Beoordeling van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door Double-kamer Plethysmography

Samenvatting

Het doel van dit artikel is bedoeld als een gedetailleerde beschrijving van de aanbevolen procedures voor het evalueren van de ademhalingsfunctie in bewuste muizen door dubbele-kamer plethysmography.

Samenvatting

Lucht volumeveranderingen gemaakt door een bewuste ademhaling spontaan binnen een vak hoofdtekst die onderworpen zijn aan de basis van plethysmography, een techniek gebruikt ter beoordeling van niet-gebeurt voor sommige functies van de ademhalingsfunctie bij de mens zo goed zoals in proefdieren. Dit artikel richt zich op de toepassing van de dubbele-kamer plethysmography (DCP) in kleine dieren. Het geeft achtergrondinformatie over de methodologie, alsmede een gedetailleerde stapsgewijze procedure te beoordelen met succes ademhalingsfunctie in bewuste, ademhaling spontaan dieren in een niet-invasieve wijze. De DCP kan worden gebruikt om te controleren de ademhalingsfunctie van meerdere dieren in parallel, alsmede over de veranderingen bij aërosol stoffen over een gekozen periode te identificeren en op een herhaalde wijze. Experimenten op controle en allergische muizen worden hierin gebruikt om te tonen het nut van de techniek, verklaren het bijbehorende uitkomst parameters, evenals over het bespreken van de bijbehorende voordelen en tekortkomingen. Over het algemeen biedt de DCP geldig en theoretisch geluid uitlezingen die kunnen worden vertrouwd om te evalueren van de ademhalingsfunctie bewuste Kleindieren na uitdagingen met aërosol stoffen zowel op de basislijn.

Inleiding

Het toenemende gebruik van kleine dieren naar menselijke aandoeningen van de luchtwegen met model heeft aangespoord de ontwikkeling van technieken voor het kwantitatief beoordelen de functies van de luchtwegen in deze dieren. Op dit moment wordt de gedwongen trilling techniek (FOT) erkend als de meest nauwkeurige aanpak om te beoordelen van respiratoire mechanica in kleine dieren^1,2. Echter, zoals aangegeven door de onzekerheidsrelatie fenotypering, wat is opgedaan in de precisie van de meting met de FOT wordt verhandeld af tegen een verlies in noninvasiveness³. Inderdaad, FOT metingen zijn verworven onder zeer gecontroleerde experimentele omstandigheden die noodzakelijk maken van anesthesie, tracheotomie of mondelinge intubatie, evenals mechanische ventilatie; een scenario verre van levensechte.

In situaties waar de experimentele eisen absolutistisch van het gebruik van verdovende middelen of bel voor weinig of geen afwijking van de natuurlijke fysiologische toestand van het dier, kan dubbele-kamer plethysmography (DCP) worden beschouwd. Zoals de naam al aangeeft, bestaat een DCP-setup uit twee verbonden rigide kamers gebouwd om het hoofd van het dier (of neus), in de voorste kamer, van haar borst, zo hermetisch mogelijk te isoleren in de achterste zaal. Binnen de instelling, het dier is bewust en spontaan ademt terwijl wordt ingehouden. Omdat de muren van de kamers niet kunnen uitbreiden of intrekken, genereert de beweging van lucht en van het dier een overeenkomstige maar tegenovergestelde golfvorm binnen de achterste zaal, als gevolg van de compressie/decompressie van de omringende lucht. De golfvorm als gevolg van de nasale stroming in de voorste kamer en degene aan de thoracale beweging in de achterste zaal gerelateerde kan dus worden gescheiden en tegelijkertijd gevangen. Afhankelijk van het ontwerp van de DCP-instellingen, kunnen deze golfvormen worden verkregen met behulp van een set van druk transducers of pneumotachographs respectievelijk de wijzigingen opnemen in kamer druk of luchtstroom en van de kamers als een functie van de tijd. De laatste benadering komt tegenwoordig vaker voor.

Terwijl het dier ademhaling frequentie nauwkeurig kan worden bepaald door allerlei plethysmography technieken, is de situatie niet hetzelfde voor de bepaling van ademhalingsvolume en bijbehorende parameters van de verwante ventilatie (bijvoorbeeld, minuut ventilatie, expiratoire volume, enz.). In tegenstelling tot de gehele lichaam plethysmograph (WBP) techniek, waar het dier ademhalingsvolume wordt geschat uit de doos signaal^4,5, biedt de DCP-techniek nauwkeurige beoordeling van ademhalingsvolume. Dit is gerelateerd aan de rechtstreekse aankoop van de thoracale beweging van het dier in de achterste zaal, die in verhouding staan tot de veranderingen in het volume van de longen tijdens de ademhaling.

Naast deze nauwkeurige ventilatoire parameters (bijvoorbeeld, ademhalingsvolume ademhaling frequentie en minuut ventilatie), sommige verstoringen in de vorm van de respiratoire cyclus kunnen ook worden gebruikt om te onderzoeken van neuronale aspecten waaraan de respiratoire station of respiratoire reflexen. Een concreet voorbeeld van die toepassing zou de evaluatie van het potentieel van de irritatie van geïnhaleerde stoffen op de bovenste luchtweg sensorische neuronen⁶. Hier, wordt de duur van een pauze bij de aanvang van de verlooptijd bepaald met behulp van een parameter met de naam van einde-inspiratory pauze (EIP), ook wel aangeduid als de duur van⁶remmen. De verlenging van deze pauze door een irriterende stof wordt geassocieerd met de sluiting van het dier glottis, veroorzaakt een meetbare periode van remmen in het eerste deel van de vervaldatum^6,7.

