Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Licht vel fluorescentie microscopie is wijd verbeid gebruikt voor snelle Beeldacquisitie met een hoge axiale resolutie van micrometer op millimeter schaal. Traditionele licht vel technieken omvatten het gebruik van een interne verlichting lichtbundel orthogonaal gericht monster weefsel. Beelden van grote monsters die worden geproduceerd met behulp van een interne verlichting straal bevatten strepen of artefacten en lijden aan een lagere resolutie als gevolg van de verstrooiing en absorptie van licht door het weefsel. Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting lichtbundel en een vereenvoudigde duidelijkheid optische techniek voor het lymfkliertest hart wissen. Deze technieken zorgen voor diepere beeldvorming door het verwijderen van lipiden uit het hart en produceren van een groot gebied van imaging, groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3. Dientengevolge, deze strategie ons in staat stelt te kwantificeren van de ventriculaire afmetingen, bijhouden van de cardiale bloedlijn en lokaliseren van de ruimtelijke spreiding van de cardiale-specifieke proteïnen en ionenkanalen van de postnatale aan volwassen muis hart met voldoende contrast en resolutie.
Inleiding
Licht vel fluorescentie microscopie was een techniek die in 1903 voor het eerst ontwikkeld en vandaag wordt gebruikt als een methode om te studeren van genexpressie en ook om 3D- of 4-D modellen van weefsel monsters1,2,3te produceren. Een dun blad van licht deze beeldvorming methode gebruikt voor het verlichten van een enkel vliegtuig van een sample zodat alleen dat vliegtuig is vastgelegd door de detector. Het monster kan vervolgens worden verplaatst in de axiale-richting te vangen elk layer, een sectie op een moment, en het renderen van een 3D-model na de nabewerking van de beelden van de verworven4. Echter als gevolg van de absorptie en verstrooiing van fotonen, heeft LSFM is beperkt tot monsters die ofwel een paar microns dik of optisch transparant1.
De beperkingen van LSFM hebben geleid tot uitgebreide studies van organismen die weefsels die optisch transparant zijn, zoals de zebravis hebben. Studies waarbij cardiale ontwikkeling en differentiatie worden vaak uitgevoerd op zebrafish aangezien er geconserveerde genen tussen mens en zebrafish5,6. Hoewel deze studies hebben geleid tot vooruitgang in de cardiale onderzoek met betrekking tot hartziekten6,7, moet er nog een soortgelijk onderzoek op een hoger niveau organismen zoals zoogdieren.
Zoogdieren cardiale weefsel uitdaging een vanwege de dikte en de opaciteit van het weefsel, de absorptie te wijten aan hemoglobine in rode bloedcellen en de striping die optreedt als gevolg van ' single-sided verlichting van het monster onder traditionele LSFM methoden1 , 8. om te compenseren voor deze beperkingen, hebben wij voorgesteld om tweezijdig verlichting en een vereenvoudigde versie van de duidelijkheid techniek9 gecombineerd met een brekingsindex bijpassende oplossing (velgen) te gebruiken. Dus, dit systeem zorgt voor de beeldvorming van een steekproef die groter is dan 10 x 10 x 10 mm-3 terwijl het handhaven van een goede kwaliteit-resolutie op de axiale en laterale vliegtuigen8.
Dit systeem werd eerst gekalibreerd met behulp van fluorescerende kralen gerangschikt in verschillende configuraties binnen de glazen buis. Het systeem werd vervolgens gebruikt om het imago van postnatale en volwassen lymfkliertest harten. Ten eerste was het postnatale muis hart beeld op 7 dagen (P7) te onthullen de ventriculaire Holte, de dikte van de ventriculaire muur, de structuren van de klep en de aanwezigheid van trabeculation. Ten tweede, een studie werd uitgevoerd om cellen die in cardiomyocytes onderscheiden zou met behulp van een postnatale muis hart op 1 dag (P1) met Cre-geëtiketteerden cardiomyocytes en gele fluorescerende eiwit (YFP). Tot slot werden volwassen muizen op 7,5 maanden beeld om te zien hoe de aanwezigheid van renale buitenste Wallenberg kalium (ROMK) kanalen na gene therapie8.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met betrekking tot het gebruik van dieren zijn goedgekeurd door de institutionele beoordeling commissies (IACUC) aan de Universiteit van Californië, Los Angeles, Californië.
1. imaging System Setup
Opmerking: Zie Figuur 1 en Figuur 2.
- Ophalen van een continuous wave (CW) laser met 3 golflengten: 405 nm, 473 nm, en 532 nm. Plaats 2 spiegels (M1 en M2) 150 mm uit elkaar en sluiten ze bij hun spiegel vliegtuigen op 45° naar lichtbundels.
Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd voor het omleiden van de laser uit de buurt van de tweezijdig verlichting setup. De resulterende lichtbundel zullen in dezelfde richting als de eerste bundel. - Passeren van de lichtbundel door middel van een 25-mm diameter iris diafragma/gaatje (PH), een diameter van 50-mm filter met neutrale dichtheid (NDF) met een bereik van de optische dichtheid van 0 - 4.0, een bundel expander (BE), een 30 mm gleuf (S) met de breedte van ~ 0 - 6 mm, en een spiegel (M3) , alle 150 mm van elkaar gepositioneerd. Plaats de spiegel met haar spiegelvlak 45 ° naar lichtbundels.
- Het doorgeven van de lichtbundel door middel van een 50:50 balk splitter geplaatst 150 mm bevinden van M3. Plaats een spiegel (M6) 150 mm bevinden van de balk splitter en uitlijnen zodat haar spiegelvlak op 45° naar de balk die wordt uitgestoten in de voorwaartse richting. Gebruik de teruggekaatste lichtbundel om te vormen van één kant van het lichte blad van dual-verlichting.
- Plaats een spiegel (M4) 150 mm bevinden van de balk splitter en uitlijnen zodat haar spiegelvlak is 45 ° naar lichtbundels die in een hoek van 90° van de balk splitter werd uitgestoten. Plaats een tweede spiegel (M5) 150 mm bevinden van M4 en uitlijnen zodat haar spiegelvlak op 45° naar het licht weerkaatst door M6. Gebruik de bundel uitgezonden van M5 om te vormen van de tweede kant van het lichte blad van dual-verlichting.
- De tweezijdig verlichting systeem in een symmetrische mode ingesteld (Zie Figuur 1). Plaats een cilindrische lens (CL1) [diameter (d) = 1; brandpuntsafstand (f) = 50 mm] 150 mm in overeenstemming met de bundel uitgezonden van M5 aan één kant en een andere identieke cilindrische lens (CL2) 150 mm in overeenstemming met de lichtbundel door M6 aan de andere kant van de dual-verlichting-setu uitgestoten p. plaats 2 spiegels (M7 en de M8) elke in overeenstemming met de cylindrische lenzen op afstanden van 50 mm aan de lichtbundel op 90 °.
- Vormen een achromatische doublet uit een paar lenzen. Plaats de eerste lens, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm van de M7 en de tweede lens, L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm van L1. Herhaal dat dit aan de andere kant van de dual-verlichting met identieke lenzen (L3, L4) dezelfde afstand tot M8 geplaatst.
- Plaats spiegels, M9 en M10, 60 mm van lenzen L2 en L4, respectievelijk, en in overeenstemming met de lichtbundel. Plaats de doelstellingen van de verlichting, OL1 en OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm van de M9 en M10 en in overeenstemming met de lichtbundel. De lichtbundel uitgestoten uit de doelstellingen vormt het lichte blad voor beeldvorming van de monsters.
- Een 3D-printer gebruiken om af te drukken van de monsterhouder van acrylonitril-butadieen-styreen (ABS). Het insluiten van een stuk cover glas [brekingsindex (RI) = 1.4745] aan iedere kant van de zaal, loodrecht op de straal van de verlichting, om te minimaliseren brekingsindex mismatching. Gelijkmatig plaats de kamer tussen de balken uitgestoten uit de objectieven.
- Installeer een stereomicroscoop met een 1 X vergroting doelstelling en een wetenschappelijke aanvullend metalen zuurstofverbinding semiconductor (sCMOS) camera loodrecht op de verlichting vliegtuig (Zie Figuur 2).
2. imaging systeem kalibratie
- Ophalen fluorescerende polystyreen kralen die 0.53 micrometer in diameter.
- Het monster fluorescerende kraal bereid door verdunning van de kraal-oplossing in een passende oplossing voor brekingsindex (velgen) met 1% laag-smelt aanwijsapparaat agarose te 1:150, 000. Knip een stukje van borosilicaatglas slang met een binnendiameter van 12 mm en een buitendiameter van 18 mm tot een lengte van 30 mm.
Opmerking: De borosilicaatglas slang wordt gebruikt om te voldoen aan de brekingsindex (1.47). - Meng het monster van de verdunde kraal met 1% agarose en Pipetteer de parel/agarose-oplossing in de borosilicaat-buis. Laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur (23 ° C).
- Vul de ABS-zaal (uit stap 1.7) met een 99,5% glycerol-oplossing. Plaats de borosilicaatglas slang bevattende de bolletjes in de kamer. Plaats de ABS-zaal in de imaging systeem, zodat er in het midden van de Gaussiaanse bundel gemaakt door de dubbele verlichting systeem.
