Eencellige kwantificatie van mRNA en oppervlak eiwituitdrukking in Simian Immunodeficiëntie Virus-geïnfecteerde CD4+ T cellen geïsoleerd van Rhesus Makaken

Summary

Beschreven is een methode om te kwantificeren van de expressie van genen die 96 en 18 oppervlakte eiwitten door afzonderlijke cellen ex vivo, waardoor voor de identificatie van differentially uitgedrukte genen en proteïnen in virus-geïnfecteerde cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen. Passen we de aanpak van de studie SIV-geïnfecteerde CD4⁺ T cellen geïsoleerd van rhesus makaken.

Abstract

Eencellige analyse is een belangrijk instrument voor het ontleden van heterogene populaties van cellen. De identificatie en de isolatie van zeldzame cellen kunnen moeilijk zijn. Om te overwinnen deze uitdaging, een methodologie combineren geïndexeerd stroom cytometry en high-throughput multiplexed kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR) werd ontwikkeld. Het doel was om te identificeren en te karakteriseren simian immunodeficiëntie virus (SIV)-geïnfecteerde cellen aanwezig binnen rhesus makaken. Via de kwantificatie van oppervlakte-proteïne door fluorescentie-activated cell sorting (FACS) en mRNA door qPCR, worden virus-geïnfecteerde cellen geïdentificeerd door virale genexpressie, die wordt gecombineerd met host gen- en eiwit metingen een multidimensionale profiel maken . We noemen de aanpak, gerichte eencellige Proteo-transcriptionele evaluatie of tSCEPTRE. Voor het uitvoeren van de methode, zijn levensvatbare cellen gekleurd met fluorescerende antilichamen specifiek voor oppervlakte markeringen gebruikt voor FACS isolatie van een deelverzameling van de cel en/of downstream fenotypische analyse. Afzonderlijke cellen worden gevolgd door onmiddellijke lysis, multiplex omgekeerde transcriptie (RT), pre PCR versterking en hoge doorvoer qPCR van maximaal 96 afschriften gesorteerd. FACS metingen worden geregistreerd op het moment van het sorteren en vervolgens gekoppeld aan het gen expressie gegevens door goed positie om een gecombineerde eiwit en transcriptionele profiel te maken. Om te studeren SIV-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo, cellen werden geïdentificeerd door qPCR detectie van meerdere virale RNA-soorten. De combinatie van virale afschriften en de hoeveelheid van elk bieden een kader voor de indeling van cellen in verschillende fasen van de virale levenscyclus (b.v., productieve versus niet-productieve). Bovendien waren de tSCEPTRE van SIV⁺ cellen ten opzichte van niet-geïnfecteerde cellen geïsoleerd van het zelfde model host differentially uitgedrukte genen en eiwitten te beoordelen. Uit het onderzoek bleek eerder ongewaardeerd virale RNA expressie heterogeniteit onder geïnfecteerde cellen, alsmede in vivo SIV-gemedieerde post-transcriptional genregulatie met eencellige resolutie. De tSCEPTRE methode is relevant voor de analyse van iedere cel bevolking vatbaar voor identificatie door expressie van oppervlakte-proteïne marker(s), host of pathogen gene(s) of combinaties daarvan.

Introduction

Vele intracellulaire pathogenen rekenen op gastheer cel machines te repliceren, vaak veranderen van de biologie van de cel van de host of gericht op zeer specifieke subpopulaties van cellen van de gastheer te maximaliseren van hun kansen op vermeerdering. Cel biologische processen zijn daardoor vaak verstoord, met schadelijke gevolgen voor de algehele gezondheid van de gastheer. Begrijpen van de interacties tussen virussen en de cellen van de gastheer waarin ze repliceren zal toelichten ziekte mechanismen die bij de ontwikkeling van verbeterde therapieën en strategieën helpen kunnen om infectie te voorkomen. Directe analytische hulpmiddelen waarmee de studie van gastheer-pathogeen interacties zijn essentieel aan dit einde. Eencellige analyse biedt het enige middel ondubbelzinnig een cellulaire fenotype toeschrijven aan een bepaald genotype of infectie status¹. Bijvoorbeeld, veroorzaken pathogene infecties vaak zowel directe als indirecte veranderingen in de cellen van de gastheer. Daarom onderscheid te maken geïnfecteerde cellen van hun niet-geïnfecteerde tegenhangers is noodzakelijk om te host cel kenmerkwijzigingen directe infectie of secundaire effecten, zoals veralgemeende ontsteking. Bovendien, voor veel ziekteverwekkers, zoals SIV en human immunodeficiency virus (HIV), host cel infectie verloopt via meerdere fasen, zoals vroeg, laat of latent, elk waarvan kan worden gekenmerkt door verschillende gen- en eiwit expressie profielen^{2 , 3 , 4 , 5}. bulk analyses van cel mengsels te vangen deze heterogeniteit⁶zal mislukken. Daarentegen zeer multiplexed eencellige analyses kunnen kwantificeren van de expressie van zowel virale en host genen bieden een middel om op te lossen infectie-specifieke cellulaire verstoringen, met inbegrip van variaties in stadia van de infectie. Verder, gastheer-pathogeen interacties in fysiologisch analyseren relevante instellingen is van cruciaal belang voor de identificatie van gebeurtenissen die zich in besmette organismen voordoen. Dus, methoden die kunnen worden toegepast direct ex vivo zijn waarschijnlijk beste vastleggen in vivo verwerkt.

