Methodenartikel

Visualisatie van Microbiota in teek lef door geheel-mount In Situ hybridisatie

DOI:

10.3791/57758

⸱

1 juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijk en stoffelijk beoordelen de aanwezigheid van levensvatbare microbiota in de ingewanden van de teek met behulp van een gemodificeerde geheel-mount kruising in situ-aanpak.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Besmettelijke ziekten overgebracht door geleedpotigen vectoren blijven een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid wereldwijd. De oorzaak van deze ziekten, pathogenen bestaan niet in isolement wanneer ze koloniseren de vector; Integendeel, ze waarschijnlijk gaan in interacties met resident micro-organismen in het lumen van de darm. De vector microbiota heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in pathogen transmissie voor verschillende vector-overgedragen ziekten. Of verblijvende bacteriën in de darm van de teek Ixodes scapularis , de vector van verschillende menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi, waaronder teek overdracht van ziekteverwekkers beïnvloeden wordt niet bepaald. Wij vereisen methoden voor het karakteriseren van de samenstelling van de bacteriën die zijn gekoppeld aan de darm van de teek te vergemakkelijken van een beter begrip van de potentiële interspecies interacties in de darm van de teek. Geheel-mount in situ kunt hybridisatie te visualiseren van RNA afschriften die zijn gekoppeld aan bepaalde bacteriesoorten voor de verzameling van kwalitatieve gegevens met betrekking tot de overvloed en distributie van de microbiota in onbeschadigde weefsel. Deze techniek kan worden gebruikt voor het onderzoeken van veranderingen in de gut microbiota milieu in de loop van de teek voederen en kan ook worden toegepast om te analyseren van de expressie van genen van de teek. Kleuring van hele teek lef opbrengst informatie over de bruto ruimtelijke verdeling voor target RNA in het weefsel zonder de noodzaak voor driedimensionale wederopbouw en minder wordt beïnvloed door verontreiniging van het milieu, die vaak kunstdiscours de sequencing-gebaseerd methoden vaak gebruikt bij het bestuderen van complexe microbiële gemeenschappen. Over het geheel genomen, deze techniek is een waardevol instrument dat kan worden gebruikt om beter begrijpen vector-pathogen-microbiota interacties en hun rol in de transmissie van de ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke en dierlijke ziekteverwekkers overgedragen door geleedpotigen vectoren zijn wereldwijd te vinden en zijn goed voor ongeveer 20% van de infectieziekten wereldwijd1, maar effectief en veilig vaccins tegen de meeste van deze ziekteverwekkers zijn niet beschikbaar. Ons begrip van de belangrijke rol van commensale, symbiotische en pathogene micro-organismen, gezamenlijk bekend als de microbiome2, moduleren en de vormgeving van de gezondheid van bijna alle metazoans3 groeit. Het is nu duidelijk dat geleedpotigen vectoren van ziekteverwekkers ook darmflora haven en deze vector-geassocieerde microbiota is aangetoond dat de invloed van uiteenlopende vectoren overgedragen ziekteverwekkers4,5. De geleedpotigen microbiome is samengesteld uit eubacteria, archaea, virussen en eukaryote microben zoals protozoa, aaltjes en schimmels6. Echter, de overheersende onderzoek focus is op eubacteria, gedeeltelijk vanwege de beschikbaarheid van markers en verwijzing databases te identificeren specifieke bacteriële leden.

