Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

Samenvatting

Tijdige en efficiënte reperfusie van de afgesloten kransslagader is de beste strategie voor het verkleinen van het myocard infarct bij patiënten met een ST-segment verheven myocardiaal infarct. Echter kan reperfusie per se resulteren in verdere cardiomyocyte dood, een fenomeen dat bekend staat als reperfusie letsel. De opening van de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), met een daling van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) of een mitochondriale depolarisatie, is algemeen erkend als de laatste stap van reperfusie letsel en is verantwoordelijk voor mitochondriale en dood van de cardiomyocyte. JC-1 is een lipofiele kationogene kleurstof dat zich in de mitochondriën afhankelijk van de waarde van MMP ophoopt. Hoe hoger de MMP is, hoe meer JC-1 hoopt zich op in de mitochondriën. De stijgende hoeveelheden voor JC-1 in de mitochondriën kunnen worden weergegeven door een verschuiving van de emissie fluorescentie van groen (~ 530 nm) tot rood (~ 590 nm). Dus, de vermindering van de fluorescentie van de rood/groen intensiteit verhouding kunt aangeven de depolarisatie van de mitochondriën. Hier, nemen wij voordeel van JC-1 voor het meten van MMP, of de opening van mPTP in menselijke cardiale myocytes na hypoxia/heroxygenatie, ontdekt door stroom cytometry.

Inleiding

Coronaire hartziekte is de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd. De behandeling van keuze is voor vermindering van ischemische schade en de beperking van de grootte van het infarct in patiënten met ST-segment myocardiaal infarct verheven tijdige en effectieve myocardiale reperfusie via primaire percutane coronaire interventie (PCI)^{1, 2}. Reperfusie veroorzaakt echter bijkomende schade, die kan goed zijn voor maximaal 30% van het laatste infarct grootte³. Het is algemeen erkend dat de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP) niet alleen centraal in mitochondriale schade en cel dood tijdens ischemie/reperfusie is (Ik / R), maar is ook een convergerende doel van bescherming signalering^{4 , 5}. als de mPTP-opening over depolarisatie van de innerlijke mitochondriale membraan potentiële (MMP)^{4 brengen zou}, we ontdekt mPTP openen met behulp van de 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) assay.

De bepaling van de JC-1 is een cytofluorimetric methode die zowel kwalitatief als kwantitatief, en het verder is gevalideerd door het analyseren van de MMP op het niveau van een enkele mitochondriën⁶. JC-1 bestaat als een geaggregeerde vorm, de opbrengst van een rood tot oranje gekleurde emissie (590 ± 17,5 nm) in de matrix van mitochondriën met normale MMP; met het verlies van MMP, wordt JC-1 geconverteerd naar de monomere vorm die groene fluorescentie met een uitstoot van 530 ± 15 nm levert. Dus een daling in de verhouding rood/groen fluorescentie intensiteit kan duiden op de verlaging van MMP in omstandigheden zoals ischemie/reperfusie (Ik / R).

Naast JC-1, is MMP ook bestudeerd met membraan-permeabele lipofiele kationen zoals Rhodamine 123 en 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine jodide [DiOC6(3)]. Echter, vergeleken met deze twee sondes, JC-1 is meer betrouwbaar voor het analyseren van MMP. Rhodamine 123 heeft relatief arme gevoeligheid (vooral in het blussen van mode^7,8) en slechte specificiteit. De verschuiving in rhodamine 123 is soms zo klein dat het is moeilijk voor onderzoekers of apparatuur om te observeren/detecteren. Bovendien, in een enkele cel, er zijn verschillende mitochondrion bandplaatsen voor rhodamine 123 en dus dat het verschillende fluorescentie emissies⁹kan hebben. DiOC6(3) wordt niet aanbevolen voor het opsporen van MMP hetzij als het gevoelig op de depolarisatie van plasmamembraan^{10 reageert}.

