Methodenartikel

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

DOI:

10.3791/57747

⸱

18 september 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beschrijven we een methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in Plasmodium falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Deze ziekte, die voornamelijk degenen die leven in tropische en subtropische gebieden treft, wordt veroorzaakt door infectie met Plasmodium parasieten. De ontwikkeling van meer effectieve medicijnen tegen malaria kan versneld worden door het verbeteren van ons begrip van de biologie van deze complexe parasiet. Genetische manipulatie van deze parasieten is de sleutel tot het begrijpen van hun biologie; echter is historisch het genoom van P. falciparum moeilijk geweest om te manipuleren. Onlangs, CRISPR/Cas9 genoom bewerken is gebruikt in de malariaparasieten, waardoor voor eenvoudiger eiwit tagging, generatie van voorwaardelijke eiwit knockdowns, en de deletie van genen vertonen. CRISPR/Cas9 genoom bewerken heeft bewezen als een krachtig instrument voor het bevorderen van het gebied van malaria-onderzoek. Hier beschrijven we een CRISPR/Cas9-methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in P. falciparum. Deze methode is zeer aangepast aan andere soorten genetische manipulaties, met inbegrip van eiwit tagging en gene uitsparingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria is een verwoestende ziekte veroorzaakt door eencellige parasieten van het geslacht Plasmodium. P. falciparum, de meeste dodelijke menselijke malariaparasiet, veroorzaakt ongeveer 445.000 sterfgevallen per jaar, meestal bij kinderen onder de leeftijd van vijf1. Plasmodium parasieten hebben een ingewikkelde levenscyclus waarbij een mug vector en een gewervelde gastheer. Mensen raken eerst besmet wanneer een geïnfecteerde mug een bloed-maaltijd neemt. Vervolgens valt de parasiet binnen de lever waar het groeit, ontwikkelt en verdeelt voor ongeveer een week. Na dit proces, zijn de parasieten in de bloedbaan, waar ze ondergaan ongeslachtelijke replicatie in rode bloedcellen (RBC) uitgebracht. Groei van de parasieten binnen de RBC zijn rechtstreeks verantwoordelijk voor de klinische symptomen die gepaard gaan met malaria2.

Tot voor kort was de productie van transgene P. falciparum een moeizaam proces, waarbij verschillende rondes van de selectie van de drug die vele maanden nam en een hoge mislukkingstarief had. Deze tijdrovende procedure relieson breekt de generatie van willekeurige DNA in de regio van belang en de endogene capaciteit van de parasiet te herstellen zijn genoom wel homologe reparatie3,4,5,6 . Onlangs, geclusterd regelmatig Interspaced palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoom bewerken is met succes gebruikt in P. falciparum7,8. De invoering van deze nieuwe technologie in malaria onderzoek is cruciaal voor het bevorderen van begrip van de biologie van deze dodelijke parasieten van Plasmodium . CRISPR/Cas9 voorziet in specifieke doelgerichtheid van genen via gids RNAs (gRNAs), dat homoloog aan het gen van belang zijn. De gRNA/Cas9 complexe herkent het gen via de gRNA, en Cas9 introduceert dan een pauze van de dubbel-strand, dwingen de inleiding van herstelmechanismes in het organisme9,10. Omdat P. falciparum de machine om te herstellen van DNA-einden ontbreekt via niet-homologe einde deelname aan, het maakt gebruik van homologe recombinatie mechanismen en integreert transfected homologe DNA sjablonen om te herstellen van de Cas9/gRNA-veroorzaakte Tweepersoonskamer-strand break11,12.

