming tarief zo niet te vernietigen de kralen of complexe stabiliteit beïnvloeden toe te passen.

Er zijn enkele belangrijke eventuele wijzigingen in het gepresenteerde protocol: (i) We de constitutieve promotor van de CaMV35S gebruiken om de hoeveelheid aas eiwit te maximaliseren. Overexpressie, kan terwijl zeer nuttig, ernstige gevolgen hebben voor cel homeostase28 en leiden tot de vorming van fysiologisch irrelevant interacties. Expressie van tagged eiwitten met behulp van inheemse initiatiefnemers en waar mogelijk op de achtergrond van een verlies-van-functie wordt beschouwd als superieur voor ophalen waar biologische interactors. Voor de eiwitten die normaal niet uitgedrukt in celculturen plant, kan een plant achtergrond noodzakelijk blijken om te identificeren van relevante interactors. (ii) bij het werken met membraaneiwitten, moet de lysis-buffermengsel worden aangevuld met een MS-compatibele wasmiddel. (iii) invoering van een tweede affiniteit-zuivering kan verbeteren van vals-positieven te waar-positieven verhouding en elimineren de noodzaak voor EV besturingselementen29. Een nieuwe tandem-tag met twee onafhankelijke protease-decollete sites presenteert een aantrekkelijk alternatief voor de grootte-uitsluiting chromatografie-stap toegevoegd door Maeda et al. 201411, die zowel moeizaam en tijdrovend is.

Het grootste nadeel van de AP is de hoge mate van valse positieven. De redenen zijn talrijk. Constitutieve overexpressie werd reeds genoemd. Een andere bron van fysiologisch irrelevant interacties, is tenzij werkt met geïsoleerde organellen, voorbereiding van geheel-cel lysates met mengsels van eiwitten en metabolieten van verschillende subcellular compartimenten. Subcellular Localisatie moet worden gebruikt om te filteren op ware interactors. Niettemin is de meerderheid van de valse positieven leiden tot van aspecifieke binding tussen eiwitten en agarose harsen. Introductie van een tweede zuivering, zoals hierboven beschreven, biedt de beste oplossing voor het probleem, maar gaat ten koste van tijd en doorvoer. Bovendien kan zwakkere interactie worden verloren als het protocol verlengt. Een andere valkuil van AP is dat ondanks de uitgebreide informatie over de interactome voor een doel-eiwit, onderscheid tussen directe en indirecte doelstellingen van het aas-eiwit is het onmogelijk. Gerichte bimolecular benaderingen zijn nodig om te bevestigen van interacties.

AP in combinatie met MS gebaseerde metabolomica werd gebruikt bij het bestuderen van eiwitcomplexen in S. cerevisiae12. Dit werk, samen met onze eerdere observatie13 dat ook lipiden, polar en semi-polaire verbindingen gebonden aan eiwitcomplexen afgezonderd van cellulaire lysates blijven, voorziet het voorgestelde protocol conceptuele basis. Ons protocol wordt gekenmerkt door drie unieke punten: (i) In tegenstelling tot de gist werken12, het toont aan dat AP is geschikt voor het ophalen van niet alleen hydrofobe maar ook hydrofiele proteïne liganden. (ii) door de invoering van een drie-in-één extractie-protocol, kan een enkele AP te bestuderen van eiwitten en metaboliet interactors van het aas-eiwit worden gebruikt. (iii) wij het protocol plantenziekterisico cellen aangepast.

