Methodenartikel

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

DOI:

10.3791/57766

⸱

27 september 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
12I, UVSQ, INSERM UMR1173, Université Paris-Saclay, 2Institut Pasteur, Unité de Pathogénomique Mycobactérienne

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we twee protocollen om te studeren fagocytensysteem -Mycobacterium abscessus interacties: de screening van een transposon mutant bibliotheek voor bacteriële intracellulaire deficiëntie en de gehaltebepaling van bacteriële intracellulaire transcriptome van RNA sequencing. Beide benaderingen inzicht geven in de genomische voordelen en aanpassingen van de transcriptomic verbetering van intracellulaire bacteriën fitness.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wat Mycobacterium abscessus onderscheidt van andere saprofytische mycobacteriën is de mogelijkheid om te weerstaan fagocytose door menselijke macrofagen en de mogelijkheid om zich te vermenigvuldigen in dergelijke cellen. Deze eigenschappen virulentie renderen M. abscessus pathogene, vooral in kwetsbare hosts met onderliggende structurele longziekten, zoals mucoviscidose, Bronchiëctasie of tuberculose. Het blijft onduidelijk hoe patiënten besmet raken met M. abscessus . In tegenstelling tot vele mycobacteriën, M. abscessus is niet gevonden in de omgeving maar misschien wonen binnen amoeben, milieu fagocyten die een potentieel reservoir voor M. abscessus vertegenwoordigen. Inderdaad, M. abscessus is resistent tegen amoebal fagocytose en de intra-amoeba leven lijkt te verhogen van M. abscessus virulentie in een experimenteel model van infectie. Nochtans, is weinig bekend over de virulentie van de M. abscessus op zich. Om te ontcijferen van de toekenning van een voordeel tot M. abscessus intracellulaire leven genen, werd een screening van een M. abscessus transposon mutant bibliotheek ontwikkeld. Daarnaast is een methode van RNA extractie van intracellulaire mycobacteriën na co cultuur met amoeben werd ontwikkeld. Deze methode was gevalideerd en stond de sequencing van hele M. abscessus transcriptomes binnen de cellen; verstrekken, voor de eerste keer, een globale visie op M. abscessus aanpassing aan intracellulaire leven. Beide benaderingen geven ons inzicht in de M. abscessus virulentiefactoren waarmee M. abscessus te koloniseren de luchtwegen bij de mens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genus Mycobacterium bevat soorten variërend van onschadelijk saprofytische organismen tot grote menselijke pathogenen. Bekende pathogene soorten zoals Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum en Mycobacterium ulcerans behoren tot de deelgroep van langzaam groeiende mycobacteriën (SGM). In contrast, de deelgroep van de snel groeiende mycobacteriën (RGM) wordt gekenmerkt door hun vermogen om te vormen van zichtbare kolonies in minder dan 7 dagen op de drager van de agar. De RGM groep bestaat uit meer dan 180 soorten, vooral niet-pathogene saprofytische mycobacteriën. Studies over RGM interacties met hun hosts hebben vooral geconcentreerd op Mycobacterium smegmatis en aantonen dat deze mycobacteriën worden snel geëlimineerd door de bactericide werking van macrofagen.

Mycobacterium abscessus behoort tot de zeldzame RGM die zijn pathogeen voor de mens en is verantwoordelijk voor een groot aantal infecties, variërend van de huid en weke delen infecties aan de longen en gedissemineerde infecties. M. abscessus wordt beschouwd als, samen met Mycobacterium avium, de belangrijkste mycobacteriële pathogen in cystic fibrosis patiënten1.

Diverse studies uitgevoerd op M. abscessus blijkt dat deze mycobacterium gedraagt zich als een intracellulaire pathogenen, staat overleven de bactericide reactie van macrofagen en fibroblasten in de longen en de huid, die meestal niet wordt nageleefd in RGM 2 , 3 , 4. de analyse van het genoom van de M. abscessus heeft geïdentificeerd stofwisselingsroutes meestal gevonden in milieu micro-organismen in contact met de bodem, planten en aquatische milieus, waar gratis amoeben vaak zijn presenteren5. Ze hebben ook aangetoond dat M. abscessus is begiftigd met verschillende virulentiegenen niet gevonden in de saprofytische en niet-pathogene RGM, waarschijnlijk overgenomen door de horizontale genoverdracht in een niche gunstig voor genetische uitwisseling die zou verzamelen verschillende amoeba resistente bacteriën.