Een ander belangrijk voordeel van de DCP is dat het voorziet twee gevalideerde en onbetwiste parameters die gevoelig voor luchtstroom obstructie zijn. Een heet de stroom bij midden-getijde expiratoire volume en is afgekort EF50^8,-^9,10. Het is de luchtstroom bij midway volume van elke getijde ademhaling tijdens de vervaldatum. EF50 wordt gewonnen uit de trace thoracale stroom en kan dus worden gemeten zonder de voorste kamer (dat wil zeggen, in een configuratie met hoofd-out). De andere heet specifieke luchtwegen-weerstand en is afgekort sRaw^11,12,13. De vaststelling van sRaw vereist de gelijktijdige opname van de nasale en thoracale stromen van het dier zoals het is berekend op basis van de tijdvertraging tussen deze afzonderlijke respiratoire sporen op het punt van nul stroom aan het einde van inspiratie. De grondgedachte die beschrijft de basis waaraan deze vertraging heeft betrekking op sRaw was expatiated eerder¹¹. Simpel gezegd, de veranderingen in het volume van de Long voorafgaan aan de luchtbeweging aangezien een drukverschil moet ontwikkelen om station luchtstroom. In een gezond dier rustig ademen, is deze vertraging doorgaans zeer klein. Het drukverschil dat vereist is voor een bepaalde stroom (b.v., een voldoende voor voldoende ventilatie stroom) wordt echter beïnvloed door de mate van weerstand van de luchtwegen. Tijdens de bronchoconstrictie, bijvoorbeeld, is het verloop van de druk die nodig is voor een bepaalde stroom groter, wat impliceert dat het dier moet harder werken om te ademen. Een groter verloop van druk in de borstkas van het dier houdt ook in dat een groter deel van de stroom en van de achterste kamer is te wijten aan decompressie/compressie van lucht in de thorax, dat is het gedeelte van de totale thoracale expansie/retractie thats uit fase waarbij de nasale luchtstroom. De verhoogde weerstand als gevolg van bronchoconstrictie zal dus toenemen de vertraging tussen de achterkant en de voorkant kamers en daardoor verhoogt sRaw. Het verloop van de druk die luchtstroom en van de longen drijft wordt ook beïnvloed door het volume van de eerste thoracale gas (TGV). Bij een grotere TGV bijvoorbeeld de uitbreiding/intrekking van de thorax nodig om te genereren een bepaalde gradatie van druk groter is (gewoon omdat de verschuiving van de omvang die nodig is voor het genereren van een bepaald verloop van druk groter is), wat ook inhoudt dat de dier heeft om harder te werken om te ademen. Nogmaals, deze extra thoracale verplaatsingen zijn degenen die nodig zijn om het te decomprimeren/compress lucht in de thorax en zijn dus uit fase waarbij de nasale luchtstroom. Dus, een verhoogde TGV de vertraging tussen de kamers ook zal toenemen en daarmee verhoogt sRaw. Zoals gezien kan worden, resulteren zowel bronchoconstrictie en verhoogde TGV in een meer belangrijke inspanning te trekken van de lucht en van de longen. Dit is in wezen de fysiologische betekenis van sRaw. Het vertegenwoordigt de werkzaamheden die nodig zijn voor de ademhaling van^5,14.

Het is dus belangrijk om te begrijpen dat twee afzonderlijke factoren sRaw beïnvloeden: luchtwegen-weerstand en TGV. In feite, kan sRaw worden uitgedrukt als het product van de weerstand van de luchtwegen en TGV¹¹. Bewuste dieren kunnen wijzigen hun TGV bij zal, wat betreft hun ventilatie aan een bepaalde omgeving passen. Onder dergelijke omstandigheden, waar de natuurlijke fysiologische toestand van het dier ongewijzigd is, is het dus onmogelijk om te onderscheiden of een verandering in sRaw vloeit uit een verandering in de luchtwegen-weerstand, een verandering in de TGV of uit een mix van de twee voort. Vandaar, is het aanbevolen als aanvulling op de evaluatie van de DCP met meer invasieve metingen van respiratoire mechanica en/of Long volumen, zoals die welke door de FOT^1,15.

Tot op heden, is de DCP gebruikt in verschillende toepassingen van het onderzoek. De techniek kan worden gebruikt met of zonder de hoofd vergaderzaal kwantitatief en nauwkeurig evalueren van het effect van verschillende stoffen, zoals farmaceutische agenten, allergenen, irriterende stoffen of andere bemiddelaars, op ademhalingsfunctie in bewuste kleine dieren ^16,17,18. De voorste kamer kan ook worden gebruikt als een bloot kamer aërosol stoffen of verschillende gas concentraties (hypoxie, hypercapnie, enz.)¹⁹. Handig, het maakt het mogelijk om gelijktijdig de acute effecten van deze stoffen te meten. In feite, is een van de gemeenschappelijke toepassingen van de DCP ter beoordeling van de mate van alertheid op aërosol methacholine in verschillende modellen van respiratoire aandoeningen^{20,21,22,23, 24 , 25}.

Hoewel de DCP-techniek schijnbaar eenvoudig is, kon enkele praktische uitdagingen potentieel onervaren gebruikers ontmoedigen of afbreuk doen aan de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten. De huidige paper geeft een gedetailleerde beschrijving van de aanbevolen procedures voor het met succes opnemen ademhalingsfunctie door DCP in bewuste, ingetogen, spontaan ademhaling muizen. De beschrijving is specifiek voor de vermelde uitrusting (Zie de Tabel van de materialen). Het nut en de waarde van de DCP wordt ook aangetoond in een gemeenschappelijk model van pulmonaire allergische ontsteking in twee muizenstammen getest op basislijn en in reactie op aërosol methacholine.

Protocol

De volgende procedures werden goedgekeurd door het hart van Quebec en de Lung Institute Animal Care Committee overeenkomstig de richtsnoeren van de Canadese Raad op Animal Care (CCAC).