Hier presenteren we een protocol voor het genereren van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in P. falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken. Het protocol demonstreert het gebruik van de Ribozym van de glmS naar voorwaardelijk vechtpartij eiwitniveaus van PfHsp70x (PF3D7_0831700), een chaperone geëxporteerd door P. falciparum in gastheer RBC13,14. De glmS Ribozym wordt geactiveerd door behandeling met glucosamine (die wordt geconverteerd naar glucosamine-6-fosfaat in cellen) om te klieven zijn bijbehorende mRNA, wat leidt tot een verlaging van de eiwit-14. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik van andere voorwaardelijke vechtpartij hulpmiddelen, zoals destabilisatie domeinen of RNA aptamers4,5,15. Onze gegevens-protocol het genereren van een plasmide van de reparatie die bestaat uit een hemagglutinine (HA)-tag en glmS Ribozym codering reeks geflankeerd door sequenties die zijn homoloog aan de PfHsp70x open leesraam (ORF) en de 3'-UTR. Ook beschrijven we de generatie van een tweede plasmide tot uitdrukking van de aandrijving van de gRNA. Deze twee plasmiden, samen met een derde die uitdrukking van Cas9, rijdt zijn transfected in RBC en gebruikt voor het wijzigen van het genoom van P. falciparum parasieten. Ten slotte, beschrijven we een polymerase-kettingreactie (PCR)-techniek om te controleren of de integratie van de tag en glmS Ribozym gebaseerd. Dit protocol is hoogst aanpasbaar voor de wijziging of de volledige knockout van alle genen van P. falciparum , verbetering van ons vermogen om het genereren van nieuwe inzichten in de biologie van de malariaparasiet.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Continue cultuur van P. falciparum vereist het gebruik van menselijke RBC en we commercieel gekochte eenheden van bloed dat waren ontdaan van alle id's en anoniem gemaakt gebruikt. De institutionele Review Board en de Office bioveiligheid aan de Universiteit van Georgia gecontroleerd onze protocollen en goedgekeurd op alle protocollen die worden gebruikt in ons lab.

1. het kiezen van een gRNA reeks

  1. Ga naar CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) en selecteer ' Fasta Target'. Onder 'Target', plakt u de 200 basenparen van 3' eind van de open leesraam (ORF) van een gen en 200 basenparen vanaf het begin van de genes 3'-UTR. Selecteer onder 'In', 'P. falciparum' (3D 7 v3.0), en selecteer ' CRISPR/Cas9 ' onder 'Gebruiken'. Klik vervolgens op ' vinden Target Sites'.
  2. Selecteer een gRNA-reeks uit de opties gepresenteerd, voorkeur te geven aan de meest efficiënte gRNA die zich het dichtst bij de site van wijziging en dat heeft de minste uit doelsoort zijn sites.
    Opmerking: Potentiële gRNA sequenties worden geïdentificeerd omdat ze onmiddellijk stroomopwaarts van een Protospacer aangrenzende Motif (PAM), die nodig is voor de aanwerving van Cas9 tot DNA. De volgorde die wordt gekloond in pMK-U6, de vector die gRNA expressie, maar dan drijft is de 20 honken onmiddellijk voorafgaand aan de PAM. De specifiek voor S. pyogenes Cas9 PAM is de nucleotide-volgorde NGG en niet moet worden opgenomen in de volgorde die wordt gekloond in pMK-U6.
    Opmerking: CHOPCHOP visueel gelederen de sequenties van de gRNA, de beste opties in groen, de minder ideale opties in barnsteen, en de ergste opties in het rood weer te geven. CHOPCHOP geeft de volgorde van elke gRNA een efficiëntie-score die wordt berekend met behulp van de modernste parameters gevonden in de literatuur, en ze voorspellen uit doelsoort zijn sites die kunnen worden herkend door de gRNA. Twee of drie gRNA sequenties wellicht worden geprobeerd te vinden van de gRNA die het beste geschikt is voor een bepaald gen.
  3. De volgorde van de gRNA en het omgekeerde-complement als Polyacrylamide-Gel-elektroforese-gezuiverd oligos kopen. De volgorde van de gRNA gebruikt voor het doel PfHSP70x kan worden gevonden in figuur 1B.
    Opmerking: Deze oligo dient 15 basenparen homoloog aan de gRNA-uiten plasmide, die nodig voor de reeks en Afbinding-onafhankelijke klonen (SLIC) in de pMK-U6 vector16 zijn.