Experimenteel, was een van de eerste opvallende resultaten de waarneming van intracellulaire groei van M. abscessus in macrofagen evenals wat M. tuberculosis6. M. abscessus verzet zich ook tegen de verzuring van de phagosome, apoptosis en autophagy, drie essentiële mechanismen van de cellulaire weerstand tegen de infectie2. Het is zelfs aangetoond dat M. abscessus is in staat om een directe communicatie tussen de phagosome en het cytosol, een meer voedselrijke omgeving die bacteriële vermenigvuldiging2 gunst misschien. Weinig is bekend over de genomic voordelen die M. abscessus bezit of heeft verkregen om te overleven in een intracellulaire milieu toestaan. Amoeba-coculture is een efficiënte methode waardoor het isolement van vele nieuwe amoeba resistente bacteriën zoals Mycobacterium massiliense7,8. Een mogelijkheid om zich te vermenigvuldigen in amoeben werd waargenomen, in een model van aerosolization van M. abscessus in muizen, die een verhoogde virulentie M. abscessus4kan verlenen. Een hypothese is dat M. abscessus genetische eigenschappen opgetreden binnen deze omgeving om te overleven in fagocytische cellen, die afwijken van andere niet-pathogene RGM had ontwikkeld. Deze acquisities wellicht de mogelijkheid om te verspreiden en de virulentie in de menselijke gastheer gunst.

Dit verslag beschrijft instrumenten en methoden om te benadrukken de genomic voordelen aan M. abscessus te overleven in de omgeving van de amoeben verleende uitvoeringsbevoegdheden betreft. Voor dit doel, de screening van M. abscessus transposon mutanten is voor het eerst beschreven, op de Acanthamoeba castellanii type stam, die het mogelijk de identificatie van de mutant defect intracellulaire groeimogelijkheden maakt. Een tweede screening in macrofagen is ook gemeld, om te bevestigen als dit gebrek de menselijke gastheer blijft. Ten tweede, om te begrijpen welke mechanismen worden ingezet in de M. abscessus aan te passen aan het leven in fagocytische cellen en verhoging van de virulentie van de dierlijke ontvangst, een methode die specifiek aangepast voor M. abscessus werd ontwikkeld, na co cultuur in aanwezigheid van de amoeben waardoor de extractie van totaal RNA van intra-amoebal bacteriën. Dientengevolge, werd een uitgebreid overzicht van M. abscessus genen die vereist voor een intracellulair leven zijn ontwikkeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. bibliotheek Screening

