Hier, laten we zien hoe een nabijheid afbinding Assay (PLA) gebruiken om te visualiseren van MST1/MST2 heterodimerization in vaste cellen met hoge gevoeligheid.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van Heterodimerization van eiwit Isoforms met behulp van een in Situ nabijheid afbinding Assay
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gereglementeerde eiwit-eiwitinteractie zijn een leidend beginsel voor veel signalering gebeurtenissen, en de opsporing van dergelijke evenementen is een belangrijk element in het begrip van hoe dergelijke trajecten zijn georganiseerd en hoe zij functioneren. Er zijn vele methoden voor de opsporing van eiwit-eiwitinteractie in cellen, maar relatief weinig kunnen worden gebruikt voor het detecteren van interactie tussen endogene eiwitten. Een dergelijke methode, de nabijheid van afbinding assay (PLA), heeft verschillende voordelen aan het gebruik ervan. Vergeleken met andere gemeenschappelijke analysemethoden eiwit-eiwit interactie, PLA heeft relatief hoge gevoeligheid en specificiteit, met minimale cel manipulatie, en, in het protocol hierin beschreven kan worden uitgevoerd, slechts twee doelgroepen gerichte requires antistoffen afkomstig van verschillende soorten (bv., van muis en konijn) en één gespecialiseerde reagens: een aantal secundaire antilichamen die covalent gekoppeld aan specifieke oligonucleotides dat toen bracht in de nabijheid van elkaar, maken een amplifiable platform voor in situ PCR of rollende cirkel versterking. In deze presentatie tonen we hoe toe te passen op de PLA-techniek om wijzigingen in de nabijheid van de MST1 en MST2 in vaste cellen zichtbaar maken. De techniek wordt beschreven in dit manuscript is met name van toepassing voor de analyse van cel signalering van studies.
Inleiding
Verstoring van het MST1/Hippo signalering is verbonden met ontwikkelingsstoornissen en carcinogenese1. Bij zoogdieren, activeren de kinases MST1 en MST2 (phosphorylate) MOB1 en LATS1/2, de laatste kinaseenzym en inactiveert de transcriptionele co activator ja-geassocieerde proteïne (YAP)2. In zijn actieve vorm (unphosphorylated) heeft YAP oncogene activiteit, verbetering van de transcriptie van cel proliferatie genen; omgekeerd, wanneer YAP wordt geïnactiveerd door het traject van Hippo, celproliferatie wordt onderdrukt en apoptosis bevorderd3. In de weefsels, MST1 en MST2 bestaan voornamelijk als....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. bereiding van de oplossingen
- Bereid kleefpoeders oplossing: 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS. Neem voor 10 mL, 2,5 mL van 16% PFA en voeg 7,5 mL 1 x PBS.
Risico's: PFA is kankerverwekkend zijn bij lage doseringen. Rook en contact met de huid zijn gevaarlijk. Winkel bij-20 ° C. - Bereid permeabilization oplossing: 0,1% Triton X-100 in 1 x PBS. Voeg 100 µL van Triton X-100 in 100 mL 1 x PBS voor 100 mL van de oplossing. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
- Bereiden was Buffer: 1 x TBST. Voor 1 liter, neem 100 mL 10 x TBS, 890 dH2O mL en 10 mL van tween-20 (10%).
- Bereid blokkerende oplossing zoals ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We gebruikten de PLA-assay voor het testen van de interactie tussen MST1 en MST2 in HEK-293 en iHSC. De cellen waren vaste permeabel en gekleurd met verschillende antilichamen, gevolgd door in situ versterking volgens het PLA-protocol (Figuur 1). Om het document op het niveau van de MST1/MST2 heterodimerization, werden cellen gekleurd met MST1 en MST2 antilichamen (figuur 1Aen 1 C, 1 G). Als positieve co.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We vonden het nuttig te gebruiken glas kamer dia's voor dit experiment, zoals het is erg handig voor het uitvoeren van experiment met verschillende cellijnen van (14-16) en er is geen behoefte om te veranderen van de steekproef telkens tijdens de microscopie analyse. Een paar complicaties voordoen, zoals een verhoogd risico op kruisbesmetting met antilichamen. Wij stellen daarom voor elke goed wassen individueel in plaats van met behulp van een Coplin pot, ondanks de toegenomen duur van het experiment. Daarnaast zijn de .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken het hele Chernoff laboratorium voor het bijdragen tot de optimalisatie en validatie van dit protocol, met name Maria Radu en Galina Semenova. Wij danken ook Andrey Efimov van de cel Imaging faciliteit op Fox Chase Cancer Center. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (R01 CA148805) naar JC.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chamber slides | Thermo Fisher Scientific | 178599 | 16 well, glass slide |
| PLA probe Anti-Mouse Minus | Sigma-Aldrich | DUO92004 | Bevat 1x Blokkingsoplossing, 1x antilichaam Diluent |
| PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | Bevat 1x Blokkingsoplossing, 1x antilichaam Diluent |
| Wash Buffers, Fluorescerend | Sigma-Aldrich | DUO82049 | Bevat Wash Buffer A en Wash Buffer B |
| Montage Medium met DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| Detectie Reagentia Rood | Sigma-Aldrich | DUO92008 | Bevat 5x Ligatie, 1x Ligase, 5x Amplifikation Rood, 1x Polymerase |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) Antilichaam | Cell Signaling | 9102s | |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187) | Cell Signaling | 5726s | pERK antilichaam |
| MST2 antilichaam | Cell Signaling | 3952s | |
| Krs-2 (RJ-5) | Santa Cruz | sc-100449 | MST1 antilichaam |
| 16% Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | 15710 | Verdun tot 4% PFA in PBS voor fixeeroplossing |
| Triton x100 | Fisher BioReagents | BP 151-500 | Om 0,1% Triton x-100 in 1xPBS voor Permeabilisatie oplossing te bereiden |
| Confocale microscopie | Leica TCS SP8, 63x | Beeldanalyse met ImageJ software |
Referenties
- Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
- Praskova, M., Xia, F., Avruch, J.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