1. voorbereiding

1. Studie
   1. (Kritische) Voorafgaand aan het uitvoeren van een experiment, door de passende goedkeuringen (bijvoorbeeld IACUC) en opleidingen (bijvoorbeeld dierlijke behandeling) te verkrijgen.
   2. Uzelf vertrouwd met de apparatuur en de besturingssysteemsoftware. Lees de gebruikershandleidingen en maak indien nodig een configuratiebestand te bepalen van het aantal sites, het invoeren van signalen, analyzers en parameters.
      Opmerking: Zorg ervoor dat u een hoge sampling rate (2 KHz).
   3. Configureer de instellingen van de analysatoren voor de parameters van belang.
      1. Tuning selecteren op de werkbalk en vervolgens Analyzers.
      2. Aanpassen van de drempel van de stroom op een waarde die correct de adem scheidt (muis: 0,5 mL/s) en kiezen voor Ti + Te berekenen van het ademhalingstarief.
      3. Een waarde instellen voor de barometerdruk (760 mm Hg) en geeft u de maximale afwijking van inspiratory/expiratoire volume voor een adem geldig (muis: 20%).
      4. Klik op de instelling van het veld berekend parameters aan te passen van de grenzen van aanvaarding.
         Opmerking: De volgende instellingen werden gebruikt voor de beschreven muis experimenten: inspiratie tijd, 50 tot en met 170 ms; Verlooptijd, 40 tot en met 180 ms; frequentie van de ademhaling, 30 tot 450 bpm; specifieke airway weerstand, 0 tot en met 15 cmH₂O·s; de stroom van de midexpiratory met een nauwkeurigheid van ten minste 3 decimalen.
      5. Zodra voltooid, selecteer toepassen en sluiten om het dialoogvenster venster te sluiten.
   4. Het hulpprogramma barmenu, ga naar Tuning opnieuw en klik vervolgens op opslag een gewenste gegevenssnelheid opslag wilt instellen. Klik op toepassen en op sluiten om het venster te sluiten.
      Opmerking: Gemiddeld op elke 10 s wordt meestal gebruikt.
   5. Maak een protocol binnen de besturingssysteemsoftware te definiëren van een reeks opdrachten en de gewenste timing voor elkaar. Een voorbeeld is weergegeven in Figuur 1.
   6. Als het experiment de toediening van een stof door aërosol omvat, bereiden de passende oplossingen en verdunningen volgens de concentraties worden getest.
2. Dier
   1. Werken in een rustige omgeving, ver van de kamer van de behuizing. Toestaan dat de dieren aan te passen aan de verandering van omgeving.
   2. Weeg de dieren en selecteer de juiste terughoudendheid grootte.
   3. (Kritische) De dieren de afdekking en procedures voor de aanvang van het experiment te acclimatiseren. Afhankelijk van de proefopzet, meerdere sessies van de acclimatisering duur te verhogen (bijvoorbeeld 5-30 min) kan nodig zijn.
      Opmerking: Dieren die niet acclimatiseren moeten worden verwijderd uit de studie.
      1. Bij elke sessie acclimatisering invoegen het dier binnen de afdekking, uitgaande van de terug openen; Houd het apparaat verticaal kan handig zijn.
      2. Zodra het dier in positie is, plaats de zuiger terug en zachtjes vergrendelen het zonder toepassing van een buitensporig geweld.
      3. (Kritische) Visueel controleren dat het dier normaal ademt. Indien nodig, haar positie aanpassen door de "locking" mechanisme. Zorg ervoor dat het dier de neusgaten zijn uitsteekt buiten de neus-kegel met haar snuit rusten tegen de binnenmuren van de afdekking.
      4. Loskoppelen van het achterpaneel van de thoracale kamer, plaats de afdekking met het dier door het rubber in de thoracale kamer openen en sluiten de kamer.
      5. Bevestig de hoofd kamer en bieden een bias flow. Gebruik een stroom van 0,5 L/min voor een muis.
      6. Laat het dier om te ontspannen voor 5 min.
      7. Zodra het dier kalm is, de opname van de nasale en thoracale stroom signalen te starten. Controleer of op het computerscherm dat de sporen glad zijn en dat ze weer een patroon van regelmatige ademhaling; Zie voorbeeld in Figuur 2.
         Opmerking: Als het protocol de aërosol toediening van een stof omvat, kan een zout uitdaging worden opgenomen in de acclimatisatie-procedure.
      8. Aan het einde van elke sessie, het dier uit de thoracale zaal en de afdekking te verwijderen en terug te sturen naar haar huisvesting cage en kamer.
3. Apparatuur
   1. Op de dag van het experiment, een experimenteel sessie starten en laden van de juiste configuratiebestand.
      Opmerking: Controleer of het bevat het gewenste protocol voor het experiment.
   2. Ga naar uitvoeren in het menu tool bar. Voer het experiment en dier informatie. Zodra gedaan, klik op de knop uitvoeren aan de onderkant van het venster.
   3. Ga verder met de kalibratie van het systeem. Kalibreren van elke site en input signaal afzonderlijk.
      1. De bias stroom generator inschakelen, sluit hem aan op de hoofd kamer via een stukje buis en aanpassen van het debiet.
      2. Sluit de bovenste opening van de hoofd kamer met een cap.
      3. Loskoppelen van het achterpaneel van thoracale kamer, steek stevig in de kalibratie tool binnen de opening tussen het hoofd en het lichaam kamer maken een hermetische afdichting rubber. Sluit de database en opnieuw hechten het achterpaneel van de thoracale kamer.
      4. Controleer of dat de poort van de kant van de thoracale kamer wordt afgetopt.
      5. De software tool barmenu, ga naar Tuning en klik vervolgens op kalibreren.
      6. Ga naar ingang 1 (thoracale) en selecteer kalibreren te starten van het dialoogvenster kalibratie voor de thoracale stroom signaal.
      7. (Kritische) Verifiëren dat de weergegeven parameters in het dialoogvenster kalibratievenster de juiste instellingen, dat wil zeggen, fysieke spanning toegepast lage waarde weergeven: 0; Fysieke stress toegepast hoge waarde:-20 mL/s; Monsters: integreren. Zodra gedaan, klik op de laag in het venster voorbeelden .
      8. Controleer of het signaal gegenereerd is constant in het venster Eigenschappen voor beeldscherm en vervolgens op sluiten.
      9. Sluit een 20 mL-spuit via de poort van de kant van de thoracale kamer met behulp van een plastic connector en een stukje slang.
      10. (Kritische) Selecteer hoog in het venster voorbeelden en onmiddellijk 20 mL lucht te injecteren in de zaal gedurende 2 s op een zo constant mogelijke debiet.
      11. Controleer of het signaal gegenereerd volledig weergegeven in het venster Eigenschappen voor beeldscherm. Gebruik het pijlpictogram om te controleren of het signaal gecentreerd en symmetrisch rond de nullijn is. Klik vervolgens op sluiten. Verwijderen van een offset van nul door te klikken op verwijderen AC verschuiving in het venster voorbeelden
          Opmerking: De kalibratie van hoge waarde kan worden overgedaan, indien nodig.
      12. Controleer of het resulterende Schaal invoerbereik is binnen het aanbevolen bereik (muis: ±280 tot ±420 mL/s). (Kritische) Herhaal de stappen van de kalibratie als de waarden buiten het toegestane bereik.
      13. Kalibreer de hoofd kamer op een vergelijkbare manier als de thoracale kamer (stap 1.3.3.6). Deze keer, kies Input 2 (nasaal).
          Opmerking: (Belangrijk) De waarde voor fysieke spanning toegepast hoge waarde moet worden ingesteld op + 20 mL/s. Dit zal veranderen de polariteit van de stroom in de voorste kamer met betrekking tot de achterste kamer. Vandaar, wanneer het dier ademt, de signalen van de twee stromen bijna zullen in fase, afgezien van de vertraging gebruikt om te berekenen sRaw.