  1. Bouw van de mutant Tn -bibliotheek
    1. Een transposon bibliotheek te verkrijgen.
      Opmerking: Voor dit experiment, een mutant bibliotheek van transposon is verkregen uit E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. De bibliotheek werd gebouwd van een goede klinische stam (43S) van de M. abscessus complex (M. abscessus subsp. massiliense) met een phagemid binnengebracht M. abscessus waardoor het willekeurig inbrengen van één Tn in een TA dinucleotide (91,240 TA sequenties in het genoom van de M. abscessus ). Zie naslaginformatie van Rubin et al. voor meer details 9 en Laencina et al. 10.
  2. Titratie van de bibliotheek en de instandhouding van de M. abscessusTn mutanten in platen
    Let op: Dit duurt één week.
    1. Ontdooi de bibliotheek op het ijs. Bepaal de bacteriële concentratie door het uitvoeren van seriële verdunningen in 1 mL water (10-1 tot 10-15). Een daling van elke verdunning op een petrischaal met 7H 11 agar medium met 250 mg/mL kanamycine plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen.
      Opmerking: Hier, een titratie van 1011 bacteriën/mL werden teruggevonden.
    2. Na bepaling van de concentratie van de bibliotheek, de bibliotheek om een eindconcentratie van 3.000 bacteriën/mL 10 ml 25% glycerol-water te verdunnen. Aliquot de bibliotheek in 10 cryotubes met 1 mL van de bibliotheek in elke buis. Opslaan van de aliquots bij-80 ° C.
    3. Als u klaar bent om te gebruiken, ontdooi van een aliquoot gedeelte van het verdunde bibliotheek op ijs en voeg 100 µL van de bibliotheek aan 10 vierkante Mueller-Hinton (MH) agar platen (maat 12 cm) om te herstellen van 200 tot 300 afzonderlijke kolonies na 3-4 dagen incubatie bij 37 ° C.
    4. Met steriele tandenstokers, overdracht de afzonderlijke kolonies (ongeveer 6.000 kolonies in 60 x 96-wells-platen) in 96-wells-platen gevuld met 200 µL van 7H 9 medium aangevuld met 0,2% glycerol, 1% glucose, kanamycine 250 mg/mL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 dagen zonder schudden.
    5. Breng 100 µL van de cultuur (stap 1.2.4) aan een 96-wells-plaat met 100 µL van 7H 9 gemiddeld met 40% glycerol. Winkel de bestelde bibliotheek bij-80 ° C.
    6. Herhaal stap 1.2.3. naar 1.2.5. met de rest van de bibliotheek tot 10.000 individuele klonen worden hersteld (rond 100 x 96-wells-plaat en 30 MH platen).
  3. Voorbereiding van amoeben
    1. Cultuur amoeba Acanthamoeba castellanii (AC) in 75 cm2 weefselkweek kolven op kamertemperatuur (RT) in 30 mL PYG medium (tabel 1) voor versterking van de cel lijn11.
      Opmerking: De volwassen trofozoïeten uit grote zelfklevende cellen met talrijke spijsvertering Vacuolen zijn duidelijk zichtbaar op een microscoop. De cel verdubbeling tijd wordt geschat om 25 h. cellen werden versterkt om de 3 dagen door het verspreiden van eenderde van de oorspronkelijke cultuur in 75 cm2 weefselkweek kolven.
    2. Verwijder het medium van de PYG met een precisiepipet 25 mL. Wassen van de cellen met 10 mL AC buffer (tabel 2), die geen kooldioxide of stikstof bronnen12 bevat. Herhaal de twee keer meer wassen.
      Opmerking: AC buffer die geen koolstof of stikstof bronnen bevat vermijdt de extracellulaire groei van mycobacteriën. Dit minimum medium leidt tot de encystment van amoeben. Om deze limiet, warmte-geïnactiveerd E. coli werden als een substraat (stap 1.4) aan toegevoegd amoeben en zeer korte cultuur keer promoveerde (48u voor mutant screening) en 4 uur of 16 h cultuur voor RNAseq experimenten. U kunt ook gebruiken dit medium maar verrijkt met PYG medium (meestal 10%).
    3. Loskoppelen van de amoebe vanaf de onderkant van de kolf met een enkel krachtig schudden van de kolf weefselkweek.
    4. Cellen tellen met een hemocytometer aan te passen van de concentratie van de cel tot 5 x 105 amoeben/mL verdund in AC buffer.
  4. Voorbereiding van warmte-geïnactiveerd Escherichia coli bacteriën te voeden amoeba na infectie
    1. Groeien de E. coli klinische isoleren stam uit een voorraad van glycerol in 100 mL van de bouillon van de Luria (LB) 's nachts bij 37 ° C.
    2. Oogst de bacteriën door centrifugeren bij 1,835 x g gedurende 10 minuten in 50 mL tubes. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet met 10 mL 10% glycerol-water. Herhaal het tweemaal meer wassen.
    3. Resuspendeer de pellet met 5 mL 10% glycerol-water. Aliquot 0,5 mL in buizen van 1,5 mL. De hoeveelheid bacteriën/mL bepalen door uitvoeren van seriële verdunningen en toevoeging van verdunningen op LB agar platen. Opslaan van de aliquots bij-80 ° C.