SIV en HIV gericht CD4⁺ T cellen, waarin ze tegen gastheer antivirale "beperking" factoren en downregulate antigeen presentatie van moleculen te stellen productieve infectie voorkomen immuun toezicht^{7,8, 9,10,11}. Zonder behandeling, de infectie resulteert in massale verlies van CD4⁺ T-cellen, uiteindelijk culminerend in verworven immunodeficiency syndrome (AIDS)¹². In de omgeving van antiretrovirale therapie aanhouden latent geïnfecteerde cel reservoirs voor decennia, een geduchte barrière voor curatieve strategieën poseren. Inzicht in de eigenschappen van in vivo HIV/SIV-geïnfecteerde cellen heeft het potentieel om het onthullen van de ontvangende cel functies instrumentale in de pathogenese en volharding. Echter, dit heeft zijn zeer uitdagend, voornamelijk te wijten aan de low frequency van geïnfecteerde cellen en gebrek aan reagentia kunnen gemakkelijk om ze te identificeren. Cellen die viraal RNA, transcriberen naar schatting aanwezig zijn op 0,01 – 1% van CD4⁺ T cellen in bloed en lymfoïde weefsel^13,14,15. Onder onderdrukkende therapie zijn latent geïnfecteerde cellen zelfs minder frequent op 10^-3–10^{-7 16,17,18}. Virale eiwit kleuring testen zijn werk goed voor het bestuderen van in vitro infecties, zoals intracellulaire Gag, suboptimaal is toe te schrijven aan de achtergrondkleuring van 0.01-0,1%, gelijk aan of groter is dan de frequentie van de geïnfecteerde cellen^{13, 14}. Oppervlakte kleuring voor Env eiwit met goed gekarakteriseerd SIV/HIV Env-specifieke monoklonale antilichamen ook bewezen moeilijk te zijn, waarschijnlijk om dezelfde redenen. Onlangs, roman tools willen verbeteren van de opsporing van cellen uiten Gag door hetzij integratie testen specifiek voor gag RNA of met behulp van alternatieve imaging technologieën^14,15,19. Een dergelijke aanpak blijven echter beperkt in het aantal kwantitatieve metingen uitgevoerd op elke cel.

Hier beschrijven we een methodologie waarmee (1) enige virus-geïnfecteerde cellen rechtstreeks ex vivo door gevoelige en specifieke virale gen kwantitatieve qPCR en (2) kwantificeert de expressie van maximaal 18 oppervlakte-eiwitten en 96 genen voor elk besmet (en niet-geïnfecteerde) cel. Deze methodologie combineert eencellige oppervlakte-proteïne meting door FACS gevolgd door onmiddellijke cellysis en gebruik van gen expressie analyse multiplexed gerichte qPCR op het Biomark-systeem. De geïntegreerde fluidic circuit (IFC)-technologie kunnen multiplexed kwantificatie van 96 genen van 96 monsters tegelijk, bereikt door een matrix van 9,216 kamers waarin de individuele qPCR reacties worden uitgevoerd. Hoge-inhoud eiwit overvloed metingen de levende cel FACS sortering registreert terwijl het behoud van de volledige transcriptoom p.a. onmiddellijk uitgevoerd stroomafwaarts. Ter identificatie van virus-geïnfecteerde cellen, tests specifiek voor alternatief afgesplitste en unspliced virale RNAs (vRNA) zijn opgenomen in de analyse van de qPCR, samen met een panel van gebruiker gedefinieerde tests tot 96 genen, het maximum aantal testen momenteel ondergebracht in totaal de IFC. De expressie van genen en eiwitten informatie verzameld voor elke cel zijn verbonden door goed standpunt. Eerder berichtten we resultaten van deze analyse elders²⁰. Wij bieden hier, nadere methodologische richtsnoeren, alsmede verdere beschrijvende fenotypering van SIV-geïnfecteerde CD4⁺ T cellen.

Deze aanpak, die we tSCEPTRE noemen, kan worden toegepast op de schorsingen van een levensvatbare cellen bevolking reactieve fluorescently gelabelde antilichamen en uiten van een transcriptome compatibel met beschikbaar qPCR testen. Bijvoorbeeld kan het worden gebruikt voor het karakteriseren van differentiële gen- en eiwit expressie in zeldzame cellen of cellen niet gemakkelijk kunnen onderscheiden door oppervlakte-proteïne markeringen. De bereiding van de monsters is gebaseerd op een standaard protocol met verkrijgbare antilichamen kleuring. Cytometers met eencellige Sorterende vermogen ook commercieel beschikbaar zijn, maar extra bioveiligheid voorzorgsmaatregelen zijn vereist voor de verwerking van besmettelijke levende cellen. Opnemen van de single - cel eiwit expressie profiel voor elke cel door goed standpunt, aangeduid is als geïndexeerd sorteren, een gemeenschappelijk kenmerk van verkrijgbare FACS sorteren software. Computationele analyse van host differentially uitgedrukte genen onder mobiele bevolkingsgroepen van belang hier niet wordt beschreven, maar verwijzingen naar eerder gepubliceerde methoden worden geleverd.

Protocol

Opmerking: Een schematische voorstelling van de protocol-werkstroom wordt weergegeven in Figuur 1. Het bestaat uit drie belangrijkste stappen: FACS, RT en cDNA pre versterking en qPCR voor maximaal 96 genen tegelijk. Twee versies van het protocol, sorteren van cellen in de verdunningen te beperken en sorteren van de afzonderlijke cellen, zijn meer gedetailleerd beschreven in stap 5 en 6, respectievelijk. Deze strategieën richten verschillende onderzoeksvragen maar soortgelijke procedures volgen.

1. vereiste of voorafgaande Analyses

1. Alle gen expressie testen moet worden gebruikt als eerder beschreven⁶valideren.
   Opmerking: Deze stap is gedaan ruim voor de datum van het experiment. Alle testen te valideren, is commerciële en aangepaste, vereist om ervoor te zorgen efficiënte en lineaire versterking van relevante RNA tot op het niveau van één cel. Veel commercieel beschikbaar en aangepaste testen niet voldoen aan deze specificaties. Verwerking en geautomatiseerde curve-fitting voor gelijktijdige kwalificatie van meningsuiting tests van maximaal 96 genen worden verstrekt in Aanvullende codering bestanden 1 – 5, maar individuele tests kunnen worden gekwalificeerd via R² en helling van de lineaire pasvorm. Representatieve assay voor geslaagde en mislukte kwalificatie percelen zijn afgebeeld in Figuur 2.
2. Ontwikkelen van een stroom cytometrische panel van antilichamen tegen vlekken cel oppervlakte markers van belang.
   1. Titreer antilichamen door kleuring van een relevante steekproef, bijvoorbeeld rhesus perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs), met elke antilichaam. Beginnen met 20 µL van antilichaam per test in 100 µL kleuring reactie en acht twee-voudige seriële verdunningen maken. De optimale concentratie dat de maximale intensiteit kleuring vertoont met behoud van een duidelijke scheiding tussen de negatieve en positieve populaties te identificeren.
   2. Evalueren de gecombineerde kleuring op elk exemplaar van extra cel met behulp van het mengsel van alle antilichamen op de optimale concentratie bepaald in stap 1.2.1. Zorg ervoor dat de kleuring vergelijkbaar met die voor individuele antilichaam vlekken in acht genomen is. De kleuring is minder dan wat is waargenomen toen een antilichaam in isolatie werd gebruikt, overweeg alternatieve fluorescerende conjugaten ter vervanging van dergelijke antistoffen.

2. gen expressie Assay voorbereiding

1. Combineer 96 genexpressie testen in een RNase/DNase-gratis tube 1 – 15 mL (grootte kan variëren met het aantal soort platen). Het paneel van tests gebruikt in deze studie wordt gespecificeerd in tabel 1 en tabel 2. Het daaruit resulterende materiaal wordt aangeduid als de "Assay Mix". Elke bepaling toevoegen om een eindconcentratie van 180 nM voor voorwaartse en omgekeerde inleidingen. DNA schorsing Buffer om de aangewezen verdunning van de Assay Mix toevoegen.
   Opmerking: Voor praktische doeleinden, aangepaste (door de gebruiker gegenereerde) assay voorraden kunnen worden voorbereid op 18 µM overeenstemming te zijn met de concentratie van verkrijgbare "20 x" gen expressie qPCR tests (Tabel van materialen). 18 µM mengelingen van aangepaste voorwaartse en omgekeerde primer voor elk gen zijn gemaakt van stamoplossingen in de Buffer van de schorsing DNA. Verkrijgbare assays (Tabel of Materials) ook sondes, maar sondes zijn niet vereist voor RT of cDNA pre versterking en kan dus worden weggelaten voor aangepaste testen. Het wordt aanbevolen om één of meer genen van de huishouding voor gebruik in kwaliteitscontrole voor de beoordeling van de doeltreffendheid van sorteren, cel herstel en cDNA synthese. Gebruik van willekeurige inleidingen voor het genereren van cDNA is niet vastgesteld, maar naar verwachting worden minder efficiënt dan gen-specifieke primers.
2. De 2 x assay plaat gereedmaakt voor gebruik in stap 7.1 (multiplex qPCR). Pipetteer 6 µL van elke bepaling in elk aangewezen goed van een 96-Wells PCR plaat voor elke 96 x 96 chip array verwacht. Bijvoorbeeld, voor 5-chips, zal 30 µL van elke bepaling bezetten een enkele goed in de 96-wells-plaat. Als 96 testen, zal elk putje van de 96-wells-plaat een bepaling bevatten. Het zegel van de plaat met zelfklevende zegel.
   Opmerking: in het ideale geval stap 2.1 en 2.2 worden gelijktijdig uitgevoerd, om te voorkomen dat meerdere bevriezen-ontdooien cycli voor gen expressie testen. Alle genen binnen de assay plaat moeten ook aanwezig zijn geweest in de Assay Mix (stap 2.1). Zowel de test-mix en de assay plaat kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C of 4 ° C voor lange - of korte termijn gebruik, respectievelijk.

3. oppervlakte vlek levensvatbare cellen

Opmerking: Intracellulair kleuring, permeabilization en fixatie zijn niet compatibel met deze methode als ze compromis RNA.

1. Bereiden de compensatie monsters door elke antilichaam vermeld in de Tabel van materialen aan 40 µL van compensatie parels op 2.5-fold hogere concentratie dan die is gebruikt voor de kleuring van de cel toe te voegen. Incubeer gedurende 20 minuten bij 25 ° C beschermd tegen licht. Voeg 3 mL PBS toe aan de kralen en centrifugeer bij 500 x g gedurende 3 min bij 25 ° C. De PBS gecombineerd en resuspendeer de kralen in ~ 300 µL van PBS.
2. De stroom cytometrische cel sorter voorbereiden monster verwerking: verwerven van compensatie buizen, compensatie matrix maken en toepassen van matrix naar de overname-bestanden voor de experimentele specimens.
3. De master mix van fluorescerende antilichamen cocktail voor te bereiden door het combineren van de juiste hoeveelheid elke antilichaam zoals aangegeven in de Tabel van de materialen, in een tube 1,5 mL oranje voor alle monsters worden gekleurd. Vortex en centrifuge wordt de cocktail bij 21.000 x g gedurende 2 min bij 25 ° C tot het antilichaam pellet aggregaten.
   Opmerking: Antilichamen gebruikt hier staan in de Tabel van materialen.
4. Ontdooi de cryopreserved cellen in een waterbad 37 ° C voor 2 min. toevoegen 0,5 – 2 mL van de celsuspensie aan 12 mL PBS in een tube van 15 mL, centrifuge op 500 x g gedurende 3 minuten bij 25 ° C, en de PBS gecombineerd. Resuspendeer in 3 mL PBS en overdracht aan een polystyreen tube van 5 mL. Centrifugeer als hierboven en de PBS, verlaten ~ 20 µL residuele PBS gecombineerd.
   Opmerking: De kleuring temperatuur kan worden aangepast aan warmere of koudere temperaturen zo nodig voor specifieke toepassingen door aanpassing van de titratie van antilichamen kleuring voorwaarden dienovereenkomstig (zie stap 1.2).
5. Resuspendeer tot 2 x 10⁷ cellen in 80 µL van antilichaam cocktail gewassen en incubeer gedurende 20 min bij 25 ° C beschermd tegen licht. Voor monsters die meer dan 2 x 10⁷ cellen, meereninkwalitatiefopzichthoog kleuring reactie dienovereenkomstig te handhaven < 2 x 10⁷ cellen/100 µL.
6. Wassen van de cellen door toevoeging van 3 mL PBS, centrifugeren bij 500 x g gedurende 3 min, en aspirating het supernatant.
7. Resuspendeer de cellen in 300-500 µL van PBS en filter grondig door pipetteren via een 35 µm nylon cel zeef GLB. Houden van de cellen op ijs en beschermd tegen licht tot de soort.

4. bereid cel collectie platen, uitvoeren FACS sorteren en genereren cDNA

1. Combineer de RT-voorversterker reactie Mix onderdelen (tabel 3) door pipetteren in een enkele RNAse/DNAse-gratis steriele buis.
   Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd vóór of tijdens de kleuring in stap 3. De RT-enzym kan hier achterwege om te bepalen van de bijdrage van de DNA sjabloon qPCR signaal.
2. Gebruik een meerkanaalspipet af te zien van 10 µL van RT-voorversterker reactie Mix in het gewenste aantal 96-wells-platen in de collectie PCR sorteren. Zegel van de platen met zelfklevende folie, en plaats de platen op vooraf gekoeld 96-Wells-aluminium blokken.
3. Stellen de cel sorteren van gating regeling op de cytometer van de stroom door de overname van gegevens uit ongeveer 20.000 cellen van het gebrandschilderde monster. Zorg ervoor dat de compensatie-matrix wordt toegepast op de verzamelde gegevens. Tekenen van poorten en het gating boom waarmee de cel populaties van belang om te worden geïsoleerd gen expressie p.a. definiëren.
   Opmerking: De gating boom gebruikt voor het verzamelen van potentiële SIV vRNA⁺ cellen is afgebeeld in Figuur 3.
4. Voer de passende instrumentele instellingen om op te geven van het aantal en de subset van cellen worden gesorteerd in elk putje. Als u meer gedetailleerde instructies voor het sorteren van hetzij een beperkende verdunningsreeks van de cel of de afzonderlijke cellen vindt u in stap 5 en 6, respectievelijk.
5. FACS sorteren de cellen in bereid 96-Wells-PCR collectie platen. De Zelfklevende zegel vóór sortering verwijderen en vervangen door een verse zegel na het sorteren.
   Opmerking: Houd de platen op vooraf gekoeld aluminium blokken te allen tijde, met inbegrip van tijdens de sorteerbewerking.
6. Onmiddellijk na het sorteren, de draaikolk en de centrifuge de collectie plaat bij 2.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 ° C.
7. Thermocycle de plaat in een PCR-machine met een voorverwarmde deksel met behulp van de volgende voorwaarden: 50 ° C gedurende 15 minuten (RT), 95 ° C gedurende 2 min, gevolgd door 18 cycli van 95 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 4 minuten (pre amplificatie).
8. Verdun de cDNA 1:5 door 5 μL van cDNA overgeplaatst naar 20 µL van DNA schorsing buffer in een nieuwe 96-Wells PCR plaat. Verdunde cDNA kan worden opgeslagen bij 4 ° C of -20 ° C voor onbepaalde tijd op dit punt. CDNA is nu klaar om te worden gebruikt als een sjabloon voor qPCR (stappen 5.2, 7.4).
   Opmerking: Deze verdunning zorgt ervoor dat de inleidingen aanwezig in de RT-voorversterker reactie niet tot overschrijding stroomafwaarts qPCR bijdragen.

5. variatie A: FACS soort cellen in een verdunningsreeks beperken om te bepalen van de frequentie van vRNA⁺ cellen of de experimentele kwaliteitscontrole uitvoeren

Opmerking: Voordat u een soort eencellige, het wellicht van nut zijn voor het bepalen van de frequentie van cellen van belang, de cellen in seriële verdunningen in repliceren wordt gesorteerd. Deze stap biedt ook waardevolle kwaliteitscontrole voor sorteren efficiëntie, lysis van de cel, RNA herstel en cDNA synthese, zoals beschreven in stap 5.3. Voorafgaande bepaling van vRNA⁺ cel frequentie zorgt voor meerder stipt waardering van het aantal afzonderlijke cellen om voldoende grootte van de steekproef voor adequaat aangedreven vRNA⁺ cel gen expressie analyse moeten worden gesorteerd.

1. FACS sorteren van de cellen in de 96-wells-platen bereid zoals in stappen 4.1-4.2, en het verzamelen van 1-1000 cellen per putje in meerdere wordt gerepliceerd.
   Opmerking: Het aantal repliceren putten bij elke cel verdunning is meestal omgekeerd gekoppeld aan de cel concentratie per putje. Wanneer de frequentie van de geïnfecteerde cel is goed minder dan 1%, moeten cel verdunningen richten op 100-1000 cellen per putje. Een voorbeeld soort plaat kaart wordt gegeven in Figuur 1, links boven. Meer dan 1000 cellen per putje dient te worden vermeden als gevolg van resulterende stijgingen in de omvang van de reactie en interferentie met stroomafwaartse cDNA synthese en kwantificering.
2. Combineer de qPCR reagentia in een oplossing van de master mix in tabel 4. Voor een volume van 25 µL-reactie, wordt 22.5 µL van master mix gecombineerd met 2,5 µL van verdunde cDNA sjabloon vanaf stap 3.9. Uitvoeren van de qPCR met behulp van fietsen standaardomstandigheden (bijvoorbeeld94 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door 40 cycli van 94 ° C voor 15 s en 60 ° C gedurende 1 min).
   Opmerking: Singleplex qPCR reacties met behulp van een conventionele real-time qPCR instrument worden aanbevolen als een economische voorlopige analyse van één of enkele tests om aan te tonen van efficiënte cel sorteren, RNA herstel en cDNA synthese. Het kan ook worden gebruikt voor het berekenen van de frequentie van cellen van de vRNA⁺ . Multiplex qPCR reacties met behulp van de Biomark zijn meestal beter geschikt voor grootschalige eencellige analyses.
3. Voor kwaliteitscontrole, plot Et waarden (Et = Ct_max − Ct) versus aantallen cellen gesorteerd per putje op een log₁₀ schaal en toepassen van een lineaire regressie-analyse.
   Opmerking: Consistent wordt gerepliceerd, helling van de lineaire regressie voor 3.3 (± 0,3) en R² > 0.9 zijn indicatief voor een efficiënte experiment. Voorbeelden van optimale en suboptimaal soort, RT-voorversterker experimenten zijn weergegeven in Figuur 4.
4. Om te bepalen van de frequentie van vRNA⁺ cellen, plot cel nummers gesorteerd per putje op de x-as (₁₀ logschaal) en de Fractie van wells positief voor vRNA bij elke verdunning van de cel op de y-as. Zie bijvoorbeeld Figuur 1 (lagere links, Poisson-verdeling). Een lineaire regressiemodel toepassen op de gegevens om te bepalen van het aantal cellen die haven één positieve cel gemiddeld overeenkomt met 63,2% van putten positief (0.632 op de y-as)²¹. Deze verdunning celaantal (snijpunt van de x-as) converteren naar frequentie uitgedrukt als een percentage. Bijvoorbeeld is één cel van vRNA⁺ per 48 cellen gelijk aan een frequentie van 2,1%.

6. variatie B: FACS soort cellen voor eencellige analyse

1. Stappen 4.1 – 4.8, en geef één cel gesorteerd per goed gebruik van de cytometer van de stroom soort indexfunctie voor het maken van afzonderlijke FCS bestanden voor elke cel gesorteerd, toegewezen door goed standpunt.
   Opmerking: Als het aantal sorteren collectie platen groter is dan het aantal beschikbare thermocyclers, fietsen kan worden gestopt na de reverse-transcriptase inactivatie stap (95 ° C gedurende 2 min) en cDNA kan worden achtergelaten bij 4 ° C, totdat thermocyclers beschikbaar zijn. In dit geval beginnen vóór versterking op de eerste cyclus van 95 ° C voor 15 s.
2. Optioneel: Maak cDNA "pools" bestaande uit cDNA van gebruiker gedefinieerde batches van afzonderlijke cellen aan het scherm voor zeldzame cellen van belang met behulp van residuele onverdund cDNA. Pipetteer 2 µL van onverdunde eencellige vooraf versterkte cDNA door meerkanaalspipet in een nieuwe 96-wells-plaat. Herhaal door pipetting 2 µL van cDNA van alles extra afzonderlijke cellen van een aangewezen zwembad in hetzelfde goed. Het scherm van cDNA zwembaden voor gene(s) van belang (bijvoorbeeld, vRNA) om te bepalen die met positieve cellen met behulp van conventionele qPCR. Aangezien de pooling vereist slechts een kleine hoeveelheid cDNA van elke cel, is de resterende ~ 8 µL van cDNA nog steeds beschikbaar voor eencellige analyses.
   Opmerking: Bundeling van strategieën worden aanbevolen voordat u eencellige gen expressie analyses uitvoert in een poging om het verminderen van het aantal afzonderlijke cellen ondervraagd door resource-intensieve multiplex qPCR. Het is geschikt voor situaties waarin de cellen van belang (b.v., SIV mRNA +) kunnen worden geïdentificeerd door een voorlopige single-plex qPCR assay. Eenvoudige omvatten high-throughput maken cDNA zwembaden strategieën combineren 2 µL van onverdunde cDNA uit een collectie soort plaat (dat wil zeggen, alle 12 in rij cellen) rijen of kolommen (dat wil zeggen, alle 8 in kolom 1 cellen), in een enkele goed in een nieuwe plaat. Om te bepalen van de beste strategie bundelen, kunt u overwegen de verwachte frequentie van de cellen van belang vanaf stap 5.4. Bijvoorbeeld als 10% van de cellen zijn naar verwachting zal positieve, zwembaden bestaat uit zes eencellige cDNA monsters zullen vaak negatief en de cellen in die groep vertegenwoordigd kunnen dus worden uitgesloten van downstream eencellige analyses.

7. multiplex qPCR op het Biomark Platform

Opmerking: Deze sectie kan ofwel versie A of B hierboven beschreven volgen. In de studie die hierin worden beschreven, het is uitsluitend van toepassing op eencellige analyse.

1. Bereid de qPCR assay plaat door pipetting 4 µL van elke bepaling van de 2 x assay plaat (bereid in stap 2.2) in een nieuwe 96-Wells PCR plaat met 4 µL van assay laden reagens in elk putje. Handhaven van de assay plaat bij 4 ° C.
   Opmerking: De assay plaat is stabiel bij 4 ° C gedurende maximaal één week en bij-20 ° C gedurende één maand. Dus, het dienstig is om voldoende materiaal voor meerdere chips voor te bereiden en op te slaan op de juiste manier.
2. Afzien van het besturingselement lijn vloeistoffen uit de priming spuiten in de kleppen van de twee inname van de chip. Verwijder het beschermende plastic onder de plaat. Plaats de chip op een IFC-controller met de ingekeepte kant op de positie van de A1. Vanuit het hoofdmenu, selecteer het script dat "Prime". Het script uitvoeren.
3. Bereid de Real-Time reactie Mix door het mengen van 50 µL van monster reagens met 500 µL van het PCR Master Mix (Tabel of Materials) voor elke microfluidic chip te laden. Pipetteer 4.4 µL in ieder putje van een nieuwe 96-Wells PCR plaat, voortaan aangewezen als de "monster plaat".
4. Pipetteer 3.6 µL van verdunde cDNA uit stap 4.8 in de steekproef plaat met de Real-Time reactie Mix 1:5.
   Opmerking: Als een PCR down-selectie werd uitgevoerd om te screenen op zeldzame (bijvoorbeeld, vRNA⁺) cellen voor downstream analyse zoals besproken in stap 6.2, bevatten alleen de cellen in de positieve zwembaden vertegenwoordigd.
5. Na de voltooiing van de chip priming, door de inhammen van de chip door verstrekking 5 µL van de plaat van de bepaling in de corresponderende goed op de ingekeepte (assay) kant van de chip en 5 µL van de monster-plaat in de corresponderende goed aan de andere kant van de (voorbeeld) van de chip te laden. Invoegen van een chip in de IFC-controller en voer het script van "Load mix".
6. De chip aan het Biomark platform voor het uitvoeren van de multiplexed qPCR overdragen. Doorgaan met de installatie van het instrument en qPCR programing volgens stapsgewijze instructie verstrekt door de Real-Time PCR analyse software en het gebruik van het protocol van gen expressie (GE) 96.96 standaard V.1 met 40 cycli van PCR. Sla het bestand ChipRun in een aangewezen map.
   Opmerking: Meerdere chips kunnen worden uitgevoerd per dag en meerdere dagen.
7. De qPCR-gegevens analyseren.
   1. Open de Software van de analyse van PCR in real time. Open het bestand "ChipRun.bml" uit het "File | Open"menu.
   2. Zoek "Chip Explorer" en "Chip uitvoeren samenvatting" in de linker bovenhoek van het venster software. Identificeren van de drie componenten van de Chip uitvoeren Samenvatting: analyseweergaven, monster Setup en Detector Setup.
   3. Klik op "Detector Setup". Onder "Taak" Klik "Nieuw" en Selecteer type "SBS plaat" van de container, en container-formaat "SBS96". Naast "Mapping", klik op de... en selecteer "M96-Assay-SBS96.dsp".
      1. Optioneel: Toewijzen elke Detector (assay) een nummer of naam in de sectie van de "naam" van elk putje door te dubbelklikken op de 1^st goed. Verplaatsen naar de volgende goed door op "F2" te drukken.
   4. Klik op "Voorbeeld Setup". Klik onder "Taak" naast "Mapping", op de... en selecteer "M96-monster-SBS96.dsp".
   5. Klik op "Analyseweergaven". Selecteer onder "Taak" in het tabblad "qPCR", "Correctie van de basislijn voor lineaire (afgeleide)", en "Ct drempel methode voor gebruiker (detectoren)". Controleer de "initialiseren met Auto doos" in het tabblad "Ct drempels". Klik op de knop "Analyseren" hierboven.
   6. In de hogere juiste kwadrant van "Analyseweergaven", klik op de tweede tab "Uitslagen stand". Uit de drop-down menu, selecteer "Warmte kaart View". De warmte-kaart met gegevens wordt weergegeven.
      1. Optioneel: Om uniforme ROX fluorescentie over de spaander, selecteer "Image View" in plaats van "Warmte kaartweergave" in hetzelfde menu. Selecteer in de tweede van het juiste venster boven de warmte kaart, "ROX". In de eerste van het juiste venster, selecteert u een van de 1-40 cycli. Klik op de vierde van het juiste venster om te schakelen naar zwart-wit weergave van ROX fluorescentie. Een afbeelding wordt weergegeven die informeert splatters, deeltjes, of defecten op de chip. Als de ROX uniformiteit is schromelijk verduisterd, opnieuw uitvoeren de chip.
   7. Onder de hitte-kaart, klikt u op "Drempel" en "Log Graph". De Ct-drempels handmatig voor elke detector aanpassen door op testen (kolommen van de warmte-kaart) te klikken en te slepen de drempel als nodig zijn om te snijden de versterking bochten in de exponentiële fase. Wanneer u klaar bent, klikt u op "Analyseer".
8. De qPCR-gegevens exporteren als een CSV-bestand. Importeer de gegevens in een werkblad of een statistische analysesoftware (bijvoorbeeldJMP) en de resultaten per monster en assay posities op de chip kaart. De cellen indelen in groepen op basis van de expressie van virale genen, door een nieuwe kolom te maken en met behulp van een voorwaardelijke formule. Onder "Analyze", selecteer "Y door X Fit" en genexpressie versus groep uitzetten. Statistische analyse van de toepassing.
   Opmerking: Vertegenwoordiger eencellige kwantitatieve expressie van vier soorten van SIV RNA wordt afgebeeld op de bivariate percelen in figuur 5A. Kwantitatieve host genexpressie in cellen van SIV RNA⁺ is afgebeeld in figuur 5B.
9. Kwantitatieve eiwit expressie waarden extraheren op basis van één cel FACS gegevens.
   1. Open de .fcs bestanden uit de FACS sorteren (stap 6.1) overeenkomt met 96-wells-plaat met behulp van FlowJo versie 9. Met de naam van het bestand gemarkeerd, selecteert u "Platform | Gebeurtenis nummer Gate | Geïndexeerde sorteervolgorden maken poorten". Afzonderlijke cellen worden weergegeven door rij weergegeven.
   2. Markeer alle 96 cellen (niet rijen) en selecteer "werkruimte | Exporteren | Selecteer alle gecompenseerd fluors". Onder 'Gegevenstype', selecteer "FCS file" en klik op "Export" Selecteer een aangewezen map.
   3. Nieuwe .fcs bestanden voor afzonderlijke cellen naar een nieuwe FlowJo-werkruimte slepen. Alle cellen markeren, klikt u op "Add statistieken" (de "Σ"-knop in de linkerbovenhoek wordt getoond) "| Bedoel | Alle fluor parameters".
   4. Open "tabel Editor" door te klikken op de vierde knop van links in de linkerbovenhoek wordt getoond. Markeer alle fluores van de eerste cel en sleept u deze in de tabel editorvenster. In de tabel editorvenster, klikt u op dezelfde knop bovenaan "Create en weergave Table". Hierdoor ontstaat een tabel met 96 cellen en een numerieke parameter voor elk fluor.
   5. Kopieer de output naar een database-software (bijvoorbeeldMS Excel, JMP), door beide kopiëren/plakken of door te klikken op "Opslaan en toepassing starten" (vierde van de linker knop boven de tabel).
      Opmerking: Deze procedure is specifiek voor de FlowJo versie 9. FlowJo versie 10 maakt gebruik van een andere procedure om geïndexeerde gegevens te importeren. Geïndexeerde stroom gegevens kunnen ook worden gekopieerd/geplakt in JMP rechtstreeks van CSV-bestanden gemaakt door de cel sorteerder.
10. Samenvoegen van één cel FACS gegevens en qPCR door de nummerplaat en goed plaats. Grafische en statistische analyses uitvoeren op het gecombineerde eencellige gen (qPCR) en eiwit expressie (FACS) gegevens.
    Opmerking: Voorbeelden van eencellige gecombineerd qPCR en FACS gegevens worden weergegeven in Figuur 6 (host oppervlakte-proteïne expressieprofielen voor SIV-geïnfecteerde, afgesplitste vRNA⁺ rhesus makaak cellen), Figuur 7 (CD4 genexpressie versus oppervlak CD4 eiwituitdrukking in verbonden vRNA⁺ rhesus makaak cellen), en eerder gepubliceerd²⁰. Ter identificatie van differentially uitgedrukte genen in de cel populaties van belang, eencellige analyse methoden eerder beschreven zijn aanbevolen^20,22,23,24, die goed zijn voor het aantal cellen positief voor een gen, alsmede de voortdurende gen expressie waarde.

Results

De werkstroom voor het gehele protocol wordt afgebeeld in Figuur 1. Het bestaat uit twee varianten die zijn gedefinieerd door het aantal cellen gesorteerd op: ofwel beperkende verdunning of als single van cellen, zoals beschreven in de tekst. Voorbeelden van primer-sonde kwalificatie analyses op 2-fold seriële verdunningen van het RNA zijn afgebeeld in Figuur 2. De gating strategie potentiële SIV⁺ cellen opsporen is af...

Discussion

Het protocol hier beschreven, genoemd tSCEPTRE, eencellige oppervlakte-proteïne kwantificatie integreert door multiparameter stroom cytometry met kwantitatieve eencellige mRNA uitdrukking door zeer multiplexed RT-qPCR. De vereniging van deze twee technologieën kunt momentopnamen van hoge-inhoud van de gecombineerde transcriptionele en eiwit Profiel van afzonderlijke cellen in de indeling van een hoge gegevensdoorvoer. Wij gebruiken de methode voorheen ongrijpbare cellen geïnfecteerd met SIV in vivoopsporen, en b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA-extractie en PCR reagentia en verbruiksartikelen
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expressie assays niet vermeld in Tabel 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagentia
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagentia
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube met filterdop	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	verdunnen 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	verdunnen 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	verdunnen 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	verdunnen 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	verdunnen 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	verdunnen 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	verdunnen 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	<