Met een focus op Ixodes scapularis, de teek vector van meerdere menselijke pathogenen Borrelia burgdorferi7, inclusief de verwekker van de ziekte van Lyme, de optimalisatie van een microbiële visualisatie techniek was erop gericht verbetering van ons begrip van de darmflora van de teek in het kader van vector-pathogeen interacties. Verschillende vragen moeten worden beantwoord in de teek microbiome veld. De darm is de site van de eerste uitgebreide ontmoeting tussen de teek en de binnenkomende ziekteverwekker in het kader van horizontaal overgedragen ziekteverwekkers; Daarom is inzicht in de rol van vector darmflora bij het moduleren van vector-pathogeen interacties zal onthullen zinvolle inzichten. Teken hebben een unieke wijze van bloedmeel spijsvertering, waar de verwerking van bloedmeel onderdelen neemt intracellulair8plaatsen. Het lumen van de darm schijnbaar fungeert als een vaartuig naar de bloedmeel bevatten als de teek-feeds, en nutriënten spijsvertering en assimilatie blijven na herverpakking voortvloeien gedurende de verschillende dagen van de voeding. De ziekteverwekkers verworven door de teek tijdens het voederen Voer het lumen van de darm samen met de bloedmeel en dus de lumen wordt een primaire site van interacties tussen de teek, pathogenen en resident microbiota. Zoals spijsvertering via de herverpakking en Ixodid teek Rui verloopt, ondergaat de darm structurele en functionele wijzigingen9. De samenstelling en de ruimtelijke organisatie van gut bacteriën is ook waarschijnlijk om te variëren in concert met de veranderende milieu van de darm. Het is daarom belangrijk om te begrijpen van de architectuur van verblijvende bacteriën in de darm van de teek om volledig te begrijpen het samenspel van de teek, pathogenen en darmflora.

Moleculaire technieken voor het beschrijven van host-geassocieerde microbiota routinematig gebruik maken van high-throughput parallelle sequencing strategieën10 volgnummer bacteriële 16S ribosomal DNA (rDNA) te versterken. Deze strategieën sequencing omzeilen de noodzaak tot het verkrijgen van een culturen van specifieke bacteriën en geef een gedetailleerde beschrijving van alle bacteriële leden vertegenwoordigd in de steekproef. Toch zijn dergelijke strategieën verward door het onvermogen om te onderscheiden van milieu verontreinigingen van bona fide bewoners. Verder, bij de beoordeling van de monsters, zoals teken, die in grootte klein zijn en vandaar bevatten lage microbiota-specifieke DNA oplevert, de waarschijnlijkheid van versterking van milieucontaminanten is toegenomen11 en resulteert in de onduidelijke interpretatie van microbiome samenstelling. Functionele karakterisering in combinatie met de visualisatie van specifieke levensvatbare bacteriën zal daarom worden cruciaal voor het definiëren en onderscheiden de microbiome van de teek stoffelijk en ruimtelijk. Richting van dit doel profiteerde we van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie. Deze techniek wordt routinematig gebruikt ter beoordeling van gen expressiepatronen in organen en embryo's12,13,14 en kunt semikwantitatieve analyse van meningsuiting via het gehele monster van belang. Dit verschilt van de traditionele in situ hybridisatie technieken die gebruik maken van weefselsecties en vaak uitgebreide analyse van verdeelde materiaal met een computationele vergadering te voorspellen van de expressie in de hele organen15vereist. Terwijl geheel-mount in het algemeen naar hele organismen12 verwijst, verwijst hier geheel-mount naar hele darmen of organen. De voordelen van het gebruik van de gehele-mount RNA in situ hybridisatie aanpak om te beoordelen van de architectuur van de teek darmflora zijn multifold. De darm van de teek is samengesteld uit 7 paren van diverticula, elk paar variërend in de grootte16. De functionele verschillen, vink als iemand, onder deze diverticula, niet in de context van de teek biologie begrepen zijn, microbiota of teek-pathogeen interacties. Manipulaties van de darm die scheuren van de darm diverticula zou verdringen microbiota aanwezig zijn in het lumen van de darm of die losjes gekoppeld aan de darm en verkeerde interpretatie van de ruimtelijke lokalisatie van microbiota. Fluorescentie-geëtiketteerden RNA in situ hybridisatie is eerder gebruikt om te onderzoeken afschriften17 van de darm van de teek door vaststelling en individuele gut diverticula om sonde hybridisatie en te lokaliseren van B. burgdorferi te openen transcripties door segmenteren van paraffine-ingebedde hele teken18. Deze beide benaderingen vereisen manipulaties van de weefsels van de teek vóór hybridisatie die afbreuk aan de gut microbiota architectuur doen zou.