Toekomstige inspanningen zal zich richten op het creëren van een nieuwe tandem-tag met twee onafhankelijke protease-decollete sites. Wij zouden ook graag verkennen van geschiktheid van het protocol voor lage-overvloed kleine molecules zoals plantenhormonen.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen vriendelijk erkennen Prof. Dr. Lothar Willmitzer voor zijn betrokkenheid bij het project, productieve discussies en grote toezicht. Wij zijn dankbaar aan Dr Daniel Veyel voor het helpen met proteomic MS metingen. Wij waarderen Mrs. Änne Michaelis die ons onschatbare technische hulp met LC-MS-metingen. Bovendien wil wij Dr. Monika Kosmacz en Dr. Ewelina Sokołowska bedanken voor hun hulp en hun betrokkenheid bij het werk op het originele manuscript en tot Weronika Jasińska voor technische ondersteuning.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organicsSigma-AldrichM6899
1-Naphthylacetic acidSigma-AldrichN1641
Kinetin solutionSigma-AldrichK3253
Tris baseSigma-Aldrich10708976001
NaClSigma-AldrichS7653
MgCl2Carl Roth2189.1
EDTASigma-Aldrich3609
NaFSigma-AldrichS6776
DTTSigma-AldrichD0632
PMSFSigma-AldrichP7626
E-64 protease inhibitorSigma-AldrichE3132
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichP9599
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
AcTEV ProteaseThermo Fischer Scientific12575015
Rotiphorese Gel 30 (37,5:1)Carl Roth3029.2
TEMEDCarl Roth2367.3
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fischer Scientific26616
SBP Tag Antibody (SB19-C4)Santa Cruz Biotechnologysc-101595
Goat anti-mouse IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Bradford ReagentSigma-AldrichB6916
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec GradePromega V5071
UreaSigma-AldrichU5128
ThioureaSigma-AldrichT8656
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
IodoacetamideSigma-AldrichI1149
MTBE Biosolve138906
Methanol Biosolve136806
WaterBiosolve232106
AcetonitrileBiosolve12006
Trifluoroacetic acid Biosolve202341
Formic acid Biosolve69141
Unimax 2010 Platform ShakerHeidolph5421002000
Nylon Mesh (Wire diameter 34 µM, thickness 55 µM, open area 14%)ProsepaCustom order
Glass Funnel, 47 mm, 300 mlRestekKT953751-0000
Filter Bottle Top 500 mL 0,2 µM Pes StVWR International GmbH514-0340
Mixer Mill MM 400Retsch GmbH207450001
IgG Sepharose 6 Fast FlowGE Healthcare Life Sciences17-0969-02
Mobicol ""Classic"" with 2 different screw caps without filtersMoBiTec GmbHM1002
Filter (small) 35 µM pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 & M1053MoBiTec GmbHM513515
Variable Speed Tube Rotator SB 3Carl RothY550.1
Rotary dishes for rotators SB 3Carl RothY555.1
Resprep 24-Port SPE ManifoldsRestek 26080
Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1mlTeknokromaTR-F034000
Autosampler VialsKlaus Trott Chromatographie-Zubehör40 11 01 740
Acclaim PepMap 100 C18 LC ColumnThermo Fischer Scientific164534
EASY-nLC 1000 Liquid ChromatographThermo Fischer ScientificLC120
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fischer ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
Acquity UPLC system Waters Custom order
ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 µM, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkgWaters 186003533
High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutionsBandelinRK 31
Genedata ExpressionistGenedataNaN
Xcalibur SoftwareThermo Fischer ScientificNaN
MaxQuantNaNNaN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, X., Snyder, M. Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation. Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).
  2. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).
  3. Schlattner, U., et al. Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).
  4. Ramírez, M. B., et al. GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2. Human Molecular Genetics. , ddx161(2017).
  5. Jung, H. J., Kwon, H. J. Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery. Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).
  6. Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase. Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).
  7. Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).
  8. Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae. Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).
  9. Pantoliano, M. W., et al. High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).
  10. Li, X., Snyder, M. Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses. Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).
  11. Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -C. A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids. Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).
  12. Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses. Cell. 143 (4), 639-650 (2010).
  13. Veyel, D., et al. System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants. Scientific Reports. 7, (2017).
  14. Luzarowski, M., et al. Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases. Journal of Experimental Botany. , (2017).
  15. Van Leene, J., et al. Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana. Molecular systems biology. 6 (1), 397(2010).
  16. Giavalisco, P., et al. Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry. The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).
  17. Van Leene, J., et al. Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).
  18. Van Leene, J., et al. A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana. Molecular & Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).
  19. Olsen, J. V., Ong, S. -E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Molecular & Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).
  20. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  21. Cox, J., et al. Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  22. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301(2016).
  23. Hooper, C. M., et al. SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome. Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).
  24. Katajamaa, M., Orešič, M. Data processing for mass spectrometry-based metabolomics. Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).
  25. Szklarczyk, D., et al. STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data. Nucleic Acids Research. 1277, (2015).
  26. Tanaka, K. -i, et al. Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells. Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).
  27. Smith, C. A., et al. METLIN: A metabolite mass spectral database. Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).
  28. Bhattacharyya, S., et al. Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity. Elife. 5, (2016).
  29. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionsProtein Metabolite InteractionsAffinity PurificationMass SpectrometryOne Step ExtractionArabidopsis Cell CultureUPLC MS AnalysisMTBE Methanol WaterIgG Sepharose BeadsTransgenic Bait Protein

Related Articles