- Een 3D-gemotoriseerde translationeel stadium hechten aan de borosilicaatglas slang om controle van de beweging en de richting van het monster in de vergaderzaal van de ABS (Zie aanvullende figuur 1).
- Verwerven van beelden met behulp van de sCMOS camera met een snelheid van 30 frames per seconde (fps). Met behulp van de motorcontroller, het monster 1 mm in zijdelingse richting bewegen en verwerven van beelden bij elke toename van de 1-mm met behulp van de sCMOS camera. Totdat het gehele monster heeft zijn beeld.
- Stapelen van de verworven afbeeldingen via een visualisatie software (Zie Tabel van materialen). Meet het punt verspreiden functie (PSF) van het systeem met behulp van deze beelden van de kraal. Gebruik deze PSF voor deconvolutie tijdens de beeldverwerking in latere stappen.
3. de monstervoorbereiding
- Ontleden van harten uit een wild type P1 muis en een dubbel heterozygoot sarcolipin-Cre knockin muis met de Rosa26-YFP gen (SlnCre / +; R26YFP verslaggever / +) op P7.
Opmerking: Euthanasie werd uitgevoerd met behulp van pentobarbital en de techniek beschreven door Robbins et al. 10. de dissectie werd uitgevoerd volgens de techniek beschreven door de National Heart, Lung en Blood Institute (NHLBI)10,11. - Uitvoeren van een chemische stof ruimen van de lymfkliertest harten, zoals beschreven door Kevin Sung et al. 12.
Opmerking: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een zuurkast omdat de chemische stoffen die worden gebruikt giftig zijn.- Spoel de harten in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 3 x gedurende 10 minuten. Na het spoelen, plaatst u de harten in een 4% paraformaldehyde-oplossing en na een nacht bebroeden deze monsters bij 4 ° C.
- Leg de monsters in een 4% acrylamide oplossing met 0,5% w/v van 2, 2'-Azobis-dihydrochloride. Toestaan dat de monsters na een nacht bebroeden bij 4 ° C. Na de overnachting incubatie, verwijderen van de monsters en hen Incubeer bij 37 ° C gedurende 2-3 uur.
- Spoel de monsters met PBS en plaats ze in een oplossing van 8% w/v natrium dodecyl sulfaat en boorzuur van 1,25% w/v. Incubeer de monsters bij 37 ° C totdat ze duidelijk zijn. Dit kan enkele uren duren afhankelijk van de dikte van het monster. Na wissen, verwijderen van de monsters en plaats ze in 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing voor 1 dag.
- Bereiden van een bijpassende oplossing met 40 g van nonionic dichtheid kleurovergang medium brekingsindex (Zie Tabel van materialen) in 30 mL 0,02 M fosfaatbuffer (PB), 0,1% Tween-20 en 0,01% natriumazide. Breng de oplossing aan een pH van 7.5 met natriumhydroxide.
- Leg het gewiste monster in velgen met een brekingsindex van 1.46-1,48 en 1% agarose. Het monster invoegen borosilicaatglas slang en laat de agarose te stollen bij kamertemperatuur (23 ° C).
- Een 3D-gemotoriseerde translationeel stadium hechten aan de borosilicaatglas slang om de beweging te controleren en richting van het monster in de 3-D afgedrukt ABS kamer (Zie aanvullende figuur 1).
4. volwassen hart Imaging
- Injecteren 8,7 x 1012 virussen van het type adeno-associated virus vector 9 (AAV9) met daarin een promotor van de cardiale-specifieke troponine T (cTnT) en de groen fluorescente proteïne (GFP) in een volume van 100-μL in de ader van de staart van de muis van een 2 maanden durende wild type (C57BL/6).
Opmerking: De AAV9 is ontwikkeld volgens de techniek beschreven door Yuan et al. 13. Hierdoor GFP te binden aan het renale buitenste Wallenberg kalium kanaal (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP produceren (Zie Tabel van materialen). - De volwassen muis harten ontleden op 7,5 maanden oud volgens de techniek beschreven door de NHLBI11. Voorbereiding van de monsters met behulp van stappen 3.1-3.3.
- De motorcontroller verbinden met de motor actuator. De bedieningssleutel hechten aan de borosilicaatglas slang om de beweging te controleren en oriëntatie van het monster in de 3-D afgedrukt ABS kamer.
- Plaats het monster zodat er in het midden van de Gaussiaanse bundel gemaakt door de dubbele verlichting systeem. Verwerven van beelden met behulp van de sCMOS camera met een snelheid van 100 fps.
- Met behulp van de motorcontroller, het monster 1 mm in axiale richting bewegen en afbeeldingen op elke 1-mm increment verwerven met de camera van de sCMOS. Totdat het gehele monster heeft zijn beeld.
Opmerking: Het systeem wordt beheerd door een aangepaste ontwikkelde instrument-control software. - Stapelen van de verworven afbeeldingen via een visualisatie software (Zie Tabel van materialen). Ontwikkelen van 3D-beelden met behulp van deze afbeeldingsstapels en de visualisatie software14. Deconvolve de PSF van stap 2.6 met de verworven afbeeldingsstapel. Stel een pixelwaarde van de drempel intensiteit te observeren de contouren van het hart en pseudo-kleur toevoegen aan de afbeeldingen op basis van de intensiteit van deze grijs-schaal.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De techniek beschreven gebruikt hier een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing van muis hart weefselsteekproeven te komen tot een diepere imaging diepte en een grotere beeldvorming volume met voldoende grafische resolutie (Figuur 1). Als u wilt kalibreren van het systeem, werden fluorescerende kralen geplaatst in de glazen buis en binnen het imaging systeem. De parels werden vervolgens beeld en gevisualiseerd in de x-y vla...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het LSFM systeem en de hier beschreven techniek maakt gebruik van een tweezijdig verlichting lichtbundel, gecombineerd met een optische clearing naar afbeelding het hart van de muis in postnatale en volwassen stadia van haar ontwikkeling. Een traditionele interne verlichting straal lijdt aan foton verstrooiing en absorptie via dikker en groter weefsel monsters1,3. De tweezijdig balken zorgen voor een gelijkmatiger verlichting van het monster, aldus het minimalise...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs wil dankbaarheid uiten aan Thao Nguyen en Atsushi Nakano uit UCLA voor het verstrekken van het monster van de muizen naar afbeelding. Deze studie werd ondersteund door subsidies NIH HL118650 (naar Tzung K. Hsiai), HL083015 (naar Tzung K. Hsiai), HD069305 (te N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (aan Tzung K. Hsiai en N. C. Chi), HL129727 (naar Tzung K. Hsiai) en Universiteit van Texas systeem "STARS" financiering (Juhyun Lee).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitatie van fluoroforen |
| Neutraal dichtheidsfilter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Beheert hoeveelheid licht dat het systeem binnenkomt |
| Achromatische straaluitbreider | Thorlabs | GBE05-A | Breidt de lichtstraal uit |
| Mechanische spleet | Thorlabs | VA100C | Beheert de breedte van de straal |
| Straalverdeler | Thorlabs | BS013 | Vormt dubbele verlichtingsstraal |
| Stereomicroscoop met 1X objectieflens | Olympus | MVX10 | Wordt gebruikt voor het observeren van het monster |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS-camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Wordt gebruikt om afbeeldingen vast te leggen |
| Acrylonitrile butadieen styreen (ABS) | Stratasys | uPrint | Materiaal dat wordt gebruikt om een monsterhouder 3D te printen |
| Fluorescente polystyreenkralen | Spherotech Inc | PP-05-10 | Wordt gebruikt voor kalibratie van beeldvormingssysteem |
| Borosilicaatglasbuis | Corning | Pyrex 7740 | Buis voor monsterinbedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Vulling voor monsterkamer |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing | Fisher Scientific | BP39920 | Spoelvloeistof voor muizenharten |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | Eerste incubatieoplossing |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Gemengd met 2,2'-Azobis dihydrochloride voor tweede incubatieoplossing voor muizenharten |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Gemengd met Acrylamide voor tweede incubatieoplossing voor muizenharten |
| Natriumdodecylsulfaat | Sigma Aldrich | 71725 | Gemengd met Boorzuur voor derde incubatieoplossing voor muizenharten |
| Boorzuur | Fischer Scientific | A74-1 | Gemengd met Natriumdodecylsulfaat voor derde incubatieoplossing voor muizenharten |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Gemengd met PB, Tween-20 en Natriumazid als een brekingsindexaanpassingsoplossing |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Gemengd met Sigma D2158, PB en Natriumazid als een brekingsindexaanpassingsoplossing |
| Natriumazid | Sigma Aldrich | S2002 | Gemengd met Sigma D2158, PB en Tween-20 als een brekingsindexaanpassingsoplossing |
| Adeno-geassocieerd virusvector 9 met een hartspecifieke Troponin T-promotor gelabeld met GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Drukt GFP uit wanneer het is gebonden aan ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Wordt gebruikt voor beweging van het monster in axiale richting binnen het lichtblad |
| K-Cube geborstelde DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Verbindt met motoractuator en regelt de beweging van de actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualisatiesoftware voor het produceren van 2D- en 3D-beelden |
Referenties
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209(2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- National Heart, L., Blood Institute, Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736(2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, Amira User's Guide. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