In dit verslag beschrijven we in detail het protocol te onderzoeken van levensvatbare teek darmflora met behulp van geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH). Het gebruik van geheel-mount RNA in situ hybridisatie in staat stelt een globaal inzicht in de aanwezigheid en de overvloed van specifieke gut bacteriën in de verschillende regio's van de darm en kan aansporen nieuwe inzichten in de teek gut biologie in het kader van pathogen kolonisatie en doorgeven. Verder is maakt het gebruik van RNA sondes gericht zijn tegen specifieke bacteriële RNA de ontdekking van levensvatbare bacteriën in de darm van de teek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bereiding van DNA sjablonen

  1. Download de 16S rRNA reeks specifieke elke bacteriële geslachten van de NCBI database en ontwerp polymerase-kettingreactie (PCR) compatibel vooruit en omgekeerde inleidingen die geslachten-specifieke regio's (~ 200-250-basenpaar lang) versterken zal, zoals eerder beschreven 19. verwijzen naar de open source databases SILVA20,21 en probeBase22 Onlinebronnen voor rRNA-gerichte oligonucleotide sondes en primers, zoals RNA sondes voor sommige bacteriële geslachten commercieel wellicht beschikbaar.
    Opmerking: Het is belangrijk om te selecteren van gene regio's die specifieke aan specifieke geslachten en zorgen dat ontworpen inleidingen niet verwante bacteriële geslachten doen versterken. Dit is cruciaal voor het verkrijgen van gene/geslachten-specifieke sonde hybridisatie.
  2. Feed teken voor 24, 48 of 72 h op muizen, ontleden teek lef en bereiden van RNA en cDNA van teek lef beschreven eerdere23. Gebruik cDNA als sjabloon aan PCR versterken geslachten-specifieke waarbij met behulp van een thermocycler. Voer een aliquoot gedeelte van het PCR-product/amplicon op een 1,5% agarose gel en bevestigen dat de amplicon komt overeen met de verwachte grootte door visualisatie onder ultraviolet (UV)-licht met behulp van een gel imaging systeem.
  3. Kloon de bacteriële 16S ribosomaal RNA amplicon van belang in een commercieel verkrijgbare TA vector (Tabel of Materials) met RNA polymerase initiatiefnemers geschikt voor bacteriofaag polymerase (SP6, T7 of T3). Het volgnummer van de klonen om de identiteit van de amplicon en de directionaliteit van de kloon met betrekking tot elk van de initiatiefnemers te bevestigen. Op basis hiervan bepalen de promotor van de keuze voor het genereren van betekenis of antisense RNA sondes (Figuur 1).
  4. Linearize 1 mg van de plasmide met een geschikte restrictie-enzym in een volume van de reactie van maximaal 30 µLfor 2 h bij temperaturen die door de fabrikant aanbevolen. Kies de enzymen van de beperking op basis van de promotor die zal worden gebruikt voor het genereren van de zin of antisense sonde (Figuur 1). Controleer of linearisatie door visualisatie van 2 µL van digest reactie op een 1% agarose gel.
  5. Zuiveren van de resterende 28 µL van verteerd DNA met behulp van een commercieel beschikbare PCR product kolom zuivering kit en kwantificeren van DNA concentratie door spectrofotometer.
    Opmerking: Sommige zin sondes kan achtergrondkleuring veel hoger dan de overeenkomstige antisense sonde en andere opties kunnen moeten worden onderzocht. Alternatieve negatieve controles omvatten plasmiden codering sequenties niet vertegenwoordigd in het monster of een ander sonde die een kenmerkend patroon van hybridisatie oplevert.