    4. De dag vóór de amoeba infectie, één aliquot op ijs ontdooien en overgaan tot warmte-doden door de buis bij 70 ° C gedurende 60 min aan het broeden.
      Opmerking: Controleer de inactivatie door plating 100 µL van geïnactiveerde bacteriën op LB agar platen 's nachts bij 37 ° C. Geen koloniën moeten na één nacht van cultuur zichtbaar zijn.
    5. Verdun de bacteriën warmte-gedood bij een concentratie van 107 bacteriën in 50 µL van AC buffer en opslaan van de verdunde bacteriën bij 4 ° C gedurende maximaal één week.
  5. Co cultuur van amoeben -M. abscessus Tn mutant: eerste scherm
    Opmerking: Dit duurt 3-4 maanden voor de screening van 6.000 mutanten.
    1. 5 x 10,4 amoeben/putje aan een 96-wells-plaat in 100 µL van AC buffer verspreid. Incubeer gedurende 1 uur bij 32 ° C zonder schudden. De zwevende amoeba trophozoïtes tijd vast te houden aan de putten te geven.
      1. Tijdens het broeden, ontdooi bacteriën op ijs gedurende 1 uur.
    2. Voeg 5 µL van de culturen van de ontdooide bacteriën met een elektronische meerkanaalspipet. Infecteren voor 1,5 h. scherm rond 6.000 geïndividualiseerde klonen van de 96-wells-plaat Tn mutanten voorraad.
      Opmerking: De MOI is onbekend bij deze stap van het protocol; echter, alle van de 96-wells-platen met Tn mutanten werden gekweekt op precies dezelfde manier. Dit eerste scherm wil omschrijft intracellulaire gebrekkig mutanten, zonder te overwegen van de variaties in de entmateriaal-dichtheid.
    3. Na de 1,5 h van besmetting, omkeren de 96-wells-plaat op steriele gauzes in een gesteriliseerde metalen lade te verwijderen het AC medium onder een zuurkast geplaatst. Bijvullen met 200 µL van AC medium. Herhaal dit twee keer meer wassen.
    4. Voeg 200 µL van verse medium aangevuld met 100 µg/mL amikacin te heffen resterende extracellulaire mycobacteriën.
    5. Incubeer gedurende 2 uur voordat u verdergaat met 3 extra waswater (zoals beschreven in stap 1.5.3). Na het wassen, handhaven de culturen met 50 µg Mo/mL amikacin in 200 µL van AC buffer.
    6. 5 x 10,7 warmte-geïnactiveerd Escherichia coli bacteriën (uit stap 1.4) toevoegen aan het einde van de infectie en elke 24 uur om te voorkomen dat encystment van amoeben.
    7. Na 48u van co cultuur, lyse de cellen door 10 µL van 10% SDS (natrium dodecyl sulfaat) toe te voegen aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij 32 ° C. Doorgaan met de seriële verdunning en toevoegen op Columbia agar platen met 5% van het bloed van schapen (COS platen) om te evalueren van het aantal intracellulaire mycobacteriën. Afdichting van de plaat met de parafilm en Incubeer bij 37 ° C.
    8. Wanneer kolonies worden weergegeven op de agar platen na 3-4 dagen, foto van de plaat en identificeren van de mutanten verminderde intracellulaire groeimogelijkheden door het observeren van de deposito's met het laagste aantal bacteriële kolonies.
      Opmerking: Niet erg over de vorm, de hoogte of de dichtheid van de kolonie(Figuur 1). 136/6000 mutanten werden geïdentificeerd.
  6. Co cultuur van amoeben -M. abscessusTn mutant: tweede scherm van de mutanten vastgesteld tijdens het eerste scherm
    Let op: Dit duurt 2 weken. Een tweede scherm moet worden uitgevoerd met de 136 verzwakte mutanten verkregen na het eerste scherm te kwantificeren precies het aantal bacteriën geënt en het aantal intracellulair overleven bacteriën 2 dagen na infectie.
    1. Gegroeid van 1 kolonie van elke beïnvloed mutant in 50 mL buizen gevuld met 20 mL 7H 9 medium aangevuld met 0,2% glycerol, 1% glucose en 250 mg/mL kanamycine. Zodat de bacteriën te bereiken de exponentiële fase (0.6 < OD < 0.8).
    2. Het wassen van de cultuur door middel van centrifugeren (1,835 x g gedurende 10 minuten) in AC medium. Verwijder het supernatant. Herhaal dit wassen tweemaal meer met 20 mL 7H 9 medium aangevuld met 0,2% glycerol, 1% glucose en 250 mg/mL kanamycine.
    3. Resuspendeer de bacteriën in 5 mL AC buffer.
    4. Bepaal de kolonievormende eenheid (CFU) concentratie van de mutanten. In 24-Wells-platen, voeg 1 mL water naar de twee eerste rijen. Voeg 100 µL van de bacteriële suspensie aan het eerste putje. Meng met een micropipet, drie keer. Vervolgens gecombineerd 100 µL en storting op de tweede goed.
    5. Met een nieuwe tip, herhaalt u stap 1.6.4 uit de tweede put aan de derde, etc. tot de twaalfde goed.
    6. Gecombineerd 30 µL van de 10-12 -verdunning en toevoegen aan een COS plaat. Herhaal voor de andere verdunningen.
    7. Wikkel de COS plaat met parafilm en incubeer gedurende 3-4 dagen bij 37 ° C. Bepaal de concentratie door optelling van de kolonies.
    8. Co cultuur testen uitvoeren zoals hierboven beschreven in drievoud in een 24-well plaat met 5 x 10,4 amoeba per putje in 1 mL AC co kweekmedium. Enten met een menigvuldigheid van infectie (MOI) van 10.
    9. Na 48u van co cultuur, gaat u verder met de lysis van de cel zoals beschreven in stap 1.5.7. Uitvoeren van seriële verdunningen in water (10-1 op 10-6) en Voeg 30 µL aan de COS-platen. Incubeer de platen gedurende 4 dagen bij 37 ° C voordat u verdergaat met het CFU tellen.
      Opmerking: Na dit tweede scherm, 60 van 136 mutanten werden bewaard.
    10. Bewaar de mutanten beïnvloed voor hun voortbestaan in de cellen. Een kolonie toevoegen aan een cryotube met LB medium met glycerol (20% laatste) of in een cryotube met commerciële oplossing en microbeads gunst een instandhouding op lange termijn en toekomstige inoculatie vergemakkelijken en vervolgens opslaan bij-80 ° C.
    11. Beoordelen van de mutant groei in vitro door het meten van de optische dichtheid (OD) op 600 nm om de 2 dagen.
      1. Groeien 1 kolonie van elke beïnvloed mutant in 50 mL buizen gevuld met 20 mL 7H 9 medium aangevuld met 0,2% glycerol, 1% glucose en 250 mg/mL kanamycine. Zodat de bacteriën te bereiken de exponentiële fase (0.6 < OD < 0.8) vooraleer u de OD aan 0.01 om te beginnen de kinetiek.
      2. Uitsluiten van mutanten met een in vitro groei gebrek in vergelijking met de WT-stam uit de reeks van intracellulaire gebrekkig mutanten.
  7. Co cultuur van macrofagen -M. abscessus Tn mutant met gebreken voor het leven van een intra-amoeba
    Opmerking: Dit gaat 1 maand.
    1. 5 x 104 J774.2 lymfkliertest macrofagen per putje van de plaat van een 24-well in 1 mL van rijk medium, DMEM aangevuld met 10% van de foetale kalf Serum (FCS) verspreid. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2 toe macrofaag hechting. Bieden 3 wordt gerepliceerd.
    2. Het uitvoeren van de infectie. Inoculeer Tn mutanten, met een MOI van 10, verdund in DMEM met 10% FCS in een volume van 100 µL.
    3. Voer na 3 h van besmetting, drie wasbeurten met 1 mL DMEM (een vacuümpomp kan worden gebruikt). Vervolgens behandelen met 250 µg/mL amikacin, (in DMEM met 10% FCS) voor 1 h te heffen resterende extracellulaire mycobacteriën.
      1. Na 3 extra met 1 mL DMEM wast, handhaven de culturen in 250 µg/mL amikacin, (in DMEM met 10% FCS) tot een eindvolume van 1 mL ter voorkoming van extracellulaire mycobacteriële vermenigvuldiging.
    4. 72 uur na co cultuur, verwijderen van het medium en de macrofagen lyse door toevoeging van 1 mL koud water. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
    5. CFU tests uitvoeren op COS platen het aantal intracellulaire bacteriën te evalueren.
      1. In een 24-well plaat, voeg 1 mL water op de twee eerste rijen. Voeg 100 µL van de co cel lysate aan het eerste putje. Meng met een micropipet, drie keer. 100 µL gecombineerd en deponeren ze in de tweede goed.
      2. Met een nieuwe tip, herhaal de verdunning uit de tweede put aan de derde, etc. tot de twaalfde goed. Vervolgens gecombineerd 30 µL van de 10-12 -verdunning en toe te voegen aan een COS plaat.
      3. Herhaal voor de andere verdunningen. Wikkel de COS plaat met parafilm en wacht nog 3-4 dagen om te observeren en tellen van de koloniën.
  8. Identificatie en de sequencing van de site van inbrengen van de Tn in M. abscessus mutanten
    Opmerking: Dit gaat 1,5 maand voor 60 mutanten.
    1. Genomic extractie van de geïdentificeerde M. abscessus mutanten
      1. Groeien de mutanten in een tube van 50 mL met 20 mL 7H 9 medium aangevuld met 0,2% glycerol, 1% glucose en kanamycine 250 mg/mL tot exponentiële fase (OD600= 0.8).
      2. Oogst 10 mL van de culturen (2,396 x g, 5 min). Verwijder het supernatant. Opschorten van de bacteriën in 500 µL van oplossing I (25% sucrose, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL lysozym, 40 mM thioureum). Breng de oplossing kwantitatief over in 2 mL buisjes met schroefdop en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ° C.
      3. Voeg 500 µL van oplossing II (25% sucrose, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Na pipetteren omhoog en omlaag 5 - 10 keer, zirkonium kralen toevoegen tot een volume van 500 µL in de buis.
      4. Doorgaan met de lysis van de cel met een homogenizer (3 x 6000 rpm, 45 s) met een incubatie 1 min op ijs tussen elke ronde.
      5. Voeg 5 µL van 20 mg/mL proteïnase K (de finale van de 100 µg/mL) en Incubeer de monsters 's nachts bij 55 ° C.
      6. Voeg 1 mL koude van fenol/chloroform/Isoamylalcohol (25:24:1) onder een zuurkast. Meng de monsters door vortexing voordat u verdergaat met centrifugeren op RT en 16.500 x g gedurende 30 minuten.
      7. Na het centrifugeren, herstellen van de waterfase en voeg een gelijke hoeveelheid koud fenol/chloroform/Isoamylalcohol oplossing onder een motorkap toe. Centrifugeer de monsters bij 16.500 x g gedurende 30 minuten om te herstellen van de waterige fase opnieuw.
      8. 0.7 hoeveelheid RT isopropanol toevoegen aan de herstelde waterfase onder een zuurkast. Omkeren langzaam de buizen als u wilt toestaan dat DNA neerslag en incubeer 5 min op RT. Vervolgens Centrifugeer gedurende 10 min op 16.500 x g en RT.
      9. Verwijder het supernatant en wassen van de pellet met 500 µL van 70% ethanol onder een kap. Centrifugeer de buizen voor 10 min bij 16.500 x g bij RT voordat u verwijdert de ethanol. Incubeer gedurende 10 min om resterende alcohol verdamping.
      10. Ten slotte Suspendeer de pellet DNA in 100 µL van DNase/RNase gratis water. DNA opbrengst en zuiverheid DNA bepalen met een spectrofotometer.
      11. 1 µg genomic DNA en verteren met 10 U van ClaI voor één nacht voor sub-kloont de Tn invoeging site verwijderen. Fabrikant-protocol gebruiken.
        Opmerking: De Claik enzym is een van de hoogst vertegenwoordigde restrictie-enzymen in de M. abscessus genoom (2,173 beperkingsplaatsen). Een Claik beperkingsplaats wordt ook gevonden in de Tn volgorde stroomopwaarts van de cassette kanamycine weerstand van de Tn-mutant. Dus, de Claik-gemedieerde subcloning kan identificeren van de Tn invoeging site.
    2. Sub-kloont in een plasmide van genomic DNA met de Tn
      Opmerking: Voordat u verdergaat met de Tn-subcloning in de 2,686 bp pUC19 ampicilline-resistentie plasmiden, het toevoegen van een Claik beperkingsplaats in de site meerdere klonen van de plasmide. De volgorde van de plasmide pUC19 vindt u op deze link https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Volg fabrikant het protocol te verteren het plasmide pUC19 met EcoRik en HindIII, waarbij een fragment van 51 bp en een fragment van 2635 bp. zuiveren de dubbele verteerd vector met een commerciële PCR zuivering kit te elimineren van de 51 bp vrijgegeven fragment.
      2. Meng 1 µL (concentratie 25 pmol/µL) van twee complementaire oligonucleotides (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' en 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') van 28 bp elk bevatten de Claik beperkingsplaats en aan de uiteinden de HindIII en EcoR Ik beperkingsplaatsen. Verhit bij 100 ° C gedurende 10 min en vervolgens afkoelen om te binden.
      3. Verteren de gepaarde inleidingen door EcoRik en HindIII volgens protocol van de fabrikant.
      4. Afbinden 150 ng van EcoRik /HindIII-beperkte pUC19 plasmide met verschillende concentratie van gepaarde inleidingen (50 pmol/µL, 25 pmol/µL, 2.5 pmol/µL) gedurende 1 uur bij RT met 1 U van T4 DNA ligase in een eindvolume van 20 µL. Check het klonen door een andere enzymatische spijsvertering.
      5. De gemodificeerde plasmide met Claverteren ik gedurende 2 uur bij 37 ° C.
      6. Afbinden 50 ng van Claik-beperkt pUC19plasmide en 50 ng van genomic DNA verteerd door Claik voor 1 h bij RT met 1 U van T4 DNA ligase in 10 µL.
      7. Ga verder met E. coli electrocompetent bacteriën transformatie met 5-10 µL van de afbinding (2500 V, 200 Ohm, 25 µF). Selecteer het klonen op LB agar platen aangevuld met 50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL ampicilline te selecteren van de bacterie plasmiden met delen van Tn sequenties dragen.
      8. 'S nachts resistente klonen in LB vloeibaar medium met de juiste antibiotica selectie (50 µg Mo/mL kanamycine en 50 µg Mo/mL ampicilline) groeien.
      9. Uittreksel plasmide DNA. Controleren van de aanwezigheid van het donormateriaal door enzymatische restrictie en volgorde van de 3'-eind van de Tn te identificeren van het verstoorde gen met een oligonucleotide (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') overeenkomt met de laatste 17 baseparen van de Tn kanamycine weerstand cassette.
      10. De reeks tegen de M. abscessus gaan 06 stam uitlijnen door het uitvoeren van een nucleotide explosie (BLAST-N).