2. Long functie metingen

1. Weeg de dieren en hun lichaam gewichten opmerking.
2. Invoegen van het dier binnen de afdekking en plaats deze binnen de thoracale plethysmograph kamer (stappen 1.2.3.1 naar 1.2.3.5).
3. Laat het dier om te ontspannen voor minstens 5 min.
4. Het protocol van opdrachten starten door het selecteren van de eerste stap en klik vervolgens op uitvoeren.
5. Controleer op het scherm dat van het dier ademhaling zijn regelmatige en vlotte (Figuur 2 signalen). De software toont automatisch de berekende parameters op basis van de adem-door-adem. Controleer of het dier parameters stabiel.
6. Record het patroon van de ademhaling onder uitgangssituatie voor maximaal 10 minuten.
7. Voor protocollen waarbij de toediening van een teststof door aërosol, gaat u als volgt:
   1. Pas de vernevelaar op tijd en plicht-cyclus, zoals vereist.
      Opmerking: In de voorbeelden in dit artikel wordt aangetoond, de vernevelaar werd gevoed met een taakcyclus van 5% voor 10 s.
   2. Uitvoeren van een voertuig uitdaging (bijvoorbeeld zoutoplossing) en noteer het antwoord.
   3. Indien nodig, bloot het dier aan de toenemende concentraties van de teststof door het veranderen van de concentratie in de vernevelaar in stappen (bijvoorbeeld verdubbeling van concentraties) escalatie. Record de reactie na elke toediening.
   4. Aan het einde van de experimentele sessie, gebeurt niet automatisch, stoppen van de opname en het dier terug naar haar huisvesting kooi en de kamer.
8. Als nodig is, selecteert u uitvoeren van het hulpprogramma barmenu uitvoeren een andere experimentele sessie.
   1. Tussen sessies, de plethysmograph kamers schoon en spoel de vernevelaar met water.
      Opmerking: Het gebruik van alcohol kan leiden tot onomkeerbare schade aan de plethysmograph.
9. Indien de studie herhaalde evaluaties na verloop van tijd inhoudt, herhaal de hele meting op elk gekozen timepoint.
   Opmerking: Het is verstandig aanbevolen als aanvulling op de studie met sommige nauwkeurige metingen van respiratoire mechanica en/of Long volumes^1,15.

3. de gegevensanalyse

Opmerking: De software automatisch slaat het experimentele bestand en export van de opgenomen parameters, wanneer de experimentele sessie wordt afgesloten.

1. Een basislijn gemiddelde berekenen voor de parameters van belang voor elk dier en experimentele groep.
   Opmerking: tabel 1 vindt u een aantal typische parameters, gecategoriseerd op basis van het type informatie die zij verstrekken.
2. Indien relevant, evalueren van het effect van de aërosol stof studeerde op de parameters van belang bij elke concentratie met behulp van een specifiek punt (bijvoorbeeld maximale of minimale waarde), gemiddeld of de full-time-cursus; een normalisatie op basislijn kan ook worden beschouwd.
3. Verslag van de resultaten met behulp van de middelen van de groep en de fouten in een tabel- of grafisch formaat. Analyseer de resultaten statistisch.
   Opmerking: In de huidige studie, doorlopend tweeweg ANOVAs met maatregelen werden gebruikt voor het beoordelen van het effect van methacholine, het allergeen –-huisstof mijt (HDM) – en hun interactie op verschillende DCP uitlezingen (sRaw en EF50), alsook op verschillende FOT uitlezingen (R_N, G en H), in beide muizenstammen. Sidak van meerdere vergelijkingstests werden vervolgens gebruikt om te bepalen van de concentraties van methacholine waartegen de allergische muizen van het control-muizen verschillen. Dezelfde tests werden gebruikt om te beoordelen van het effect van dagen, HDM en hun interactie op basislijn (dat wil zeggen, vóór methacholine) op uitlezingen van obstructie (sRaw en EF50) en ventilatie patroon (BF, TV, MV en EIP). De Pearson correlaties werden gebruikt om te evalueren van de correlaties tussen sRaw verkregen met de DCP en R_N verkregen met de FOT. Alle statistische analyses en grafieken werden uitgevoerd met behulp van alternatieve standaard statistische software (b.v., GraphPad Prism). p ≤ 0,05 werd geacht voldoende te verwerpen de null-hypothese.