2. bouw van Digoxygenin-UTP RNA sondes

  1. Bereiden de nucleotide mix door het combineren van 7,5 µL van 100 mM UTP, 25 µL van 10 mM digoxygenin-UTP en 10 µL elke 100 mM ATP, GTP en CTP in een centrifugebuis 1,5 mL.
  2. In vitro transcriptie uitvoeren met behulp van commercieel beschikbare T7 of Sp6 RNA polymerase kits, met behulp van 1 µL van de nucleotide mix (stap 2.1) en 0,25 - 1 µg sjabloon DNA. Breng het volume maximaal 20 µL met water. Flick de buis om te combineren en pulse spin. Incubeer bij 37 ° C gedurende 2,5-3 uur.
    Opmerking: Bouw van de sonde is succesvol geweest met verteerd plasmide concentraties zo laag als 7 ng/µL, maar typisch concentraties bij deze stap variëren van 15-25 ng/µL. De reactie van de transcriptie kan ook 's nachts worden geïncubeerd bij 37 ° C, maar dit niet aanzienlijk verhoogt het rendement van RNA.
  3. Voeg 1 µL van DNase (2.000 eenheden/µL) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Niet meer dan 10 min, of het enzym kan beginnen vernederende RNA.
  4. Voeg 30 µL van ijskoude 7,5-8 M lithium chloride en 30 µL van gekoeld nuclease-gratis water neerslaan van het RNA. Flick de buis te mengen. Toestaan van neerslag van RNA te gaan 's nachts bij-20 ° C.
  5. Verzamelen van RNA door centrifugeren bij 17.000 x g gedurende 20 min bij 4 ° C. De pellet een keer met 1 mL vers bereide 75% ethanol in Diethyl pyrocarbonate (DEPC) water wassen, herhaal dan centrifugeren.
  6. Verwijderen en verwijder het supernatant, omkeren van de buis op een schone papieren handdoek en laten drogen voor 10 min. resuspendeer de pellet in nuclease-gratis water. Als de pellet gemakkelijk zichtbaar is, resuspendeer in 25 µL. Als de pellet is zeer klein of niet zichtbaar, resuspendeer in 15-20 µL. een schatting van RNA concentratie verkrijgen door spectrofotometer.
    Opmerking: Typische RNA concentraties variëren van 200-500 ng/µL.

3. visualisatie van RNA sondes door elektroforese van het Gel van RNA Formaldehyde te beoordelen van RNA zuiverheid

Let op: Formaldehyde vormt een gevaar voor de inademing; Daarom, genereren de oplossingen nodig voor RNA gel analyse in een zuurkast. Ethidiumbromide is een verdachte kankerverwekkend te worden ingedeeld; voorzichtig behandelen.

  1. Bereiden een 1% formaldehyde agarose gel als eerder24 beschreven en de gel in een gel in box gratis RNases gegoten. Zodra cool, vul het vak gel met 1 x buffer (1 x MOPS bij pH 7.0, 5% formaldehyde) uitgevoerd.
  2. De Buffer van de steekproef (5 µL 400 mg/mL ethidiumbromide, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL formaldehyde en 100 µL formamide) voor te bereiden. Combineer 2 µL van RNA sonde (stap 2.6) met 8 µL van monster Buffer. Incubeer bij 70 ° C gedurende 10 minuten.
  3. RNA laden Buffer voor te bereiden door het combineren van 5 mL 50% glycerol, 1 mL 10% formaldehyde, 40 mg bromophenol blauw, 40 mg xyleen cyanol en 20 µL van 0.5 M EDTA (pH 7.5). Na gebruik, het opslaan van deze buffer bij-20 ° C.
  4. Voeg 3 µL van Buffer geladen aan het RNA-monster van stap 3.2 en meng. Houd monster buizen op ijs.
  5. Laad het hele monstervolume uit stap 3.4 in de gel. Het laden van een aliquoot deel van single-stranded RNA ladder naast om te controleren of de grootte van het RNA. Stel de gel bij 100 V hoger of lager totdat de blauwe kleurstof ongeveer 75% van de weg naar beneden de gel migreert. Visualiseer de RNA onder UV-licht met behulp van een gel imaging systeem.
    Opmerking: Een goede kwaliteit RNA sonde moet worden weergegeven als een discrete band met een mobiliteit die overeenkomt met de verwachte omvang van de sonde (Figuur 2, lane 1). Als de sonde wordt weergegeven als een diffuse en smeary band (Figuur 2lane 2) dit niet mag worden gebruikt.