Daarom hier gebruiken we de JC-1-test om te beoordelen de MMP van HCMs na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

Protocol

1. bereiding van reagentia en oplossingen

1. Bereiden menselijk cardiale myocytes (HCMs) volledige medium door 25 mL van Myocyte groeimedium supplement mix toe te voegen aan 500 mL Myocyte groeimedium volgens de instructies van de fabrikant. Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.
2. Bereid Tongxinluo (TXL)-oplossing door het oplossen van TXL ultrafijn poeder in/glucose serumvrij Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en de concentratie van TXL tot 400 µg/mL aanpassen door het toevoegen van DMEM (voor meer details, Zie¹¹). Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.
3. Bereiden 5 mL van de werkoplossing JC-1 door toevoeging van 25 µL van JC-1 stockoplossing (200 x), ultrazuiver water 4 mL en 1 mL voorraad kleuring buffer (5 x) in een centrifugebuis 15 mL in het donker. Pipetteer van het mengsel op en neer meerdere malen en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.
4. 30 mL kleuring buffer te werken door 24 mL ultrazuiver water toe te voegen aan 6 mL voorraad kleuring buffer (5 x) in een centrifugebuis 50 mL voor te bereiden. Gebruik deze ijskoude oplossing.

2. deinvoeringvan Hypoxia/heroxygenatie Model

1. Plaat 1.0 x 10⁵ cellen per putje met HCM compleet medium in een 6 goed bord. Groeien tot een confluentie van ongeveer 70% in een incubator van de cel met 5% CO₂ en 95% lucht bij 37 ° C.
2. Wassen HCMs met fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). Hen bloot te stellen aan verschillende behandelingen (400 µg/mL TXL of niet) in 2 mL zuiver/glucose serumvrij DMEM gedurende 30 minuten voorafgaand aan hypoxie in een incubator van de cel met 5% CO₂ en 95% lucht bij 37 ° C.
3. Incubeer HCMs in een luchtdicht en hypoxische pot (2,5 L) voorzien van een katalysator voor het opruimen van vrije zuurstof en induceren hypoxie voor 18u (figuur 1A), en een anaërobe indicator om te meten de zuurstof-spanning in de middelgrote^11,-^{12, 13}, in een cel incubator met 5% CO₂ en 95% lucht bij 37 ° C.
   Opmerking: Het duurt ongeveer 1,5 uur voor de katalysator voor het opruimen van vrije zuurstof in de pot. Daarom worden de HCMs bewaard in de pot voor 19.5 h voordat de pot wordt geopend. De kleur van anaërobe indicator verandert van lichtblauw in normoxic omgeving bleke wit in hypoxische voorwaarde (figuur 1B).
4. Reoxygenate HCMs door het bewegen van de 6 goed plaat in een incubator ingesteld bij 37 ° C met 5% CO₂ en 95% lucht voor 2 h.

3. bereiding van HCMs Stroom Cytometry

1. Warm de 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing en PBS tot 37 ° C.
2. Gecombineerd medium uit elk putje, spoel de cellen met 1 mL PBS en Voeg 0,5 mL van 0,25% trypsine langs de muur van de waterput.
3. Incubeer bij 37 ° C, totdat alle HCMs bijna vrijstaand (ongeveer 1 minuut zijn).
4. Voeg 1 mL van DMEM compleet medium (DMEM gemiddeld met 10% foetale runderserum) om de putten te neutraliseren de trypsine. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL- and -pellet HCMs door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
5. Zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.
6. Voeg 0,5 mL van HCM compleet medium en 0,5 mL van de werkoplossing JC-1 aan elke buis. Resuspendeer de HCMs door pipetteren omhoog en omlaag.
7. Betrekking hebben op de hele buizen met aluminiumfolie om te voorkomen dat bleken van de TL-indicator en incubeer HCMs in normale omstandigheden (bij 37 ° C met 5% CO₂ en 95% lucht) gedurende 20 min.
8. Pellet HCMs door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.
9. Spoel HCMs tweemaal met 2 mL ijskoud JC-1 kleuring buffer.
10. Resuspendeer HCMs in een eindvolume van 300 µL van ijskoude kleuring buffer in het monsterbuisje (12 mm x 75 mm) en de cellen gebruiken voor de analyse binnen 30 min.
    Opmerking: Gebruik carbonyl cyanide m-chlorofenyl hydrazon (CCCP), een krachtige remmer van respiratoire elektronentransport keten, voor de behandeling van HCMs gedurende 1 uur bij een concentratie van 20 µM, voor de positieve controle.

4. flow Cytometer Setup

1. Start de stroom cytometer en zorg ervoor dat de software is verbonden met het.
2. Fluidics opstarten, start de stream en instellen van de breakoff.
3. Geopende vensters door twee dot-perceel in de stroom cytometry software.
   1. Selecteer voorwaartse verstrooid licht (FSC) op de X-as en kant verstrooid licht (SSC) op de Y-as in de eerste stip plot te vertegenwoordigen de kenmerken van de cellen in termen van hun omvang en hun granulariteit, respectievelijk.
   2. Kies de PE (575 ± 26 nm) detectie zender voor de Y-as en de FITC (530 ± 30 nm) voor de X-as een logaritmische schaal met het tweede punt perceel, die wordt gebruikt voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van JC-1 kleurstof in de cellen.

5. Stroom Cytometry meting en analyse van gegevens

1. Klik op Laden ongedaan maken om te laten uit de buis steun arm en plaats de lege (HCMs die niet hebben zijn geverfd met JC-1) buis op het monster. Klik op Load om terug te keren van de slingerarm buis naar de positie van haar werken.
2. Klik op Record om de deeltjes van de suspensie in het lege monsterbuisje verzamelen en vervolgens de celpopulatie (P1) poort voor verdere analyse in de eerste stip plot (Figuur 3).
3. HCMs in andere buizen monster te verzamelen en optimaliseren van de meting door de spanningen van fluorescentie kanalen, om ervoor te zorgen dat de cel stip is gelegen in het centrale gedeelte van de tweede tekening van de dot aan te passen.
4. De statistieken van elk monsterbuisje weergeven en berekenen de MMP van elk monster door te delen van de verhouding tussen de intensiteit van de rode fluorescentie door groene fluorescentie intensiteit.

Resultaten

Voordat u de JC-1 bepaling ter evaluatie van de veranderingen van MMP uitvoert, is het sterk aanbevolen dat proeven worden verricht om te bevestigen met succes de voorwaarden vastgesteld door de onderzoekers. Zoals blijkt uit de stroom cytometry resultaten (Figuur 2), in vergelijking met de normale groep, hypoxie/heroxygenatie (H/R) aanzienlijk geïnduceerde de apoptosis van HCMs (Annexine V + /PI±), die aangeeft dat wij een cel-gebaseerde model van I had geve...

Discussie

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de MMP van cellen na wordt blootgesteld aan H/R. gedetecteerd door JC-1 test, de MMP van cellen is niet afhankelijk van factoren zoals de mitochondriale grootte, vorm en dichtheid die invloed op één-component fluorescentie hebben kan ¹⁴-signalen. Bijgevolg zijn de resultaten van JC-1 assay relatief betrouwbaar. Bovendien, het is handig en tijdbesparend voor het uitvoeren van de bepaling van de JC-1. Deze bepalin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1	Beyodtime, China	C2006	In de kit zijn er JC-1 stockoplossing (200×), stock kleuringsbuffer (5×) en CCCP(10mM)
Tongxinluo ultrafijn poeder	Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China	071201
Annexin V-FITC/PI Kit	Becton-Dickinson, USA	556547
DMEM	Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA	11966-025
Menselijke hartmyocyt	Promocell, Duitsland	C-12810
Myocyt Groei Medium (SupplementMix)	Promocell, Duitsland	C-39275
Myocyt Groei Medium (Klaar-voor-gebruik)	Promocell, Duitsland	C-22070	gebruikt met Myocyt Groei Medium SupplementMix
GENbox	BioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrijk	96127	2.5L
Katalysator (AnaeroPack)	MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. , Japan	C-1
Anaërobe indicator	BioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrijk	96118
Flow cytometer	Becton-Dickinson, USA	FACSAria 2
BD FACSDiva Software	Becton-Dickinson, USA		Versie8.0.1
Sample tube	Corning science, USA	352054	12*75mm
PBS	Hyclone, USA	SH30256.01