Resultaten

De resultaten van herhaalde evaluaties van de ademhalingsfunctie door DCP, uitgevoerd onder voorwaarden van de basislijn op drie opeenvolgende dagen (dagen 12, 13 en 14 van het protocol geïllustreerd in Figuur 1) controle en allergische BALB/c muizen, worden weergegeven in figuur 3 . De parameters die werden geselecteerd om het beoordelen van het patroon van de ademhaling opgenomen ademhaling frequentie (figuur 3A), Ademhalingsvolume (figuur 3B), minuut ventilatie (Figuur 3 c) en einde-inspiratory pauze (figuur 3D). De parameters die worden gebruikt om te beoordelen van obstructie waren EF50 (figuur 3E) en sRaw (figuur 3F). De resultaten van elke geselecteerde parameter waren stabiel over deze drie opeenvolgende dagen in beide groepen, met geen duidelijk effect veroorzaakt door een allergische ontsteking.

De mate van alertheid op methacholine werd geëvalueerd door DCP op opeenvolgende dagen (dagen 12, 13 en 14 van het protocol geïllustreerd in Figuur 1) in zowel controle als allergische BALB/c muizen. De resultaten, getoond in Figuur 4, weergave van de veranderingen in de twee parameters die gevoelig voor obstructie, namelijk sRaw (figuur 4A, B en C zijn) en EF50 (Figuur 4 d, E en F). Zoals verwacht, incrementele concentraties van methacholine geleidelijk verhoogd sRaw en daalde geleidelijk EF50. Deze reacties waren versterkt door een allergische ontsteking, vooral bij de uiteindelijke concentratie getest, die de aanwezigheid van hyperresponsiveness geattesteerd. De resultaten tonen ook aan dat de overdreven mate van responsiviteit was beperkt tot de eerste dag (dag 12), zoals het niet tijdens de twee daaropvolgende evaluaties (dat wil zeggen, op dagen 13 en 14 waargenomen werd).

De resultaten van de beoordeling van de mechanica van de luchtwegen door de FOT, uitgevoerd op de laatste dag van het experimentele protocol (dag 15; Figuur 1) in zowel controle als allergische BALB/c muizen, zijn afgebeeld in Figuur 5. Deze experimenten werden opgenomen in de studie ter aanvulling van de DCP-evaluaties. De FOT is erkend als een meer nauwkeurige aanpak om te beoordelen van de ademhalingsfunctie². Een van haar sterke punten is dat het topografische inzichten over de vraag welke sites van de longen (dirigent airways versus perifere airways en longweefsel) worden beïnvloed door de geteste interventies (b.v., allergeen en methacholine). De aanbevolen methode voor het beoordelen van respiratoire mechanica met de FOT was eerder beschreven¹. Hierin werden drie FOT parameters gebruikt voor het beschrijven van de veranderingen in de luchtwegen mechanica geïnduceerd door allergische ontsteking en methacholine. Deze parameters opgenomen: 1-Newtoniaanse weerstand (R_N; Figuur 5A), een parameter waarvoor de veranderingen in de waarde vooral weerspiegelen verschillen in de weerstand van de grote geleidende luchtwegen; 2-weefsel demping (G; Figuur 5B), een parameter waarvoor de veranderingen in de waarde vooral weerspiegelen variaties in weefsel weerstand; en 3-weefsel elastance (H; Figuur 5C), een parameter waarvoor de veranderingen in de waarde vooral weerspiegelen verschillen in weefsel stijfheid². Zoals verwacht, was er een toename van elk van deze parameters in reactie op incrementele concentraties van methacholine. Consistent met sRaw en EF50 resultaten verkregen met de DCP van de vorige dag (dag 14; Figuur 1), de veranderingen in R_N geïnduceerd door methacholine (figuur 5A) waren vergelijkbaar tussen het besturingselement en de allergische muizen. In feite, de waarden van sRaw op dag 14 gecorreleerd met de waarden van R_N op dag 15 (figuur 5D). De stijging van de H geïnduceerd door methacholine was ook gelijk tussen het besturingselement en de allergische muizen (figuur 5B). De methacholine-geïnduceerde toename G was echter aanzienlijk groter in de allergische muizen (figuur 5C). Dit resultaat toont de aanwezigheid van een aanhoudende hyperresponsive fenotype bij de allergische muizen op dag 15, die niet is herkend door de DCP-evaluaties uitgevoerd op de twee vorige dagen.

De gehele studie werd herhaald met C57BL/6 muizen. De resultaten van de opeenvolgende evaluaties van de DCP van sRaw, op de dagen 12, 13 en 14 van het protocol (Figuur 1), en van de evaluatie van de FOT van R_N, op dag 15, worden weergegeven in Figuur 6. In die specifieke muis spanning bleef de respons van de overdreven methacholine waargenomen in de allergische muizen in de drie opeenvolgende dagen (figuur 6A, Ben C). Deze hyperresponsive fenotype werd het ook afgebeeld met de FOT op dag 15 door een stijging van de R_N geïnduceerd door methacholine die meer in de allergische muizen (Figuur 6 sexies uitgesproken was). Deze werden in schril contrast met de resultaten van de BALB/c muizen, waar een progressieve tanende van de hyperresponsiveness vond plaats van 12 tot en met 14 (Figuur 4) dagen en een gebrek aan verschil in de methacholine veroorzaakte stijging van R_N werd waargenomen op dag 15 (figuur 5A). Deze resultaten aangegeven samen een tijd tegenover wisselende effect van het allergeen op de methacholine-geïnduceerde reactie tussen de twee muizenstammen. Nog belangrijker is, werd het verschil van deze stam afgebeeld door zowel de DCP en de FOT. Concordantly, de waarden van sRaw gemeten door de DCP op dag 14 gecorreleerd met de waarden van R_N gemeten door FOT op dag 15 (figuur 6F), zoals werd waargenomen bij de BALB/c muizen (figuur 5D).