4. Vink Gut collectie en fixatie

  1. Verzamelen Ixodes scapularis nimfen die hebben gevoed op muizen voor de tijd points of interest.
    Opmerking: Voor de toepassing van deze techniek, teken gevoed voor 48 of 72 h werk best.
  2. Het ontleden van de darm van de teek in MEMFA (tabel 1) op een glasplaatje onder een Microscoop dissectie, het vermijden van schade aan het orgel zoveel mogelijk. Plaats een vinkje op een schone microscoopglaasje in 20-30 µL van MEMFA. Met behulp van een paar van steriele high-carbon stalen scheermesje #11 segment de hoofd regio op de scutum van de teek verlaten het lichaam van de teek. Druk zachtjes op het lichaam om de darm diverticula en speekselklieren uit de cuticle lichaam te duwen. Scheid de speekselklieren en de darm en het lef scoop over het scheermesje.
  3. Lef in een tube van 1,5 mL met 500 µL MEMFA verzamelen. Incubeer de buis bij kamertemperatuur met zachte rockende voor 1 h of overnacht bij 4 ° C.
    Opmerking: Speekselklieren van de teek kan ook worden ontleed en op dezelfde wijze vastgesteld en gekleurd.
  4. Het uitdrogen van het weefsel door het wassen voorzichtig 3 keer met 1 mL ijskoud 100% ethanol. Laat het lef natuurlijk zinken naar de bodem van de buis tussen elke wassen, centrifugeren kan schade aan het weefsel. Voor langdurige opslag, houd de monsters in 100% ethanol bij-20 ° C.

5. bouw van Mesh monster manden en 24-well mand houder

  1. Snijd de bodems off van 2 mL of 5 mL module-top centrifuge buizen een verwarmde single-edged scheermesje met een scalpel.
    Let op: Het mes moet misschien meerdere malen worden opgewarmd voordat de cut is voltooid.
  2. Gesneden kwadraten van een 110 µm nylon gaas iets groter dan de nieuwe tube openen. Bond het gaas aan de onderkant van de buis door te drukken op hen samen licht op een warm bord op middellange-laag vuur totdat een goede afdichting is gemaakt. Laat afkoelen, te verzekeren dat er geen gaten tussen de Maas en de buis en trim overtollige Kabelhoes om de randen.
  3. Gaten in de dekking van een 24-well plaat knippen, zodanig dat de lip van de steekproef mand gemaakt in stap 5.2 zal op het gat zitten en niet vallen door, de opbrengst van een opstelling waar de bodems van de manden van de steekproef helemaal in de putten zitten zal wanneer ze worden geplaatst de gaten in de dekking.
  4. Gebruik deze houder voorzien mand manden van één plaat overbrengen naar een andere met relatief gemak voor het geheel van de in situ hybridisatie protocol. Gebruik twee 24-Wells-platen zodat terwijl een incubatie voordoet zich, de andere plaat is voorbereid voor de volgende wasbeurt.

6. in Situ hybridisatie: dag 1 (Timing: 4-5 h)

  1. Overdracht lef om label monster manden, gescheiden door de experimentele conditie en RNA sonde bedoeld.
    Opmerking: Vlek ten minste 5 lef per voorwaarde ter verantwoording voor natuurlijke variatie van replicaat-organismen.
  2. Hydrateren de monsters voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen in het weefsel door het geleidelijk aan verhogen van de verhouding met fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof (PTw; Tabel 1) tot ethanol in de wast.
    Opmerking: Complete all wast in de 24-well mand houder bij kamertemperatuur met zachte agitatie, tenzij anders vermeld. Aliquot 500-600 µL van wassen oplossingen in elk putje van de houder van dergelijke dat het lef in elke mand volledig worden ondergedompeld. Bereiden alle oplossingen met DEPC behandelde water om te voorkomen dat de aantasting van het RNA.
    1. De monsters gedurende 5 minuten wassen in 500 µL 100% ethanol.
    2. Voorbereiden van ten minste 500 µL per monster mand van 75%, 50% en 25% ethanol in PTw. hydrateren de monsters door het wassen gedurende 5 min. in elke oplossing van ethanol, verplaatsen van de hoogste concentratie van ethanol naar de laagste.
    3. De monsters 4 keer voor elke 5 min in PTw wassen.
  3. Permeabilize van de monsters met proteïnase K (10 µg/mL) in PTw gedurende 5 minuten.
  4. Het weefsel voorbereiden door kruising met de sondes van RNA.
    1. Wassen van de monsters tweemaal zoals beschreven bij punt 6.2 in de 24-well mand houder bij kamertemperatuur met zachte agitatie voor 5 min in 500 µL triethanolamine buffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) (tabel 1) om de monsters in een amine-vrije omgeving.
    2. Behandeling van de monsters tweemaal met 500 µL 0,25% azijnzuur-anhydride in triethanolamine buffer (0,1 M, pH 7.0-8.0) voor elke 5 min, dan wassen de monsters tweemaal in PTw voor elke 5 min.
      Opmerking: De azijnzuur-anhydride acetylates gratis aminen te neutraliseren van positieve lading, die is van cruciaal belang om te voorkomen van aspecifieke Elektrostatische interacties en specifieke binding van de sonde naar mRNA.
    3. Herstellen van het lef voor 20 min met de 500 µL 4% paraformaldehyde in PTw, dan 5 keer wassen in PTw voor elke 5 min.
    4. Prehybridize door de monsters in 500 µL hybridisatie buffer /in de houder van de 24-well mand in de 24 goed plaat (tabel 1) gedurende 1,5 tot 2,5 uur bij 60 ° C met zachte agitatie in een waterbad schudden aan het broeden. Sla de kruising buffer gebruikt voor de prehybridization stap om te gebruiken in het protocol van dag 2 (stap 7.1).
    5. Sonde kruising oplossingen bereid door verdunning van RNA sondes in kruising buffer om een eindconcentratie van 1 µg/mL.  Broeden monsters met sonde kruising oplossingen in de 24-well mand houder bij 60 ° C met zachte agitatie overnachting in een schudden waterbad (tabel 2). De afdekplaat uitvoering van de houder van de mand zonder speling met aluminiumfolie om te voorkomen dat de verdamping van de kruising oplossing.

7. in Situ hybridisatie: dag 2 (Timing: 4.5-5.5 h)

  1. Verwijder de monsters uit de sonde kruising oplossingen en plaats hen in de buffer van de gereserveerde kruising van de vorige dag. Incubeer bij 60 ° C met zachte agitatie voor 3 min.
    Let op: Sonde kruising oplossingen kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C voor hergebruik tot 3 keer.
  2. 2 x saline-Natriumcitraat buffer (SSC) bereid door verdunnen 20 x SSC in DEPC-behandeld water (tabel 1). Wassen van de monsters tweemaal voor 3 min met 2 x SSC, dan 3 keer voor 20 min met 2 x SSC bij 60 ° C om alle sporen van de sonde en kruising buffer te verwijderen.
  3. Behandelen met RNase een (20 µg/mL) en RNase T1 (10 µg/mL) 2 x SSC gedurende 30 minuten bij 37 ° C om één strandde RNA sonde vertegenwoordigen gratis niet-gekruist RNA.
  4. Wassen met 2 x SSC gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bereiden van 0,2 x SSC door verdunnen 2 x SSC in DEPC-behandeld water, daarna wassen tweemaal met 0,2 x SSC gedurende 30 minuten bij 60 ° C te verwijderen van de overtollige RNases.
  5. Wassen tweemaal met 500 µL van maleïnezuur buffer (MAB; Tabel 1) voor elke 10 min.
  6. Incubeer monsters met oplossing (2% blokkerende reagens in de MAB) voor 1.5-2 h blokkeren.
    Opmerking: Het blokkeren reagens kan worden moeilijk te ontbinden; zachte verwarming helpt ontbinding.
  7. De blokkerende oplossing vervangen door anti-heksenkruid alkalische fosfatase-geconjugeerde 500 µL van antilichaam bij een verdunning van de 1:3,000 in het blokkeren van de oplossing en bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 4 uur of bij 4 ° C na een nacht bebroeden.