2. het klonen van de gRNA volgorde in pMK-U6

  1. Verteren de pMK-U6 met BtgZI.
    1. Digest 10 μg pMK-U6 met 5 μl van BtgZI enzym (5.000 eenheden/mL) gedurende 3 uur bij 60 ° C. Volg van de fabrikant van het enzym protocol voor reactie voorwaarden.
    2. Na de incubatietijd van 3 h, voeg toe een extra 3 μL van BtgZI aan de reactie op de zorgen van de volledige spijsvertering van de plasmide. Verteren voor een extra 3 h, nog steeds na instructies van de fabrikant om te zorgen voor de juiste omstandigheden.
    3. Als u wilt zuiveren het verteerd pMK-U6 uit de reactie, een kolom gebaseerde PCR Schoonmaakbeurt kit volgens de instructies van de fabrikant te gebruiken.
    4. Scheid het verteerd DNA met behulp van een 0,7% agarose gel en uitpakken van de 4.200-basenpaar band.
  2. Ontharden de oligos met de gRNA reeks.
    1. Het reconstrueren van de pagina-gezuiverd oligos tot een concentratie van 100 μM met behulp van de nuclease-gratis water.
    2. 10 μL van elke oligo combineren met 2.2 μL van 10 x buffer 2 (Zie Tabel van materialen). Zorg ervoor dat het volume van de totale reactie 22.2 μL.
    3. Uitvoeren van het programma in een thermocycler gloeien gRNA: stap 1: 95 ° C, 10 min; stap 2: 95 ° C, 1 s, met een daling van de temperatuur van 0,6 ° C/cyclus; stap 3: Ga naar stap 2, 16 keer; stap 4: 85 ° C, 1 min; stap 5: 85 ° C, 1 s, met een daling van de temperatuur van 0,6 ° C/cyclus; stap 6: gaat u naar stap 5, 16 keer; stap 7: 75 ° C, 1 min; stap 8: 75 ° C, 1 s, met een daling van de temperatuur van 0,6 ° C/cyclus; stap 9: gaat u naar stap 8, 16 keer. Stap 10 tot en met 21: Herhaal de procedure gebruikt in stappen 4 tot en met 9 totdat de temperatuur 25 ° C; stap 22:25 ° C, 1 min.
  3. Het ontharde gRNA oligos invoegen door de BtgZI-verteerd en gel-gezuiverd pMK-U6 plasmide.
    1. Combineer 100 ng van verteerd pMK-U6 met 1 μL van 10 x buffer 2.1 en 3 μL van oligos van de ontharde gRNA. Verhoog het volume naar 9,5 μL met nuclease-gratis water.
    2. Voeg 0,5 μL van T4 polymerase en Incubeer de reactie bij kamertemperatuur gedurende 2,5 minuten.
    3. Verplaats de reactie op ijs en incubeer gedurende 10 min.
    4. Onmiddellijk transformeren 5 μL van de reactie in bevoegde E. coli volgens de instructies van de leverancier van de bacteriën. Plaat van de bacteriën op lysogenie Bouillon (LB) agar platen met 100 μg/mL ampicilline.
    5. Zodat de getransformeerde bacteriën groeien bij 37 ° C's nachts, dan Selecteer kolonies en uitpakken van DNA met een commercieel beschikbare plasmide miniprep kit.

3. ontwerpen homologie-regio's van de reparatie-sjabloon

  1. Ontwerp schild mutaties binnen de homologie reparatie sjabloon om te voorkomen dat opnieuw snijden van het DNA dat het genoom is geïntegreerd.
    Opmerking: Een mutatie van het schild bestaat meestal uit de invoering van een stille mutatie om te wijzigen de PAM zodat Cas9 zal niet het induceren van een breuk in de sjabloon van de reparatie. De PAM vereist voor de Cas9 gebruikt in dit protocol de nucleotide sequentie "NGG" is, waarbij "N" staat voor elk nucleotide. Indien mogelijk, omzetten in een van de G-nucleotiden een A, C of T.
    1. Als de PAM kan niet stil worden gemuteerd, voeren ten minste 2 stille mutaties in de 6 basenparen direct grenzend aan de PAM7,8.
      Opmerking: Deze mutaties zal voorkomen dat erkenning van de reparatie-sjabloon door de gRNA en te voorkomen dat opnieuw het snijden van de gerepareerde locus door de Cas9/gRNA complex. Het schild mutaties kunnen door het sturen van het DNA met inleidingen die de mutatie bevatten de homologie regio worden binnengebracht.
  2. Versterken de ORF homologie regio voor de reparatie-sjabloon.
    1. Met behulp van PCR, versterken 800 basenparen van 3' eind van het target-gen ORF. De inleidingen die worden gebruikt voor het uitsluiten van de stop codon van deze amplicon te ontwerpen.
    2. Het ontwerp van de inleidingen voor het inbrengen van deze amplicon in het pHA -glmS die met SacII en AfeI via een DNA afbinding reactie of SLIC16heeft zijn verteerd.
  3. Versterken van de 3'-UTR homologie regio voor de reparatie-sjabloon.
    1. Met behulp van PCR, versterken de 800 basenparen onmiddellijk na de stop codon van het target-gen. Het ontwerpen van inleidingen voor het invoegen van deze amplicon in het pHA -glmS die met HindIII en NheI via een DNA afbinding reactie of SLIC16heeft zijn verteerd.
      Opmerking: De hoge inhoud van het genoom van P. falciparum kan bemoeilijken versterking van regio's zoals UTRs. Een alternatieve benadering voor het gebruik van PCR is de synthese van de homologie-regio's.

4. klonen homologie regio's in de plasmide reparatie

  1. De ORF homologie regio invoegen door het pHA -glmS.
    1. Verteren het pHA -glmS met SacII en AfeI, volgens de instructies van de fabrikant van het enzym. Het PCR-product van de ORF homologie-regio in het verteerd plasmide met behulp van SLIC16invoegen.
    2. Transformeren in bevoegde E. coli zoals uitgevoerd in stappen 2.3.4 en 2.3.5.
  2. De 3'-UTR homologie gebied invoegen in een plasmide pHA-glmS, die al de ORF homologie regio bevat (zie stap 4.1).
    1. Verteren het plasmide met HindIII en NheI volgens de instructies van de fabrikant van het enzym. Plaats de 3'-UTR homologie regio amplicon in het verteerd plasmide met behulp van SLIC16.
    2. Transformeren in bevoegde E. coli en haal het plasmide DNA (stappen 2.3.4 en 2.3.5).

5. Neerslagmiddel DNA voor Transfectie

  1. Voeg toe 40 μg van pMK-U6, pUF1-Cas9 en pHA -glmS DNA (voor een totaal van 120 μg van DNA) in een steriele 1,5 mL microcentrifuge buis.
  2. Toevoegen van 1/10de de hoeveelheid DNA van 3 M Natriumacetaat in water (pH 5.2) aan de buis en meng goed met behulp van een draaikolk (bijvoorbeeld als het volume in stap 5.1 was 100 μl, voeg toe 10 μL van natriumacetaat).
  3. 2,5 maal het volume van 100% ethanol toevoegen aan de buis en meng goed met behulp van een draaikolk voor ten minste 30 s (bijvoorbeeld als het volume in 5.1 was 100 μl, voeg toe 250 μL van 100% ethanol).
  4. Plaats de buis op ijs of op-20 ° C gedurende 30 minuten.
  5. Centrifugeer de buis bij 18,300 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
  6. Verwijder het supernatant voorzichtig uit de buis. De pellet niet storen.
  7. 3 maal het volume van 70% ethanol toevoegen aan de buis en mix kort met behulp van een draaikolk (bijv., als het volume in 5.1 100 μl was, voeg 300 l 70% ethanol).
  8. Centrifugeer de buis bij 18,300 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
    Opmerking: Deze stap moet worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een biologische veiligheidskast.
  9. Verwijder het supernatant voorzichtig uit de buis. De pellet niet storen. Laat de buis open en laat de pellet te drogen gedurende 15 minuten.
  10. De neergeslagen DNA bij-20 ° C worden opgeslagen totdat het nodig is voor Transfectie.

6. het isoleren van menselijke ige suspensie van RBC van volbloed ter voorbereiding van de Transfectie

  1. Aliquot vers bloed in steriele 50 mL conische buizen (ongeveer 25 mL per buis).
  2. Centrifugeer de buizen bij 1.088 x g gedurende 12 minuten, met de remmen van de centrifuge ingesteld op 4.
  3. Gecombineerd uit het supernatant en buffy coat. Resuspendeer de pellet van de RBC met een gelijk volume van onvolledige RPMI.
    Opmerking: Onvolledige RPMI wordt bereid door RPMI 1640 aan te vullen met 10.32 μM thymidine, 110.2 μM hypoxanthine, 1 mM natrium pyruvaat, natriumbicarbonaat 30 mM, 5 mM HEPES, 11.1 mM glucose en gentamicine 0,02% (v/v).
  4. Herhaal stap 6.2 – 6.3 tweemaal. Na de laatste wash, resuspendeer de RBC in een gelijk volume van onvolledige RPMI en opslaan van de buizen bij 4 ° C.

7. transfecting RBC met de CRISPR/Cas9-plasmiden (moet aseptisch worden gedaan)

Opmerking: P. falciparum culturen worden onderhouden zoals beschreven in andere verslagen-17. Handhaven alle culturen bij 37 ° C onder 3% O2, 3% CO2en 94% N2 tenzij anders vermeld. Wanneer het bloed in dit protocol wordt gebruikt, verwijst het naar de zuivere rode bloedcellen bereid in stap 6. Het bloed gebruikt mag niet ouder zijn dan 6 weken, want er meestal een afname van de proliferatie van de parasiet in oudere bloed is. De volgende stappen beschrijven vooraf laden RBC met DNA en de cultuur van een parasiet aan transfected cellen toe te voegen. Andere gevestigde transfectie protocollen zijn compatibel met de transfecting van deze constructies18,19.

  1. Bereiden een 1 x cytomix buffer in water (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filter-steriliseren de buffer met behulp van een filter 0,22 μm.
  2. Voeg 380 μL van de cytomix van 1 x tot het DNA neergeslagen in stap 5, en vortex te ontbinden. Toestaan van het DNA te ontbinden in de 1 x cytomix voor 10 minuten, vortexing elke 3 min voor 10 s.
  3. Combineren in een steriele 15 mL conische buis, 300 μL van RBC (50% hematocriet, vanaf stap 6) in de onvolledige RPMI met 4 mL 1 x cytomix.
  4. Centrifugeer het RBC uit stap 7.3 op 870 x g gedurende 3 minuten en verwijder de bovendrijvende vloeistof uit de RBC-pellet.
  5. Resuspendeer de pellet van de RBC met het mengsel van de DNA/cytomix vanaf stap 6.2 en overdracht aan een 0,2 cm electroporation cuvette.
  6. Electroporate de RBC met behulp van de volgende voorwaarden: 0.32 kV 925 precisiecapaciteit ingesteld op "Hoog Cap" en weerstand, μF ingesteld op "Oneindig".
  7. Na electroporation, breng de inhoud van de Cuvet een 15 mL kegelvormig met 5 ml van de volledige RPMI (cRPMI). Centrifugeer de buis bij 870 x g gedurende 3 minuten bij 20 ° C, en vervolgens de bovendrijvende vloeistof decanteren.
    Opmerking: cRPMI is bereid via dezelfde methode als onvolledig RPMI met de toevoeging van 0,25% (m/v) lipide-rijke bovien serumalbumine.
  8. Resuspendeer de pellet in 4 mL van cRPMI en overdracht aan één putje in een 6-well weefselkweek plaat. Voeg 400 μL van de cultuur van een hoog-schizont (7-10% schizont parasitemia is ideaal) naar de transfected RBC.
    Opmerking: Parasitemia is gedefinieerd als het percentage van de parasiet besmet RBC.
  9. De volgende dag was de cultuur met 4 mL cRPMI. Centrifugeer de cultuur op 870 x g gedurende 3 minuten en het supernatant gecombineerd. Resuspendeer de cultuur in 4 mL cRPMI.
  10. 48 uur na het voltooien van stap 7.6, was de cultuur met 4 mL cRPMI. Vervolgens resuspendeer de cultuur in cRPMI 1 μM met DSM1 om te selecteren voor het Cas9-plasmide.
  11. Blijven de culturen wassen elke dag met cRPMI tot parasieten niet langer zichtbaar door bloed-uitstrijkje zijn. Na dit punt, vervangt het kweekmedium met verse cRPMI plus 1 μM DSM1 elke 48 uur.
    1. Om een bloed smear, Pipetteer 150 μl van cultuur in een centrifugebuis 0,6 mL. Pellet de cellen door centrifugeren bij 1700 x g gedurende 30 s.
    2. Gecombineerd uit het supernatant. Gebruik een pipet de Ingehuld cellen overbrengen naar een glasplaatje. Met behulp van een tweede glasplaatje gehouden in een hoek van 45° aan de eerste dia, uitstrijkje van de druppel bloed. Vlek op de dia met behulp van een commercieel beschikbare kleuring kit volgens protocol van de fabrikant.
    3. Bekijk de parasieten die met behulp van een 100 X olie onderdompeling doelstelling.
  12. Vanaf 5 dagen na transfectie (stap 7.6), verwijderen van 2 mL van de cultuur met RBC geresuspendeerde in het kweekmedium. Voeg terug 2 mL verse medium (cRPMI plus 1 μM DSM1) en bloed aan 2% hematocriet. Vers bloed wordt toevoegen op deze manier zodra een week tot parasieten weer, zoals bepaald door dun bloed-uitstrijkje (stap 7.11).
    Opmerking: Als integratie succesvol is, parasieten in het algemeen wel weer in de cultuur van één maand na transfectie.
  13. Zodra de parasieten weer, verwijderen DSM1 drug druk. U kunt ook verwijderen drug druk nadat parasieten hebben gekloond uit.

8. controle van parasieten voor integratie van de reparatie-sjabloon

  1. Als parasieten opnieuw door dun bloed-uitstrijkje zichtbaar zijn, isoleren DNA van de cultuur met behulp van een passende kit.
  2. Hiermee kunt u dat PCR versterken de gemodificeerde regio van het genoom te bepalen als de gerichte locus met succes veranderd is en als de ongewijzigde wild-type locus (indicatief van wild-type parasieten) kan worden opgespoord.
    1. Gebruiken voor het detecteren van parasieten die zijn geïntegreerd met de reparatie-sjabloon, een voorwaartse primer die aan het begin van de ORF, buiten de gekloonde homologie-regio zit. Gebruik een omgekeerde primer die in de 3'-UTR zit.
      Opmerking: Deze versterking bevat de sequenties van de HA codes en glmS Ribozym, waarbij van geïntegreerde parasieten zullen langer dan dezelfde regio versterkt in wild-type parasieten.

9. het klonen van parasieten door verdunning te beperken

  1. Seriële verdunningen van de parasiet cultuur vanuit stap 7.13 om een eindconcentratie van 0,5 μL van de parasieten/200 uitvoeren. Breng 200 μL van de verdunde cultuur in de putjes van een weefselkweek 96-wells-plaat.
    Opmerking: Omdat parasitemia is gedefinieerd als het percentage van geïnfecteerde RBC en de hematocriet is ook een gedefinieerde getal (2%), het aantal parasieten per eenheid volume is gemakkelijk afgeleid.
    1. Bereiden 1 mL van de cultuur in cRPMI op 5% parasitemia en 2% hematocriet (deze parasitemia en niveau hematocriet, de cultuur bevat 1 x 107 parasieten/mL).
    2. Verdun deze cultuur-1:100 met cRPMI. Verdun weer 1:100 met cRPMI.
    3. Verdunde 1:400. Het uitvoeren van deze tweevoudige verdunning door toevoeging van 62,5 μL van cultuur aan 25 mL van cRPMI en 1 mL bloed. Deze verdunning leidt tot de gewenste concentratie van 0,5 μL van de parasieten/200.
  2. De klonen plaat handhaven parasieten zijn opspoorbaar in de putjes.
    1. Elke 48 h, wordt het medium in de 96-wells-plaat vervangen door verse medium.
    2. Eenmaal per week, vanaf 5 dagen na het begin van de klonen plaat (stap 9.1), verwijder 100 μl uit elk putje en voeg terug 100 μl van verse medium + bloed (2% hematocriet).
  3. Eventuele putjes met parasieten te identificeren.
    1. Plaats de 96-wells-plaat duikt met een hoek van 45° gedurende ongeveer 20 minuten, waardoor het bloed te vestigen op een hoek in de plaat.
    2. Plaats de 96-wells-plaat op een lichtbak. U ziet dat de putjes met parasieten media die is geel van kleur bevat, in vergelijking met de roze media van parasiet-vrije wells, als gevolg van verzuring van het medium door de parasieten.
    3. Met behulp van een serologische precisiepipet, verplaatst u de inhoud van de parasiet-bevattende putten aan een 24-well weefselkweek plaat dat uitbreiding van de parasitemia.
    4. Met behulp van PCR analyse zoals beschreven in stap 8, controleer deze klonale parasiet lijnen voor correcte integratie.

10. knockdown van het eiwit door de behandeling van parasieten met Glucosamine en bevestiging via westelijke vlekkenanalyse

  1. Bereid een 0,5 M-oplossing voor het voorraad van GlcN (glucosamine), die kan worden opgeslagen bij-20 ° C.
  2. Voeg GlcN aan de glmS parasiet culturen en laat hen om te groeien in aanwezigheid van GlcN.
    Opmerking: De eindconcentratie en timing van de GlcN behandeling hangt af van het experiment en parasiet lijn. GlcN, kan dit gevolgen hebben voor groei van de parasiet, zodat de ouderlijke parasiet stam mag worden blootgesteld aan een reeks van GlcN concentraties te bepalen van de gevoeligheid voor de verbinding. Vaak is een concentratie van 2.0-7,5 mM GlcN gebruikte13,14,20.
  3. Isoleren EiwitSteekproeven van de GlcN behandelde parasieten13.
  4. Gebruiken EiwitSteekproeven voor westelijke vlekkenanalyse voor het detecteren van verlaging van de eiwit-13.
    1. Gebruik een anti-HA antilichaam volgens de instructies van de fabrikant om de HA-glmS-gelabeld proteïne te ontdekken. Vergelijk de HA band aan een besturingselement van het laden, zoals PfEF1α.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische voorstelling van de plasmiden gebruikt in deze methode, evenals een voorbeeld van een mutatie van het schild worden weergegeven in Figuur 1. Als een voorbeeld van hoe te identificeren van mutant parasieten na transfectie, zijn resultaten van PCRs voor het controleren van de integratie van de HA -glmS construct afgebeeld in Figuur 2. Een representatief beeld van een klonen plaat is afgebeeld in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deimplementatie van CRISPR/Cas9 in P. falciparum heeft zowel verhoogde de efficiëntie van en verminderde van de hoeveelheid tijd die nodig is voor het wijzigen van de parasiet genoom, vergeleken met vorige methoden van genetische manipulatie. Dit uitgebreide protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van voorwaardelijke mutanten met behulp van CRISPR/Cas9 in P. falciparum. Terwijl de methode hier is gericht specifiek voor de generatie van HA -glmS mutanten, kan deze strate...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Muthugapatti Kandasamy bij de Universiteit van Georgia (UGA) Biomedische microscopie kern voor technische bijstand en Jose-Juan Lopez-Rubio voor het delen van de pUF1-Cas9 en pL6 plasmiden. Dit werk werd gesteund door bogen stichting awards te D.W.C. en te H.M.K., UGA opstarten middelen V.M., subsidies uit de maart van dubbeltjes Stichting (Basil O'Connor Starter geleerde Research Award) V.M. en ons National Institutes of Health grants (R00AI099156 en R01AI130139) naar V.M. en (T32AI060546) naar H.M.K.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086We buy the ones that are individually wrapped
Sodium AcetateSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Gift from Akhil Vaidya labGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
TPP Tissue Culture 6 Well PlatesMIDSCITP92006
TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)MIDSCITP93100
TPP Tissue Culture 96 Well PlatesMIDSCITP92096
TPP Tissue Culture 24 Well PlatesMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs#R3131L
T4 DNA PolymeraseNew England Biolabs#M0203S
500 mL Steritop bottle top filter unitMilliporeSCGPU10REYou can use any size that fits your needs
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generated by the Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerated by the Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio LabGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlucoseSigma-AldrichG7021-1KG
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS5761-500G
Sodium pyruvateSigma-AldrichP5280-100G
HypoxanthineSigma-AldrichH9636-25g
Gentamicin ReagentGibco15710-064
ThymidineSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerated by the Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAGenerated by the Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/AYou will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best
Human Red Blood CellsInterstate Blood Bank, IncEmail or call them directly for orderingWe typically use O+ blood
3D7 parasite lineAvailable upon requestN/A
Lysogeny Broth (LB)FisherBP1426-2You can make your own, it is not necessary to use exactly this
AmpicilinFisherBP1760-25We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alphaDr. Daniel Goldberg's LabWashington University in St. LouisYou can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory
Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonalMade by Roche, sold by Sigma11867423001You can use your preferred anti-HA antibody
0.6 mL tubesFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)Fisher22-122-911You can also use giemsa stain
Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.Fisher12-544-3

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310(2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727(2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Plasmodium falciparumGlmS knockdownproteinetagginggene knock outelectroporatietechniekWestern blot analyseimmunofluorescentie assaybloeduitstrijkjespreparaat

Gerelateerde artikelen