Figuur 1 . Protocollen die worden gebruikt voor het opwekken van pulmonaire allergische ontsteking en voor de beoordeling van de mate van responsiviteit naar methacholine. Deze studie werd uitgevoerd op vrouwelijke BALB/c en C57BL/6 muizen van 7 tot en met 9 weken oud. De volgorde van de interventies uitgevoerd over de hele studie wordt weergegeven in het deelvenster (A). De helft van de muizen werd blootgesteld aan 50 µg-huisstof mijt (HDM) extract intranasaal 14 opeenvolgende dagen voor het opwekken van pulmonaire allergische ontsteking. De andere helft was blootgesteld aan zout en gebruikt als controle. Ademhalingsfunctie werd beoordeeld door dubbele-kamer plethysmography (DCP) op drie verschillende gelegenheden (dagen 12, 13 en 14; zwarte cirkels) na een acclimatisering zitting (dag 11; grijze cirkel) die een uitdaging met aërosol saline opgenomen. Tijdens elke sessie, werden ademhalingsfunctie van de basislijn en de reactie op de methacholine beoordeeld met behulp van de geautomatiseerde protocol weergegeven in het deelvenster (B). Op dag 15, werd invasieve eenbeoordeling van respiratoire mechanica met de gedwongen trilling techniek (FOT) uitgevoerd als eerder beschreven¹. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 . Representatieve stroom signalen van een gezonde BALB/c muis. De panelen laten typische opname sporen verkregen door dubbele-kamer plethysmography in een controle muis onder de uitgangssituatie. Thoracale stroom wordt weergegeven in het bovenste deelvenster en nasale stroom wordt weergegeven in het onderste deelvenster. Negatieve waarden zijn tijdens inspiratie en positieve waarden zijn tijdens de vervaldatum. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3 . Evaluaties van de ademhalingsfunctie in bewuste BALB/c muizen herhaald. Basislijn ademhalingsfunctie evalueerden door dubbele-kamer plethysmography (DCP) in controle (open symbolen) en allergische (solide symbolen) muizen op de dagen 12, 13 en 14 van het protocol geïllustreerd in Figuur 1. De DCP-parameters gebruikt voor de beoordeling van de ademhalingsfunctie opgenomen ademhaling frequentie in (A) Ademhalingsvolume (TV) in (B), minuut ventilatie (MV) in (C), einde inspiratory onderbreken (EIP) in (D), stromen op mid-getijde expiratoire volume () EF50) in (E), en specifieke airway weerstand (sRaw) in (F). De waarden van de ademhaling van frequentie, TV, MV, sRaw en EIP voor elke muis waren de gemiddelde waarden opgenomen meer dan 1,5 min. De waarde van EF50 was de minimale waarde verkregen gedurende deze periode van de opname. De resultaten worden gepresenteerd als groep ± standaardafwijking betekent (n = 5/groep). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4 . Methacholine bronchoprovocation test in bewuste BALB/c muizen. Methacholine responsiviteit werd beoordeeld door dubbele-kamer plethysmography (DCP) in controle (open symbolen) en allergische (solide symbolen) muizen op de dagen 12, 13 en 14 van het protocol geïllustreerd in Figuur 1. De DCP-parameters gebruikt voor de beoordeling van de reactie opgenomen specifieke luchtwegen-weerstand (sRaw) in (A) door (C) en stroom bij midden-getijde expiratoire volume (EF50) in (D) t/m (F). De bronchoprovocation werd uitgevoerd door het aerosolizing van methacholine in de zaal DCP hoofd voor 10 s bij incrementele concentraties. De reactie werd gecontroleerd tijdens 1.5 min na elke concentratie. De waarde van sRaw voor elke muis elke concentratie was de gemiddelde waarde opgenomen meer dan 1,5 min. De waarde van EF50 was de minimale waarde verkregen gedurende deze periode van de opname. De resultaten worden gepresenteerd als groep ± standaardafwijking betekent (n = 5/groep). De sterretje zinnebeeld * duidt een statistisch significant verschil (p 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 5 . Invasieve beoordeling van respiratoire mechanica in BALB/c muizen. Respiratoire mechanica aan basislijn en in antwoord op methacholine werd geëvalueerd door de gedwongen trilling techniek (FOT) op dag 15 van het protocol geïllustreerd in Figuur 1. Het besturingselement (open symbolen) en de allergische (solide symbolen) muizen waren dezelfde als degene die zijn getest door dubbele-kamer plethysmography (DCP) op de dagen 12, 13 en 14. De parameters die u gebruikt om te beoordelen van respiratoire mechanica zijn Newtoniaanse weerstand (R_N) in (A), weefsel elastance (H) in (B) en (G) demping in (C) weefsel. De bronchoprovocation werd uitgevoerd door nebulizing incrementele concentraties van methacholine rechtstreeks in de Endotracheale tube van narcose, tracheotomized, verlamd en mechanisch geventileerde muizen in liggende positie. De reactie werd gecontroleerd gedurende 5 min na elke concentratie. De waarde voor elke parameter voor elke muis elke concentratie was de piekwaarde verkregen gedurende deze periode van de opname. De resultaten worden gepresenteerd als groep ± standaardafwijking betekent (n = 5/groep). Paneel (D) toont de correlatie tussen specifieke luchtwegen-weerstand (sRaw) gemeten door DCP op dag 14 en R_N gemeten door FOT op dag 15. De open symbolen vertegenwoordigen de waarden op de basislijn en de solide symbolen vertegenwoordigen de maximale waarden op de hoogste concentratie van methacholine voor het besturingselement (cirkels) of de allergische (pleinen) muizen getest. De inzet toont de determinatiecoëfficiënt (r²). De sterretje zinnebeeld * duidt een statistisch significant verschil (p ≤ 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 6 . Respiratory functie en invasieve respiratoire mechanica in C57BL/6 muizen. Specifieke airway weerstand (sRaw) werd beoordeeld door dubbele-kamer plethysmography (DCP) op basislijn en in antwoord op methacholine bij controle (open symbolen) en allergische (solide symbolen) muizen op dagen 12 (A), (B) 13 en 14 (C) van de het protocol wordt geïllustreerd in Figuur 1. Newtoniaanse weerstand (R_N) op basislijn en in reactie op methacholine waren op dag 15 (D) door de techniek van de gedwongen trilling (FOT) beoordeeld. De bronchoprovocations werden uitgevoerd zoals beschreven in Figuur 4 en Figuur 5 voor de DCP en de FOT, respectievelijk. De resultaten worden gepresenteerd als groep ± standaardafwijking betekent (n = 5/groep). Paneel (E) toont de correlatie tussen sRaw gemeten door DCP op dag 14 en R_N gemeten door FOT op dag 15. De open symbolen vertegenwoordigen de waarden op de basislijn en de solide symbolen vertegenwoordigen de maximale waarden op de hoogste concentratie van methacholine voor het besturingselement (cirkels) of de allergische (pleinen) muizen getest. De inzet toont de determinatiecoëfficiënt (r²). De sterretje zinnebeeld * duidt een statistisch significant verschil (p ≤ 0,05). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Met de parameter	Eenheid	Beschrijving	Informatie
F	BPM	Frequentie van de ademhaling	Patroon van ventilatie
TV	mL	Ademhalingsvolume
MV	mL	Minuut ventilatie
TI	MS	Inspiratory tijd
Te	MS	Expiratoire tijd
PIF-BESTAND	mL/s	Peak inspiratory flow
PEF	mL/s	Maximale expiratoire flow
EV	mL	Expiratoire volume
NUOVO TRASPORTO VIAGGIATORI	mL	Nasale ademhalingsvolume
NEV	mL	Nasale expiratoire volume
EIP	MS	Einde inspiratory pauze
EEP	MS	Einde expiratoire pauze
dT	MS	Tijdvertraging	Obstructie van de luchtstroom
sRaw	cmH2O·s	Specifieke luchtwegen-weerstand
sGaw	1/cmH2O·s	Specifieke airway geleidbaarheid
EF50	mL/s	Op mid-getijde expiratoire volume stroom
SR	%	Slagingspercentage	Kwaliteitscontrole
N		Aantal geldige ademhalingen