8. in Situ hybridisatie: dag 3 (Timing: 6 h naar girale)

  1. Wassen van de monsters ten minste 5 keer voor elke 30 min met 500 µL MAB te verwijderen overtollige antilichaam.
    Opmerking: Deze wast zijn flexibel en kunnen worden uitgebreid tot 1-2 h of 3-4 wasbeurten kunnen worden vervangen voor één overnachting wassen bij 4 ° C met minimale effecten op werkzaamheid.
  2. Wassen tweemaal voor 5 min met alkalische fosfatase buffer, pH 9.5 (AP buffer; Tabel 1).
  3. Allereerst dat de reactie van kleur ter vervanging van de laatste wasbeurt met 500 µL van het chromogenic substraat voor alkalische fosfatase (Tabel van materialen). De monster afdekplaat met aluminiumfolie en laat de kleuring gaan bij kamertemperatuur voor 3 - 5 h of overnachting bij 4 ° C. De kleuring reactie periodiek controleren door het weefsel onder een ontleden Microscoop om te voorkomen dat overstaining te bekijken.
    Opmerking: Wanneer de kleuring voltooid is, een paarse tint is waarneembaar met het blote oog in de antisense-gesondeerd monsters onder de Microscoop, maar het weefsel mogen niet tot zeer donker. Kleuring verloopt zeer langzaam bij 4 ° C en duurt maximaal 20-24 h.
  4. Stop de kleur reactie door het wassen gedurende 5 min. in 500 µL MAB, dan 's nachts herstellen van het weefsel in Bouin de oplossing.
    Let op: Verwerken van de Bouin oplossing in een zuurkast; het is een bijtende kankerverwekkend.

9. in Situ hybridisatie: dag 4 (Timing: 3-3,5 h)

  1. Bereiden van ten minste 7 mL per monster mand voor 1 x SSC door verdunnen 20 x SSC in DEPC-behandeld water. Verwijderen van de Bouin-oplossing door het wassen van de monsters 4 tot 6 keer met 70% ethanol in 1 x SSC tot het weefsel niet meer geel.
  2. Bereiden van 500 µL per monster mand van 75%, 50% en 25% ethanol oplossingen in 1 x SSC. De monsters gedurende 5 minuten wassen in elke oplossing van hoogste ethanol concentratie verplaatsen naar laagste te hydrateren het weefsel. Wassen tweemaal voor 5 min elke in 1 x SSC.
  3. Incubeer de monsters in de bleekwater oplossing (tabel 1) voor 90 min op een lightbox in een zuurkast.
    Opmerking: Deze stap laat pigmentatie in de monsters of verkleuring van de Bouins oplossing moet worden verwijderd en vergroot het signaal van de sonde voor duidelijke visualisatie.
  4. Wassen van de monsters tweemaal met 500 µL van 1 x SSC voor 5 min.
  5. Verhuizen van de ingewanden met minimale schade door het omkeren van de steekproef mand in een putje van een nieuwe 24-well-plaat en wassen met 70% ethanol door het gaas bodem met behulp van een precisiepipet overdracht. Bewaren bij-20 ° C indien nodig.
  6. Handhaven het lef in 70% ethanol in de 24 goed-plaat en de weergave met een helder-veld Microscoop voor een overzicht van de kleuring patronen van meerdere monsters zoals weergegeven in Figuur 3, . Individuele lef onder een heldere-veld Microscoop onderzoeken zoals weergegeven in Figuur 4en Figuur 5, en Figuur 6, mount de lef in 100% glycerol onder coverslips. Gebruik een plastic spatel voorzichtig manipuleren het weefsel met minimale schade.
    Opmerking: De hoge viscositeit van glycerol helpt het weefsel te beschermen tegen schade door compressie en maakt de voorzichtig positionering van diverticula zodanig zijn dat het weefsel optimaal worden op de hogere vergrotingen bekeken kan.
  7. Vastleggen van beelden op de microscoop met behulp van de Microscoop specifiek beeld vangt software (Tabel van materialen) en exporteren als TIFF-afbeeldingen naar een generieke beeld het uitgeven software. Download om te kwantificeren van de relatieve kleuring verschillen tussen experimentele behandelingen, een generieke afbeelding analysesoftware (Tabel van materialen). Open de afbeelding in de analysesoftware van de en de instructies in de software gebruiken voor het meten van de intensiteit van de pixel van de kleuring en berekenen histogram percelen van de kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meting en de schatting van de kwaliteit van de sondes van RNA zijn kritisch voorafgaand aan het begin van de kleuring. In vitro transcriptie efficiëntie hangt sterk de hoeveelheid en de kwaliteit van de DNA-sjabloon. We gevisualiseerd routinematig de sondes van RNA op een formaldehyde-gel om te controleren of de zuiverheid en de hoeveelheid sonde gegenereerd door de reacties van de transcriptie. De sondes moeten worden weergegeven als heldere, discrete bands (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit is het eerste gebruik van een geheel-mount in situ hybridisatie (WMISH) techniek te bestuderen van de microbiota van een geleedpotigen vector van ziekteverwekkers. Ons protocol werd aangepast van een gebruikt bij het bestuderen van de ontwikkeling in Drosophila en kikker embryo's25,26. Geheel-mount RNA in situ hybridisatie is routinematig gebruikt voor het lokaliseren van gene afschriften ruimtelijk en stoffelijk27...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen conflicten van belang om te vermelden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken oprecht Dr. Mustafa Khokha, Yale University, voor het verstrekken van het gebruik van de hulpbronnen van zijn laboratorium. Wij zijn dankbaar aan Mr. Ming-Jie Wu voor uitstekende technische bijstand. EF is een HHMI onderzoeker. Dit werk werd gesteund door een gift van de John Monsky en Jennifer Weis Monsky ziekte van Lyme onderzoeksfonds.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micronAmazon03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
DNAse I(RNAse-free)New England BiolabsM0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kitNew England BiolabsE2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040S
Water, RNase-free, DEPC-treatedAmerican BioanalyticalAB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0American BioanalyticalAB00502-01000
Formaldehyde, 37%JT Baker2106-01
FormamideAmerican BioanalyticalAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Proteinase KSigma Aldrich3115879001
Triethanolamine HClSigma AldrichT1502-100G
Acetic anhydrideSigma Aldrich320102-100ML
ParaformaldehydeThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
RNA from torula yeastSigma AldrichR3629-5G
Heparin, sodium saltSigma AldrichH3393-10KU
Denhardt's Solution, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS hydrateSigma AldrichC3023-1G
RNase ASigma Aldrich10109142001
RNase T1ThermoScientific EN0541
Maleic acidSigma AldrichM0375-100G
Blocking reagentSigma Aldrich11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphataseSigma Aldrich11442074001
Bouin's solutionSigma AldrichHT10132-1L
Hydrogen peroxideMallinkrodt Baker, Inc2186-01
Single stranded RNA ladderAmbion -MilleniumAM7151
 #11 High-Carbon steel blades C and A Scientific Premiere#11-9411
ThermocyclerBioRad, CA1851148
SpectrophotometerThermoScientific NanoDrop 2000C
Orbital shakerVWRDS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bathBELLCO Glass, IncHot Shaker-7746-12110
Gel  documentation systemBioRadGel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope NikonNikonSM2745T
Bright-field Microscope ZeissAXIO Scope.A1
Dissection microscope ZeissSTEMI 2000-C
 Light boxVWR102097-658
PCR purification kit Qiagen28104
Image capture softwareZeissZen lite
Image editing software Adobe Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis softwareNational Institutes of HealthImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentationIntavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). Intavis, Biolane HT1.16v

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184(2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Visualisatie van de teken darmwhole mount techniekmicrobiota analyseRNA sondedetectieweefseldissectieMEMFA fixatiechromogeen substraatSSC wassingkwaliteitscontrole van de sonde

Gerelateerde artikelen