2. RNA extractie van intracellulaire mycobacteriën voor Rnaseq analyse

Opmerking: Dit gaat 4 maanden voor experimenten en 4 maanden voor RNAseq analyse.

  1. Co cultuur van amoeben-M. abscessus in batches
    Opmerking: In het volgende experiment, co cultuur is uitgevoerd in 50 mL buisjes met agitatie om de gunst van bacteriën naar cel contactpersonen.
    1. Groeien van M. abscessus in 7 H 9 medium aangevuld met 0,2% glycerol, 1% glucose naar de mid-exponentiële fase van 120 toeren per minuut.
    2. Wassen van de bacteriën tweemaal met 10 mL AC buffer.
    3. Schatten van de concentratie bacteriën door het meten van de OD600nm (1 OD600= 4 x 108 mycobacteriën). 8,5 x 108 mycobacteriën aan 8.5 x 106 amoeben in 10 mL van AC medium toevoegen.
    4. Incubeer gedurende 1 h bij 30 ° C met zachte agitatie (ongeveer 80 rpm).
    5. Oogsten van de cellen door centrifugatie bij 253 x g gedurende 12 min. Verwijder het supernatant en de cellen in 10 mL AC buffer op te schorten. Herhaal dit twee keer meer wassen.
    6. Resuspendeer de cellen in 10 mL AC buffer met 50 µg Mo/mL amikacin te elimineren extracellulaire bacteriën en incubeer gedurende 4 h bij 30 ° C met zachte agitatie (80 rpm). De cellen nogmaals twee keer wassen.
  2. Extractie van totaal RNA van intracellulaire M. abscessus
    Opmerking: Voer stappen 2.2.1–2.2.3 onder de zuurkast als gevolg van het gebruik van giftige reagentia.
    1. Na het laatste waswater, resuspendeer de besmette amoeben in 4 mL koude oplossing III (tabel 3) met gebruik 280 µL van β-mercaptoethanol amoeben verstoren. Dit is de guanidinium kaliumthiocyanaat (GTC) stap. De opschorting op ijs voor 10 min. Centrifuge de cel lysate voor 30 min op 2,396 x g - en 4 ° C handhaven om de vrijgegeven intracellulaire bacteriën pellet.
    2. Verwijder het supernatant en Suspendeer de bacteriële pellet in 1 mL koude oplossing III. Oogst de bacteriën bij 2396 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet in 1 mL van de extractie buffer en de overdracht in een tube van 2 mL schroef met Zirkonium kralen (tot de 500 µL gradatie van de buis). Opslaan van de buizen gedurende ten minste 24 uur bij-80 ° C.
      Opmerking: Opslag in het reagens lysis toelaat de inactivering van RNases en cel ontbinding.
    3. Wanneer klaar voor gebruik, monsters op ijs ontdooien en lyse hen met een homogenizer door het uitvoeren van twee rondes bij 6000 t/min voor 25 s, gevolgd door een ronde bij 6000 t/min voor 20 s met een incubatie 1 min op ijs tussen elke ronde.
    4. Om het monster afkoelen, broeden ze op het ijs gedurende 10 minuten. Voeg dan 200 µL van chloroform in Isoamylalcohol verdund. Na vortexing Centrifugeer de monsters voor 1 min, gedurende 15 min op 16.500 x g - en 4 ° C.
    5. Voeg 0.8 mL koude isopropanol tot de waterfase en Incubeer de monsters gedurende 2-3 uur bij 20 ° C. Centrifugeer de monsters gedurende 35 min. op 16.500 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant.
    6. Wassen van de RNA-pellet door 500 µL van koude 70% ethanol toe te voegen (niet vermengen).
    7. Centrifugeer de monsters bij 16.500 x g gedurende 10 minuten om de ethanol. De oplossing gecombineerd en droog in een centrifugaal concentrator.
    8. Eenmaal gedroogd, resuspendeer de pellets in 100 µL van DNase/RNase gratis water.
      Opmerking: Monsters moeten behandeld worden tweemaal met DNases om te verwijderen van DNA verontreinigingen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    9. Beoordelen van de RNA-integriteit op een agarose gel en bevestigen door het meten van het RNA integriteit nummer (RIN) en de ribosomal verhouding met een capillaire elektroforese chip gebaseerde methode.
      Opmerking: De RIN rekening houdt met de gehele elektroforetische trace. De RIN algoritme van de software voorziet in de classificatie van totale RNA, gebaseerd op een nummering van 1 tot en met 10, met 1 wordt het meest gedegradeerde profiel en 10 wordt de meest intact. Om verder te gaan met de voorbereiding van cDNA Bibliotheek, moet de RINs over 8 en de ribosomal verhouding [28/18S] zo hoog mogelijk te houden, de ideale waarde 2 wordt, afhankelijk van het organisme en haar specifieke kenmerken.
    10. RNA samples bij-80 ° C bewaren tot voorbereiding van de cDNA Bibliotheek voor het rangschikken.
  3. Voorbereiding van de cDNA Bibliotheek
    1. Gebruiken om verder te gaan met de voorbereiding van de bibliotheek, een commercieel beschikbare cDNA synthese kit (Tabel of Materials) met behulp van de fabrikant-protocol.
    2. Controleer de bibliotheek voor concentratie en kwaliteit op een DNA-Chip.
      Opmerking: Meer precieze en accurate kwantificering kan worden uitgevoerd met gevoelige TL gebaseerde kwantificatie testen.
  4. Bibliotheek sequencing
    1. Normaliseren van de monsters naar 2 nM en overgaan tot multiplexing volgens de organisatie van de cel stroom.
    2. Denatureren van de monsters bij een concentratie van 1 nM 0.1 N NaOH gebruiken voor 5 min op RT.
    3. Verdun de monsters om 10 pM. Elk monster op de cel die stroom laden om 10 pM.
    4. Doorgaan met sequencing met een hoge gegevensdoorvoer rangschikkend systeem waarmee grootschalige genomica. Hier de run was een SRM-run (SR: enkel lezen, PE: gekoppeld-einde leest, M: multiplexed monsters) van 51 cycli met 7 index honken lezen.
    5. Beoordeling van de kwaliteit van de sequencing met de externe FastQC programma13.
    6. Na het wegsnijden van adapter sequenties, doorgaan met lees afstemmingen tegen een verwijzing genoom. Uitlijnen tegen de eukaryote cel genoom te beoordelen van de verontreiniging van de steekproef en, indien nodig, ga verder met het wegsnijden van de niet-bacteriële luidt.
  5. Statistische analyse
    1. Gebruik verschillende software programma's beschikbaar online sets van differentially uitgedrukte genen definiëren: R software, Bioconductor pakketten met inbegrip van DESeq2 en het PF2tools-pakket (versie 1.2.12) op het platform ontwikkeld "Transcriptome et Epigénome" (Pasteur Instituut, Parijs).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. abscessus heeft de mogelijkheid om te weerstaan en de bactericide reacties van macrofagen en milieu protozoa zoals amoeben ontsnappen. M. abscessus spreekt virulentiefactoren als volwassen in contact met de amoeben, waardoor het meer virulente in muizen4. De eerste doelstelling van deze methoden is om de huidige in M. abscessus waardoor de overleving en de vermenigvuldiging binnen amoeben genen te identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gedrag van de M. abscessus is veel meer vergelijkbaar met het gedrag van pathogene SGM zoals M. tuberculosis dan elke andere mycobacteriën behorend tot RGM2. Het belangrijkste element in de pathogeniteit van SGM is hun vermogen om te overleven of zelfs binnen antigeen-presenteren cellen, zoals macrofagen en dendritische cellen vermenigvuldigen.

M. abscessus heeft bepaalde genomic voordelen verworven, zoals blijkt uit de totale sequentie va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen sterk Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) voor het kostbare geschenk van de mutant bibliotheek en Dr. Ben Marshall (faculteit geneeskunde, Universiteit van Southampton, UK) voor de correcties van het manuscript. Wij erkennen sterk de Franse patiënt vereniging voor Cystic Fibrosis "Vaincre la Mucoviscidose" en "L'Association Gregory Lemarchal" voor hun financiële steun (RF20150501377). Wij danken ook het Nationaal Agentschap voor onderzoek (ANR programma DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)), en de Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) voor de financiering van de postdoctorale fellowship tot V.L-M. L. L. is een doctoraal fellow van de "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van materiaal/ apparatuur
24-well platenThermofisher11874235
96-well platenThermofisher10687551
Beadbeater BertinPrecellys 24
BioanalyzerAgilent
Genepulser XcellBiorad
Nanodrop spectrofotometer 2000Thermofisher
QuBit fluorometerThermofisherQ33226
zirconium kralen/silica kralenBiospec products11079101ZKralen
Naam van reagens/cellen
Acanthamoeba castellanii ATCC30010stam
Amikacin Mylan150927-Apoeder
B-mercaptoethanol Sigma-AldrichM6250oplossing
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% granulair watervrij
Chloroform Fluka25666oplossing
ClaI enzymNew England BiolabsR0197Senzym
Columbia agar Biomerieux4304190 mm
D-GlucoseSigma-AldrichG8270 poeder
DMEM Thermofisher11500596medium
DNase en RNase vrij water Invitrogen10977-035oplossing
E. coli elektrocompetent Thermofisher18265017bacteriën
EDTASigma-AldrichE4884poeder
Escherichia coli Klinische isolaatpersoonlijke voorraadbacteriën
Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-40sulfaatoplossing 4% waterig
Fetaal runder serumGibco10270serum
GlycerolSigma-AldrichG5516oplossing
Guanidium thiocyanaat EuromedexEU0046-Dpoeder
Isopropanol Sigma-AldrichI9516oplossing
J774.2 macrofagenSigma-AldrichJ774.2Stam
kanamycin Sigma-Aldrich60615poeder
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Monobasisch, watervrij
LB vloeibaar medium Invitrogen12795-027poeder
LysozymRoche10837059001poeder
MgSO4LabosiM275pur
Microbank TM (cryotubes met kralen)Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 mediumSigma-AldrichM0428poeder
Middlebrook 7H9 mediumThermofisher11753473poeder
Müller-Hinton agarBiorad3563901poeder
N-Lauryl-sarcosinaatMerckS37700 416poeder
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
Fenol/chloroform Sigma-Aldrich77617oplossing
Proteinase KThermofisherEO0491poeder
proteose peptonBD211684enzymatisch verteerd dierlijk weefsel
pUC19 plasmideNew England Biolabs54357plasmide
SDS  20%Biorad1610418oplossing
NatriumcitraatCalbiochem567446poeder
ThioureumSigma-Aldrich88810poeder
TrisSigma-Aldrich154563poeder
Trizol Thermofisher12044977oplossing
Tween 80Sigma-AldrichP1754 oplossing
Gist extract BD212750
Kit
AMBION DNase kit Thermofisher10792877kit
DNA Agilent ChipAgilent5067-1504kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit ThermofisherK0503kit
PureLink PCR Purification kitInvitrogenK310001kit
Quant-It" assays kitThermofisherQ33140/Q32884kit
T4 DNA ligase InvitrogenY90001kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kitIllumina15032611kit

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055(2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834(2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121(2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939(2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529(2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Amoebenscreening van mutantbibliothekenRNA extractietranscriptomanalysevirulentiefactorenintracellulair levengastheer pathogeeninteractie

Gerelateerde artikelen