Tabel 1. Lijst van typische parameters verkregen dubbele-kamer plethysmography. De parameters werden ingedeeld volgens de aard van de informatie die zij tijdens een evaluatie van de ademhalingsfunctie verstrekken.

Voordelen	Beperkingen
· Bewuste dieren	· Noodzaak om te controleren van de omgeving
· Nauwkeurige ventilatie parameters	· Voorafgaande acclimatisering van de dieren
· Onbetwiste indexen van luchtstroom obstructie (sRaw, EF50)	· Verplichting tot het hermetisch scheiden de nasale en thoracale stromen
· Aanpasbaar aan verschillende soorten en dier maten	· Variabiliteit van de absolute waarde voor sommige uitkomst parameters
· Gebruikt in vele toepassingen van het onderzoek	· sRaw niet een echte meting van de weerstand
· Eenvoudige techniek	· Aanwezigheid van de bovenste luchtwegen
· Gevoelig voor wijzigen	· Als aanvulling op de metingen met een invasieve beoordeling

Tabel 2. Lijst van voordelen en beperkingen in verband met dubbele-kamer plethysmography.

	Double-kamer Plethysmography	Gedwongen trilling techniek
Dier staat van bewustzijn	Ongewijzigde	Verdoofd (en meestal verlamd)
Standpunt van het dier	Rechtop	Liggende
Dier toegankelijkheid	Beperkt binnen de kamer	Toegankelijk
Dierlijke integratie naar de meting apparaat	Neus of nek zegel	Tracheotomie of orale intubatie
Dier airway boom	Intact	Gedeeltelijke – bovenste luchtwegen segment uitgesloten (d.w.z. nasale voert, keelholte en strottenhoofd)
Volume van de Long waartegen de uitkomst parameters worden verkregen	Variabele - spontane volume aangenomen door het behandelde dier	Gestandaardiseerd - met behulp van gecontroleerde werving manoeuvres en einde-expiratoire overdruk.
Frequentie waarop de uitkomst parameters worden beoordeeld	Variabele - frequentie van spontane ademhaling aangenomen door het behandelde dier	Gecontroleerd - met behulp van vooraf gedefinieerde golfvormen bij opgegeven frequenties
Bijdrage van de bovenste luchtwegen segment aan de uitkomst parameters	Naar verwachting	Omzeild
Site van aërosol levering	Binnen het hoofd kamer	Rechtstreeks in de luchtpijp
Effect van de bovenste luchtwegen segment op geïnhaleerde dosis / aërosol afzetting patroon	Naar verwachting	Voorkomen
Capaciteit om te ontdekken van de verandering - op basis van de resultaten van de huidige studie	Waargenomen	Waargenomen
Inherente variabiliteit van de techniek - op basis van de resultaten van de huidige studie	Schommelingen van de variatiecoëfficiënt voor sRaw op basislijn: 7.5-20,6%	Schommelingen van de variatiecoëfficiënt voor RN op basislijn: 3.6-13,4%

Tabel 3. Vergelijking tussen de dubbele-kamer plethysmography en gedwongen trilling technieken.

