Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

Yasmine Smail; Chunhui Sun; Laurent Combettes; Guy Tran Van Nhieu

doi:10.3791/57728

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Imaging Ca^{2 +} reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

5.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/57728

⸱

24 mei 2018

Yasmine Smail¹^,²^,³^,⁴ , Chunhui Sun¹^,²^,³^,⁴ , Laurent Combettes⁵ , Guy Tran Van Nhieu¹^,²^,³^,⁴

¹Equipe Communication Intercellulaire et Infections Microbiennes, Centre de Recherche Interdisciplinaire en Biologie (CIRB), Collège de France, ²Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm), U1050, ³Centre Nationale de la Recherche Scientifique (CNRS), UMR7241, ⁴MEMOLIFE Laboratory of Excellence and Paris Sciences et Lettres, ⁵Inserm, UMRS1174, Université Paris Sud

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we protocollen om te visualiseren calcium (Ca^{2 +}) Reacties ontlokte door HeLa cellen besmet door Shigella. Door het optimaliseren van de parameters van een bacteriële infectie en imaging met Ca^{2 +} fluorescerende sondes, worden atypische globale en lokale Ca^{2 +} signalen veroorzaakt door bacteriën over een groot bereik van de kinetiek van de infectie gekenmerkt.

Samenvatting

CA^{2 +} is een alomtegenwoordige ion bij alle bekende cellulaire processen betrokken zijn. Terwijl de globale Ca^{2 +} reacties kunnen invloed hebben op het lot van de cel, reguleren lokale variaties in gratis Ca^{2 +} cytosolische concentraties, gekoppeld aan het bevrijden van interne winkels of een toestroom via plasmamembraan kanalen, corticale cel processen. Ziekteverwekkers die voldoen aan anders binnenvallen gastheer cellen trigger een reorganisatie van het cytoskelet van de actine ten grondslag liggen aan de host plasmamembraan, die waarschijnlijk van invloed op zowel lokale als globale Ca^{2 +} signalering. Omdat deze gebeurtenissen bij lage frequenties in een pseudo-stochastische wijze over uitgebreide kinetiek voordoen, verhoogt de analyse van Ca^{2 +} signalen veroorzaakt door pathogenen grote technische uitdagingen die moeten worden aangepakt.

Wij rapporteren hier protocollen voor de detectie van globale en lokale Ca^{2 +} signalen op een Shigella besmetting van epitheliale cellen. In deze protocollen, artefacten gekoppeld aan een langdurige blootstelling en photodamage geassocieerd met de excitatie van Ca^{2 +} fluorescerende sondes zijn daarvoor door strikt de overname parameters controle over bepaalde perioden tijdens een Shigella invasie. Procedures om te analyseren rigoureus de amplitude en frequentie van globale cytosolische Ca^{2 +} signalen tijdens uitgebreide infectie kinetiek met behulp van de chemische sonde Fluo-4 ten uitvoer worden gelegd.

Inleiding

CA^{2 +} regelt alle bekende cel procédés, met inbegrip van cel dood trajecten aan gastheer-pathogeen interacties¹^,²^,³gerelateerde cytoskeletal reorganisatie en inflammatoire reacties. Onder fysiologische omstandigheden, basale cytosolische Ca^{2 +} concentraties zijn laag, in de honderden nM-bereik, maar kunnen worden onderworpen aan tijdelijke verhogingen op agonist stimulatie. Deze variaties tonen vaak oscillerende gedrag door het optreden van pompen en kanalen in het plasma en endoplasmatisch reticulum membranen. Het patroon van deze oscillaties wordt gekenmerkt door de periode, duur en amplitude van Ca^{2 +} toeneemt, en wordt gedecodeerd door cellen die, op zijn beurt leiden specifieke reacties tot in wat bekend als de Ca^{2 +} code⁴^,^{5 staat}. Een aanhoudende stijging van de cytosolische Ca^{2 +} concentratie onder pathologische omstandigheden kan leiden tot de dood van de cel die is gekoppeld aan de permeabilization van de mitochondriale membraan en de vrijlating van de pro-apoptotic of necrotische factoren⁶^, ⁷.

Shigella, de verwekker van bacillaire dysenterie, binnenvalt epitheliale cellen door het injecteren van effectoren in cellen van de gastheer met een type III secretie systeem (T3SS)⁸^,⁹. Een Shigella -invasie van cellen van de gastheer wordt geassocieerd met lokaal en mondiaal Ca^{2 +} signalen ontlokte door de T3SS. Wat betreft de porie-vormende toxinen, de T3SS translocon dat wordt ingevoegd in de celmembranen van de gastheer en is vereist voor de injectie van T3SS effectoren waarschijnlijk is verantwoordelijk voor de activering van PLC en de inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-afhankelijke Ca^{2 +} release. De combinatie van de gelokaliseerde PLC stimulatie en de accumulatie van gepolymeriseerde actine bij plaatsen van een Shigella invasie resultaat in een opslagruimte langdurige InsP3-afhankelijke Ca^{2 +} release¹⁰. Het type III effector IpgD, een fosfatidyl 4,5 difosfaat (PIP2) -4-fosfatase, beperkt de lokale hoeveelheid PIP2, waardoor de controle van de hoeveelheid beschikbaar materiaal voor PLC voor het genereren van InsP3, die aan de opsluiting van lokale Ca^{2 bijdraagt +} Reacties op¹¹^,¹²van de sites van de bacteriële invasie. Deze lokale Ca^{2 +} reacties waarschijnlijk bijdragen tot de actine polymerisatie op Shigella invasie sites¹⁰. Global Ca^{2 +} antwoorden die ook door Shigella, echter ontlokte zijn zijn overbodig voor de invasie van bacteriën proces maar leiden tot de opening van connexin hemichannels op het plasma-membraan en de vrijlating van ATP in de extracellulaire compartiment. Vrijgegeven ATP handelen op een wijze van paracrine, op zijn beurt, stimuleert Ca^{2 +} oscillerende reacties in de cellen naast de geïnfecteerde cel. IpgD is ook verantwoordelijk voor het vormgeven van globale Ca^{2 +} reacties in grillige geïsoleerde reacties met langzame dynamiek. Uiteindelijk, na een langdurige bacteriële infectie leidt IpgD tot de remming van InsP3-gemedieerde Ca^{2 +} signalen. Via haar bemoeienis met Ca^{2 +} signalering, IpgD vertragingen een Ca^{2 +}-afhankelijke calpain activering leidt tot de demontage van focal hechting structuren en de voortijdige detachement van geïnfecteerde cellen¹³.

Terwijl Ca^{2 +} signalen bij kritieke aspecten van pathogenese betrokken zijn, verhoogt het gebruik van een micro-organisme een aantal technische uitdagingen die niet in klassieke agonist studies voordoen zich. De protocollen beschreven hier gebruik maken van de gebruikte TL Ca^{2 +} chemische indicator Fluo-4 die we ontworpen om te karakteriseren van lokale Ca^{2 +} signalen tijdens een Shigella -infectie. Stappen van cruciaal belang voor het opsporen van deze signalen worden besproken, evenals procedures voor hun kwantitatieve analyse die vereist is voor het karakteriseren van de rol van bacteriële effectoren in Ca^{2 +} signalering geïmplementeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. voorbereiding

Voorbereiding van de bacteriën
1. Plaat van de bacteriën —Shigella wild-type stam uiting geven aan de AfaE adhesine (M90T-AfaE) — op een trypticase (TCS) soja agar plaat met 0,01% Congo rood (CR) en hen Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C.
  Opmerking: Het vergroten van hun reproduceerbaarheid, de Shigella platen verkregen in stap 1.1.1 bij 4 ° C worden opgeslagen en moeten worden gebruikt binnen een week, omdat alle kolonies op de drager van de CR uiteindelijk rood zal na verloop van tijd.
2. Inoculeer TCS Bouillon pre cultuur door het plukken van 3 rode koloniën aan de streep platen.
  Opmerking: Een inenting met 3 kolonies uitgevoerd om het beperken van de kans van het kiezen van een enkele kloon waarvan virulentie plasmide heeft ondergaan een genetische recombinatie.
3. Groeien vloeibare bacteriele kweken in een schudden incubator voor 16 h bij 37 ° C bij 200 omwentelingen per minuut. Ampicilline toevoegen om een eindconcentratie van 75 mg/mL. Antibiotica concentraties moeten niet meer bedragen dan 3 x de minimale remmende concentratie, omdat een overmaat aan antibioticum tot het verlies van de plasmide van grote virulentie leiden kan.
  Opmerking: De handhaving van de Shigella virulentie plasmide moet worden geverifieerd door de bacteriële culturen op CR platen aangevuld met de juiste antibiotica concentratie plating. De aanwezigheid van witte kolonies geeft plasmide verlies.
4. Beënt de TCS cultuur met de pre bacteriecultuur bij een verdunning 1:100. Na het bebroeden bij 37 ° C in een schudden incubator voor 2 h bij 200 omwentelingen per minuut. Zorgen dat de optische dichtheid bij 600 nm (OD_600nm) is 0,2 - 0,4.
5. Centrifugeer de bacteriecultuur voor 2 min bij 13.000 x g bij 21 ° C en resuspendeer de pellet in een equivalent volume EM medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM glucose en 25 mM HEPES pH = 7.3).
6. Verdun de bacteriële suspensie in de buffer van een EM op een definitieve OD_600nm 0.1 en gebruik het onmiddellijk of opslaan bij 21 ° C en het binnen de volgende 60 min.
Voorbereiding van de cel
1. Cultuur HeLa cellen in DMEM met 1 g/L van glucose aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en ze groeien bij 37 ° C met 10% CO₂. TC-7 gegroeid in DMEM met 4,5 g/L van glucose, met 10% FCS en niet-essentiële aminozuren in een incubator van de 37 ° C met 10% CO₂groeien.
2. Voor de cel onderhoud, splits de cellen regelmatig om te voorkomen dat een remming van de groei-contact gekoppeld aan confluente Staten; Dit is essentieel voor een Ca^{2 +} sonde laden/transfectie hoogrenderende.
3. Plaat HeLa cellen op steriele 25-mm diameter circulaire coverslips in 6-Wells-platen bij een dichtheid van 3 x 10⁵ cellen/put de dag voordat het experiment voor de HeLa cellen.
4. Voor TC-7 cellen, trypsinize en cellen tellen. Zaad hen bij 4 x 10⁵ cellen/well en broeden ze 5-7 dagen bij 37 ° C in een 10% CO₂-incubator voor de experimenten te voorzien van een polarisatie.
  1. Vernieuw het kweekmedium cel elke dag tot de dag van het experiment.
    Opmerking: Glazen-bodem 35-mm diameter wegwerp kamers kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor de coverslips-bevattende putten. Als de laatste zijn gebruikt, temperatuurregeling door een verwarmde fase of doel niet voldoende is, en een thermostaat incubatie kamer gemonteerd op is het stadium van de Microscoop vereist.
De dag van het experiment, verwijder het medium en wassen van de cellen 3 x met 1 mL EM medium bij 21 ° C.
Laden van de cellen met 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ in een buffer EM gedurende 30 minuten bij 21 ° C.
Opmerking: Terwijl het laden van sub confluente HeLa cellen er geen grote problemen, het laden van gepolariseerde TC-7 cellen is vaak heterogene en slecht efficiënt. Voor deze cellen, vonden we dat het rendement van het laden wordt versterkt door de toevoeging van de verspreiden agent — pluronic zuur — op een eindconcentratie van 0,1% en het anion-transporter remmer bromosulfophtalein op een eindconcentratie van 20 µM naar de Fluo-4-AM-bevattende EM. Het gebruik van ratiometric chemische sondes of genetisch gecodeerd-FRET sondes die dual-overname niet compatibel met de snelheid van verwerving nodig is voor de beeldvorming van lokale Ca^{2 +}reacties is.
Wassen van de monsters 3 x met EM buffer en verder broeden ze in 1 mL EM buffer bij 21 ° C te voorzien in de hydrolyse van de AM-groep. Gebruik Fluo-4 geladen cellen onmiddellijk of binnen de komende 90 min (behouden bij 21 ° C).

2. infectie en beeldacquisitie van lokale Ca^{2 +} antwoorden

Plaats het dekglaasje aan met de Fluo-4 geladen cellen in een imaging kamer of een glazen-bodem cupje. Wassen van de monsters in de beeldvorming zaal of wegwerp glazen-bodem kamer 3 x met EM buffer om verbindingen mogelijk als gevolg van lysis van de cel. Voeg vervolgens 1 mL van EM buffer.
Plaats van de kamer in een omgekeerde fluorescentie Microscoop werkgebied verhit tot 33 ° C.
Opmerking: Deze temperatuur is geselecteerd als een compromis tussen de optimale temperaturen die compatibel is met het proces van Shigella invasie en de vertraging van Ca^{2 +} reacties te visualiseren van lokale reacties. We gebruiken een 63 X onderdompeling olie doelstelling (NB = 1,25) uitgerust met fase contrast ringen.
Selecteer een veld microscopie en overname parameters, met inbegrip van de blootstellingstijd en weggooien indien nodig te optimaliseren de Fluo-4 TL signaal instellen.
Opmerking: De belangrijkste uitdagingen voor lokale Ca^{2 +} imaging zijn de lage amplitude en de kleine duur van de reacties, waarvoor overname ten minste elke 30 ms. verschillende verkrijgbare achterzijde verlicht EM-CCD of C-Mnd camera's presenteren de vereiste gevoeligheid te detecteren lokale Ca^{2 +} reacties met Fluo-4. Detectie gevoeligheid is ook een belangrijk aandachtspunt te beperken photodamage of artefacten zoals spontane reacties gekoppeld aan de fluorescerende excitatie van Fluo-4 op een hoge frequentie. Hier, een LED-gebaseerde verlichting van 470 nm, met een 480 ± 40 nm band pass excitatie filter, een 505-nm dichroïde filter en een 527 ± 30 nm band pass emissie gebruikt op 5% van de maximale intensiteit gecombineerd met een 1.0 neutrale-opaciteitsfilter werden gebruikt om deze problemen te minimaliseren onder een stroom van verwervingen van beperkte duur. Een analyse van lokale Ca^{2 +} signalen door partijen van 120 s streams werd routinematig uitgevoerd. Onder deze omstandigheden laag verlichting werd fluorophore photobleaching niet waargenomen tijdens de 2 min-stream acquisities. Opeenvolgende overnames op hetzelfde monster kunnen worden uitgevoerd, mits de andere velden worden gebruikt. Als algemene regel, wordt een eerste acquisitie-stream uitgevoerd op een veld van het besturingselement in de afwezigheid van bacteriën stimulatie om ervoor te zorgen het ontbreken van spontane reacties. Als spontane reacties worden waargenomen, worden de monsters gewassen met EM buffer totdat geen reacties worden waargenomen.
Te voegen bacteriën aan het monster, 500 µL van EM buffer verwijderen uit de zaal en voeg 500 µL van de bacteriële suspensie in stap 1.1.6 willen verkrijgen van een definitieve OD_600nm van 0.05, met de juiste zorg om te voorkomen dat het verplaatsen van het veld geselecteerde microscopie; de volumes zorgen voor een goede menging van de bacteriën en een homogene verdeling van de bacteriën op de celsteekproeven.
Het uitvoeren van een overname op de bacteriële toevoeging. U kunt ook uitvoeren een overname 10 min na de bacteriële toevoeging, die correspondeert met de tijd die nodig is voor bacteriën om sediment op cellen onder de voorwaarden gebruikt. Aan het einde van de stream van de verwerving, door een fase contrast-beeld van het geselecteerde veld naar het visualiseren van de bacteriën die contact met de cellen en het membraan ruches gekoppeld van de sites van de bacteriële invasie te verwerven.
Herhaal de overname procedure zoals in stap 2.5, met tussenpozen die zich lenen voor de duur van de afbeelding acquisities, de besparingen van de bestanden en de selectie van een nieuw veld ter dekking van het hele proces.
Opmerking: Voor Shigellavonden we dat verwerving stromen elke 5 min voor 20 min, na de 10 min bacteriële sedimentatie, toegestaan ter dekking van de meerderheid van de gebeurtenissen van de invasie.
Toevoegen aan het einde van de aankoop procedure, een eindconcentratie van 2 µM van de Ca^{2 +} ionophore ionomycin monsters om te bepalen van de maximale amplitude van de Ca^{2 +} signalen. Verwerven van beelden elke 3-5 s tot signaal stabilisatie, meestal voor minder dan 10 min.
Volg door toevoeging van Ca^{2 +} complexvormer EGTA aan een eindconcentratie van 10 mM tot het bepalen van het signaal van de fluorescentie bij gebrek aan Ca^{2 +}. Verwerven van beelden elke 3-5 s tot signaal stabilisatie, meestal voor minder dan 10 min.
Opmerking: Vanwege de relatief trage dynamiek van de wereldwijde Ca^{2 +} variaties, voeren deze acquisities elke 3-5-s (niet in streaming modus), waardoor voor Ca^{2 +} imaging op hetzelfde microscopische veld tijdens de opeenvolgende behandelingen.

3. analyse

Express cytosolische Ca^{2 +} variaties na verloop van tijd als het percentage van ΔF/F₀, waarbij ΔF staat voor de variatie van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de regio van belang (ROI) en F₀ de basislijn fluorescentie in de dezelfde ROI, waaraan een niet-relevante regio van het veld verstoken van cellen wordt afgetrokken.
1. Verwijderen van de basale fluorescentie-niveaus voor elke cel in verschillende velden, overeenkomt met de basislijn niveaus; deze niveaus ondubbelzinnig kunnen worden vastgesteld als gevolg van de lage frequentie en relatief korte duur van lokale Ca^{2 +} reacties in de verwerving van een bepaalde stroom.
  Opmerking: Kwantificeren opvallende kenmerken van de antwoorden aan de vragen gerelateerde en de pathogene model studeerde. Klassiek, worden verschillende parameters in aanmerking genomen om te analyseren van Ca^{2 +} signalen, met inbegrip van de frequentie van cellen met lokale of globale Ca^{2 +} reacties, evenals de duur, amplitude en frequentie van deze antwoorden. In het geval van Shigella en lokale reacties is een ander belangrijk aspect van de analyse de ruimtelijke vereniging van de reacties met sites van de bacteriële invasie.
Tekenen om te kwantificeren het percentage responsieve cellen weergegeven: globale of lokale reacties, ROIs in cellen, in de tijd-serie overeenkomt met de variaties van Fluo-4 intensiteit.
1. Stel strikte parameters te identificeren lokale Ca^{2 +} reacties, zoals een amplitude van drievoudig bovenstaande verschillen in de achtergrond van de gemiddelde fluorescentie basislijn voor de cel van de intensiteit, of een duur van ten minste 200 ms, om te voorkomen dat het scoren van een vals positief.
  Opmerking: Als een algemene regel, zelfs kleine lokale Ca^{2 +} reacties van elke achtergrondgeluiden kunnen worden onderscheiden door hun profiel. De ROI moet groot genoeg zijn om te integreren genoeg signalen van de fluorescentie te voorzien in de opsporing van lokale variaties. Afhankelijk van de intensiteit van de detectie van Fluo-4, kunnen deze ROIs overeen met cirkels met een diameter variërend van 2-5 mM.
2. Het meten van de variaties van de gemiddelde Fluo-4 intensiteit van de fluorescentie in 2 regio's in een afzonderlijke ruimte van dezelfde cel, om te bepalen of de antwoorden lokaal of globaal zijn.
  Opmerking: De analyse van een groot aantal cellen wordt vergemakkelijkt door het gebruik van beeldbewerkingssoftware toelaat de on-line schermweergave van de variaties van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie na verloop van tijd voor de geselecteerde regio's. Commercieel verkrijgbare imagingsoftware heeft een dergelijke optie, maar dit kan ook worden uitgevoerd met behulp van de Icy freeware, de ROI intensiteit Evolution -plug-in gebruiken.
3. Het bepalen van het percentage cellen met lokale reacties.
  Opmerking: Dit percentage is berekend op basis van het totale aantal cellen geanalyseerd op het gebied van de microscopie, die in voldoende mate moet ter ondersteuning van een statistisch belang met behulp van een niet-parametrische test.
4. Bepaal de duur van de lokale reacties.
  Opmerking: Lokale Ca^{2 +} reacties kunnen worden verder onderscheiden volgens hun duur bereiken (dat wil zeggen, minder dan 500 ms, tussen 5 en 10 s, of boven 10 s) en hun associatie met Shigella invasie sites.
Kwantificeren van de amplitude van de reacties. Eerst, moet u de maximale Ca^{2 +} en cel achtergrondniveaus bepaald zoals in stap 2.1.7 kalibreren. Aangezien de Fluo-4 belasting voor elke cel variëren kan, worden deze bepalingen voor afzonderlijke cellen in het veld uitvoeren.
1. De amplitude van de reacties wordt uitgedrukt als een relatieve percentage van de maximale respons.
2. Uit te voeren statistische tests met een test van de normaliteit, gevolgd door een parametrische test voor het analyseren van mogelijke verschillen in de amplitude van de reacties tussen de monsters.
3. Het bepalen van de vereniging van deze reacties ten opzichte van de sites van de bacteriële invasie door hun respectieve localization voor de bacteriële-geïnduceerde membraan ruches in de overeenkomstige fase contrast beelden gevisualiseerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Shigella invasie wordt geassocieerd met atypische langdurige lokale Ca^{2 +}antwoorden:

Naar aanleiding van het bovengenoemde protocol, Fluo-4-loaded HeLa cellen werden uitgedaagd met WT Shigella en stream acquisities werden uitgevoerd om te analyseren van Ca^{2 +}signalen. Een representatieve experiment is afgebeeld in Figuur 1, met time-lapse beelden serie van de i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript wordt het protocol dat we ontworpen om te volgen van lokale Ca^{2 +} signalen tijdens de relatief korte kinetiek van een Shigella -invasie, evenals global Ca^{2 +} reacties tijdens de uitgebreide kinetiek van Shigellabeschreven. Hieronder signalen kwesties kunnen worden gevonden die moeten worden aangepakt om het optimaliseren van de opsporing van Ca^{2 +} toets terwijl het minimaliseren van elke bemoeienis met de biologische processen.

Che...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dankbetuigingen

Wij danken Jenny-Lee Thomassin voor haar hulp bij het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door de ANR verleent MITOPATHO en PATHIMMUN, verleent de Labex Memolife en PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun is een ontvanger van een subsidie van de Ph.D. van de China Scholarship Raad. Laurent Combettes en Guy Tran Van Nhieu zijn ontvangers van een beurs van WBI-France Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph versie 7.7	Universal Imaging
CoolLED verlichtingssysteem pE-2	Roper Scientific
micro-schaal 35 mm, hoog	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) bouillon	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo rood	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. dat de AfaE adhesine tot expressie brengt
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogeen ipgD mutante stam die de AfaE adhesine tot expressie brengt

Referenties

Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier. Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Strehler, E. E. Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2). Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).
Muallem, S. Decoding Ca2+ signals: a question of timing. Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).
Uhlen, P., Fritz, N. Biochemistry of calcium oscillations. Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).
Carneiro, L. A., et al. Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells. Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).
Horng, T. Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome. Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).
Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells. Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).
Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles. Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).
Tran Van Nhieu, G., et al. Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion. Nature Communications. 4, 1567(2013).
Niebuhr, K., et al. Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology. The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).
Konradt, C., et al. The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism. Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).
Friedrich, P. The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).
Thomas, D., et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Sun, C. H., et al. The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells. The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).
Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus. Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Imaging Ca^{2 +} reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Tags