Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay

Samenvatting

Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.

Samenvatting

Gereglementeerde eiwit-eiwitinteractie zijn een leidend beginsel voor veel signalering gebeurtenissen, en de opsporing van dergelijke evenementen is een belangrijk element in het begrip van hoe dergelijke trajecten zijn georganiseerd en hoe zij functioneren. Er zijn vele methoden voor de opsporing van eiwit-eiwitinteractie in cellen, maar relatief weinig kunnen worden gebruikt voor het detecteren van interactie tussen endogene eiwitten. Een dergelijke methode, de nabijheid van afbinding assay (PLA), heeft verschillende voordelen aan het gebruik ervan. Vergeleken met andere gemeenschappelijke analysemethoden eiwit-eiwit interactie, PLA heeft relatief hoge gevoeligheid en specificiteit, met minimale cel manipulatie, en, in het protocol hierin beschreven kan worden uitgevoerd, slechts twee doelgroepen gerichte requires antistoffen afkomstig van verschillende soorten (bv., van muis en konijn) en één gespecialiseerde reagens: een aantal secundaire antilichamen die covalent gekoppeld aan specifieke oligonucleotides dat toen bracht in de nabijheid van elkaar, maken een amplifiable platform voor in situ PCR of rollende cirkel versterking. In deze presentatie tonen we hoe toe te passen op de PLA-techniek om wijzigingen in de nabijheid van de MST1 en MST2 in vaste cellen zichtbaar maken. De techniek wordt beschreven in dit manuscript is met name van toepassing voor de analyse van cel signalering van studies.

Inleiding

Verstoring van het MST1/Hippo signalering is verbonden met ontwikkelingsstoornissen en carcinogenese¹. Bij zoogdieren, activeren de kinases MST1 en MST2 (phosphorylate) MOB1 en LATS1/2, de laatste kinaseenzym en inactiveert de transcriptionele co activator ja-geassocieerde proteïne (YAP)². In zijn actieve vorm (unphosphorylated) heeft YAP oncogene activiteit, verbetering van de transcriptie van cel proliferatie genen; omgekeerd, wanneer YAP wordt geïnactiveerd door het traject van Hippo, celproliferatie wordt onderdrukt en apoptosis bevorderd³. In de weefsels, MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als actieve homodimers, maar oncogene prikkels kunnen verhogen van MST1/MST2 heterodimers, en dergelijke heterodimers zijn inactief⁴. Het blijft echter slecht begrepen hoe MST1/MST2 heterodimerization wordt geregeld. Zowel homo- als heterodimers zijn gemedieerde via interacties tussen C-terminal spiraalsnoer-spoel regio's MST1 en MST2, bekend als SARAH domeinen⁵. Met behulp van een in situ PLA aangetoond in dit artikel tonen we de aanwezigheid van MST1/MST2 heterodimers in menselijke Schwann cellen (HSC) en menselijke embryonale nier cellen (HEK-293). PLA heeft een voordeel ten opzichte van andere proteïne/eiwit interactie detectiemethoden, omdat het mogelijk maakt het opsporen van endogene eiwit-eiwitinteractie, die kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd zonder de noodzaak van transgenic meningsuiting of het gebruik van epitoop tags ⁶.

Transductie signaalroutes worden grotendeels bepaald door de voorwaardelijke associatie van component eiwitten. Bijvoorbeeld, leidt stimulatie van de meeste receptor tyrosine kinases tot hun homo - of hetero-dimerisatie en latere vereniging met extra intracellulaire signalering eiwitten, die zelf vorm verder complexen. Het doel van de PLA-methode is om te visualiseren van de afstand tussen de eiwitten in cellen, mits de eiwitten minder dan 30-40 nm uit elkaar zijn. De nabijheid van het eiwit is meestal gedetecteerd door eerste het broeden van de cellen met passende primaire antilichamen groeide op in verschillende soorten (bv., konijn en muis) tegen elke interactie eiwit, vervolgens toe te voegen soortspecifieke secundaire antilichamen, vooraf gekoppelde naar kort DNA-sondes. Als de DNA-sondes in de nabijheid zijn, kunt gelijktijdig een specifieke oligonucleotide voor koppelen DNA binden, zowel van deze sondes, vorming van een platform voor amplificatie door in situ PCR of door het walsen van cirkel mechanisme. Fluorescerende tags toegevoegd aan de amplificatie reactie kun visualisatie van de interacterende eiwitten, die als tl stippen die gemakkelijk kunnen worden gekwantificeerd en gelokaliseerd op bepaalde regio's in de cel^{7,8 verschijnen},^{, 9 , 10}.

Protocol

1. bereiding van de oplossingen

1. Bereid kleefpoeders oplossing: 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS. Neem voor 10 mL, 2,5 mL van 16% PFA en voeg 7,5 mL 1 x PBS.
   Risico's: PFA is kankerverwekkend zijn bij lage doseringen. Rook en contact met de huid zijn gevaarlijk. Winkel bij-20 ° C.
2. Bereid permeabilization oplossing: 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS. Voeg 100 µL van Triton X-100 in 100 mL 1 x PBS voor 100 mL van de oplossing. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
3. Bereiden was Buffer: 1 x TBST. Voor 1 liter, neem 100 mL 10 x TBS, 890 dH₂O mL en 10 mL van tween-20 (10%).
4. Bereid blokkerende oplossing zoals geleverd door kit. U kunt ook gebruik 1 x PBS oplossing met 2% BSA.
5. De antilichaam-verdunningsmiddel bereiden zoals geleverd door kit. U kunt ook gebruik 1 x PBS oplossing met 1% BSA.

2. de beplating van cellen

Opmerking: In deze studie gebruikten we vereeuwigd menselijke Schwann cellen (iHSC) en menselijke embryonale 293 van de nier cellen (HEK 293); Deze methode kan echter worden gebruikt voor vele soorten Adherente cellen.

1. Cultuur HEK 293 in DMEM aangevuld met 10% FBS, 0.2% Glucose, 2 mM L-Glutamine, 100 U/mL penicilline G en 100 µg/mL streptomycine op Weefselkweek behandeld platen bij 37 ° C in 5% CO,₂. IHSC in 10% FBS/DMEM aangevuld met Pen/Strep en 2 µM forskolin handhaven. Routinematig testen cellen voor mycoplasma. Geen cel lijn verificatie werd uitgevoerd.
2. Jas van een dia 16-well kamer met 50 µL van 10 µg/mL natuurlijke muis laminin of 0,01% poly-L-lysine oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C in 5% CO₂. Hiermee splitst u cellen met behulp van 0,04% trypsine-EDTA.
3. Plaat iHSC en HEK-293 in 100 µL van medium aan 80% samenvloeiing (15.000-25.000 cellen per putje).
4. Incubeer de cellen voor 12-24 uur bij 37 ° C in een bevochtigde, 5% CO₂ incubator.

3. fixatie en Permeabilization

1. Verwijder het medium van de putten en wassen met 100 µL van 1 x PBS. Gecombineerd met een micropipet tot een minimum beperken van het risico van het verwijderen van het monster.
2. Fix cellen door 50 µL van 4% PFA per goed en incubeer gedurende 10 min op RT, zonder agitatie toe te voegen. Cellen zijn gevoelig voor detachement, dus vermijd pipetteren de oplossingen direct op de cellen.
3. Wassen van de cellen met 0,05% TBST drie keer voor elke 5 min. Gecombineerd met een micropipet tot een minimum beperken van het risico van het verwijderen van het monster.
4. De cellen met permeabilization oplossing (0,1% Triton x-100 in 1 x PBS) behandelen gedurende 10 minuten zonder agitatie op RT.
5. Wassen van cellen met TBST driemaal voor 5 min met agitatie.

4. blokkeren

1. Tik op uit de TBST (heel voorzichtig met een micropipet). Visualiseren van de dia in een microscoop te zien als cellen aangesloten blijven.
2. Voeg één druppel (50-60 µL) 1 x blokkeren oplossing aan elk monster.
3. Verwarm op een kamer (lege tip doos met water) van de vochtigheid bij 37 ° C en Incubeer de dia's in het gedurende 1 uur bij 37 ° C.

5. primaire antilichamen

1. Verdun de primaire antilichamen (1:100) in het antilichaam verdunningsmiddel (Zie Tabel van materialen). Bereid 40 antilichaam-oplossing van µL per putje.
2. Blokkerende oplossing uit dia's verwijderen door te onttrekken uit de vloeistof. Niet toestaan cellen te drogen.
3. Vortex en 40 µL van de antilichaam-oplossingen toe te voegen aan elk putje.
4. Incubeer 1 uur bij 37 ° C in een voorverwarmde vochtigheid kamer.

6. nabijheid afbinding Assay sondes

Opmerking: PLA sondes worden geleverd als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen). De keus aan sondes zal afhangen van de soorten primaire antilichamen gebruikt om te ontdekken de proteïnen van belang.

1. De twee PLA sondes (anti-muis MINUS en anti-konijn PLUS) verdunnen 1:5 in het antilichaam verdunningsmiddel. Voor elk monster, 40 µL van PLA sonde te bereiden. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op RT.
2. Tik op uit de primair antilichaam-oplossing van de dia's. Wassen van de dia's tweemaal voor elke 5 min met wassen Buffer op RT.
3. Zachtjes Tik op van de Buffer van de was uit de dia's en breng de verdunningsmiddel PLA sonde oplossing in putjes (40 µL per putje).
4. Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer voor 1 uur bij 37 ° C.

7. afbinding

Opmerking: De in situ Detection reagentia Red, Ligase en Afbinding oplossing worden geleverd als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen).

1. Gebruik de in situ Detection reagentia Red.
2. Onmiddellijk vóór gebruik, vortex en de vereiste omvang van de 5 x afbinding voorraad 1:5 in zuiver water verdunnen.
   Opmerking: Bewaar niet verdunde reagentia.
3. Tik op uit de PLA sonde oplossing van de dia's. Wassen van de dia's in 1 x wassen Buffer tweemaal voor elke 5 min op RT.
4. Onmiddellijk vóór toevoeging aan de monsters, vortex en Ligase toe te voegen aan de afbinding oplossing om 1:40 verdunning en vortex opnieuw.
5. Tik op uit de Buffer van de was uit de dia's en de afbinding/Ligase-oplossing toevoegen aan elk putje (40 µL per putje).
6. Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.

8. de versterking

Opmerking: De versterking voorraad worden verstrekt als onderdeel van een kit (Zie Tabel van materialen). Reagentia zijn licht gevoelig; dus Vermijd blootstelling van de dia's aan het licht.

1. Vortex en Verdun de vereiste hoeveelheden de 5 x amplificatie voorraad 1:5 in zuiver water en meng.
2. Tik op uit de afbinding/Ligase oplossing van de dia's. Wassen van de dia's in 1 x wassen Buffer tweemaal voor elke 2 min op RT.
3. Vortex en de polymerase opnieuw toevoegen aan de oplossing van de versterking op 1:80 verdunning en vortex.
4. Tik op uit was Buffer van de dia's en de versterking/Polymerase-oplossing toevoegen aan elk putje (40 µL per putje). Incubeer de dia's in een voorverwarmde vochtigheid kamer voor 100 min bij 37 ° C.

9. voorbereiding voor Imaging

Opmerking: Dit zijn lichte gevoelige reagentia. Houd de dia's beschermd tegen licht.

1. Tik op uit de versterking-Polymerase-oplossing van de dia's en wassen tweemaal voor 10 min elke in 1 x wassen Buffer op RT.
2. De kamers en de siliconen rond de putten van de dia volledig verwijderen. Schraap de resterende bits van siliconen met een scheermes. Tekent een raster op de dia scheiden van elk goed.
3. Voeg ~ 40 µL van het medium van de montage met DAPI. Wees voorzichtig om te voorkomen dat overvullen luchtbellen onder de slip van de cover. De randen van de cover slip kunnen worden verzegeld met nagellak.
4. Wacht minstens 20 min voordat het uitvoeren van de analyse van de afbeelding met behulp van een confocal microscoop.
   Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
5. Na imaging, opslaan van de dia's op-20 ° C in het donker.

Resultaten

We gebruikten de PLA-assay voor het testen van de interactie tussen MST1 en MST2 in HEK-293 en iHSC. De cellen waren vaste permeabel en gekleurd met verschillende antilichamen, gevolgd door in situ versterking volgens het PLA-protocol (Figuur 1). Om het document op het niveau van de MST1/MST2 heterodimerization, werden cellen gekleurd met MST1 en MST2 antilichamen (figuur 1Aen 1 C, 1 G). Als positieve co...

Discussie

We vonden het nuttig te gebruiken glas kamer dia's voor dit experiment, zoals het is erg handig voor het uitvoeren van experiment met verschillende cellijnen van (14-16) en er is geen behoefte om te veranderen van de steekproef telkens tijdens de microscopie analyse. Een paar complicaties voordoen, zoals een verhoogd risico op kruisbesmetting met antilichamen. Wij stellen daarom voor elke goed wassen individueel in plaats van met behulp van een Coplin pot, ondanks de toegenomen duur van het experiment. Daarnaast zijn de ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Chamber slides	Thermo Fisher Scientific	178599	16 well, glass slide
PLA probe Anti-Mouse Minus	Sigma-Aldrich	DUO92004	Bevat 1x Blokkingsoplossing, 1x antilichaam Diluent
PLA Probe Anti-Rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002	Bevat 1x Blokkingsoplossing, 1x antilichaam Diluent
Wash Buffers, Fluorescerend	Sigma-Aldrich	DUO82049	Bevat Wash Buffer A en Wash Buffer B
Montage Medium met DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040
Detectie Reagentia Rood	Sigma-Aldrich	DUO92008	Bevat 5x Ligatie, 1x Ligase, 5x Amplifikation Rood, 1x Polymerase
p44/42 MAPK (Erk1/2) Antilichaam	Cell Signaling	9102s
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)	Cell Signaling	5726s	pERK antilichaam
MST2 antilichaam	Cell Signaling	3952s
Krs-2 (RJ-5)	Santa Cruz	sc-100449	MST1 antilichaam
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy sciences	15710	Verdun tot 4% PFA in PBS voor fixeeroplossing
Triton x100	Fisher BioReagents	BP 151-500	Om 0,1% Triton x-100 in 1xPBS voor Permeabilisatie oplossing te bereiden
Confocale microscopie	Leica TCS SP8, 63x		Beeldanalyse met ImageJ software