Discussie

De mogelijkheid voor het meten van de longfunctie bij bewuste dieren is duidelijk gerechtvaardigd in het respiratoir onderzoek. In het algemeen, is de DCP een interessante benadering om te evalueren van de functie van de ventilatie van de luchtwegen in de bewuste en spontaan ademhaling dieren²⁶. Meer in het bijzonder, balans de DCP, of de variant van de hoofd-out, vaak een juiste tussen de kwaliteit van de verstrekte informatie en het gewenste niveau van invasiviteit³ (tabel 2). De techniek kan worden aangepast aan verschillende soorten (bijvoorbeeld, muis, rat, cavia) of dierlijke maten en kan worden gebruikt in vele toepassingen van het onderzoek. Het is vooral handig om te beoordelen van talloze dieren tegelijk in een parallelle studie ontwerp met de ademhalingsfunctie op herhaalde wijze controleren, en het opnemen van de kinetiek van een antwoord na verloop van tijd. Bovendien, de techniek is eenvoudig en relatief tijdig kan worden geleerd. In het huidige document, een protocol met DCP-metingen bij muizen werd gebruikt als een voorbeeld om te beschrijven de praktische aspecten van dit plethysmography techniek alsmede ingetogen over de kritische stappen bespreken en gerelateerde resultaten.

Wanneer u werkt met bewuste dieren, is het essentieel om te bepalen van de voorwaarden van de omgeving (bijvoorbeeld, rustige kamer met een beperkt aantal mensen of activiteit) om reproduceerbare resultaten genereren. Aangezien de fixeren in diverse afmetingen komen, is het belangrijk om te beginnen met de juiste grootte, zodat de ademhaling bewegingen zijn onverstoorbaar. Is het ook nuttig en vaak nodig om te acclimatiseren van de dieren aan de experimentele opstelling en procedures, zoals het is reeds lang gevestigd in muizen dat beteugeling van invloed is op de ademhaling frequentie¹². Afhankelijk van de proefopzet of voorwaarden, kunnen meerdere sessies van incrementele duur nodig zijn. Tot slot, zodat de tijd aan het begin van een experiment voor de dieren aan te passen aan de verandering van de kamer en de noodzakelijke behandeling is een eenvoudige overweging die effectief zijn om ervoor te zorgen bewezen dat het patroon van de ademhaling consequent regelmatige en ontspannen op de basislijn is. Werken onder omstandigheden waar de dieren comfortabel, goed aangepast, en rustig zijn zal ook gunstig qua resultaat variabiliteit en kwaliteit zijn. Het beperkt ook een stress-geïnduceerde release van catecholamine, die kan vergroten airway kaliber en een geïnduceerde bronchoconstrictie verzachten.

Het is belangrijk te begrijpen dat er een noodzaak om te scheiden als hermetisch mogelijk de nasale en thoracale stromen. Afhankelijk van het systeem of de soort studeerde, kan de verzegeling mechanisme variëren in vorm zo goed zoals in werkzaamheid. In de DCP we hierin beschreven, wordt het zegel gemaakt tussen de snuit van het dier en de beteugeling apparaat. Bij de beoordeling van de ademhalingsfunctie door DCP, is het ook essentieel om te voorzien van een voldoende en continu bias stroom, zoals een afname van de hoeveelheid zuurstof beschikbaar aan het dier leiden significante effecten tot zal. Rekening houdend met het welzijn van het dier in de afdekking beperkt de neiging voor lucht lekken gemaakt door agitatie en daardoor maximaliseert de kwaliteit van de gegevens. Productiestappen, een verbreking van de verzegeling zal resulteren in afgewezen datasets of een onderschatting van het aantal parameters.

Daarnaast opdat de afzonderlijke opname van het signaal van de nasale stroom, wordt de hoofd kamer meestal gebruikt om het dier te aërosol stoffen bloot te stellen. Zoals geïllustreerd in dit artikel, kan dit worden gebruikt voor het uitvoeren van een test van de bronchoprovocation om aan te tonen verschillende mate van responsiviteit. In dergelijke experimenten, aanpassing van het aantal geteste concentraties kan nodig zijn afhankelijk van de soort, stam of geslacht van de dieren studeerde. Als eerder bewezen^8,9,10,27tonen de huidige resultaten aan dat de methacholine-geïnduceerde veranderingen in sRaw gecorreleerd met invasieve FOT metingen van de weerstand van de luchtwegen. De resultaten tonen ook aan dat de DCP-techniek niet zo gevoelig als de FOT voor haar vermogen is te detecteren van respiratoire dysfunctie en te identificeren van een veranderde respons gelokaliseerd binnen de lagere compartimenten van de longen (longweefsel en/of kleine perifere airways) . Omdat de luchtwegen van het dier intact zijn, de aanwezigheid van de bovenste luchtwegen, die goed is voor het grootste deel van de totale respiratoire weerstand luchtstroom²⁸, kan invloed hebben op de distributie van spuitbussen en afzetting in de toevoeging aan het temperen van de bijdrage van de lagere luchtwegen klem zitten op een meting. Tabel 3 geeft een overzicht van andere verschillen tussen de DCP-techniek en de FOT. Ten slotte, hoewel het zou theoretisch mogelijk te schatten van het dier totaal airway weerstand (met inbegrip van de bovenste luchtwegen) uit een meting van sRaw, wordt het algemeen aanbevolen als aanvulling op de evaluatie van de DCP met een invasieve meting techniek zoals de FOT²⁹ te verkrijgen directe metingen van gedetailleerde respiratoire mechanica. Afhankelijk van de doelstellingen van de studie, metingen van de bovenste luchtwegen-weerstand kunnen ook worden beschouwd als^30,31,32.

Conclusie 
Vanwege de beperkte mate van invasiviteit is de DCP een techniek die een belangrijke behoefte in het respiratoir onderzoek kan vervullen. Het is in staat om nauwkeurige uitlezingen van ventilatie patroon in bewuste dieren gelijktijdig met sommige onbetwiste indexen van obstructie van de luchtstroom. De verkregen informatie ook echt een aanvulling op die van meer invasieve benaderingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acetyl-β-methylcholine chloride	Sigma-Aldrich	A-2251	Methacholine
Phosphate buffered saline	Multicell	311-506-CL	PBS 10X
House dust mite extract	GREER	290902	HDM
DCP complete system	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
iox software	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
Aerogen Aeroneb nebulizer	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
flexiVent FX complete system	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES