Methodenartikel

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

DOI:

10.3791/57781

⸱

28 juni 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk introduceert een methode voor het uitvoeren van een optogenetic single-eenheid betrouwbaar opnemen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is een grote zorg in de neurowetenschappen hoe verschillende soorten neuronen werken in neurale circuits. Recente vooruitgang in de optogenetics hebt ingeschakeld op de identificatie van de neuronale type in in vivo elektrofysiologische experimenten in brede hersengebieden. In optogenetics de experimenten is het van cruciaal belang om het licht op de site van de opname. Echter is het vaak moeilijk te leveren van de stimulatie licht aan de diepe hersengebieden van de hersenen oppervlak. Het is vooral moeilijk voor de stimulatie licht te bereiken de diepe hersengebieden toen de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag, is zoals vaak het geval met opnames van wakker dieren. Hier beschrijven we een methode om vast te leggen van spike reacties op het licht van een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode. Bij deze methode wordt het licht beschikbaar gesteld via de opname-glaselektrode zodat het is mogelijk om op een betrouwbare manier stimuleren de opgenomen neuron met licht in de diepe hersengebieden. Deze op maat gemaakte optrode-systeem bestaat uit toegankelijke en goedkope materialen en is eenvoudig te monteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het centrale zenuwstelsel bestaat uit verschillende soorten neuronen, die verschillende functies hebben. De werking van deze verschillende soorten neuronen binnen het neurale circuit is een van de belangrijkste bekommernissen in de neurowetenschappen. Echter in veel hersengebieden is het onmogelijk om te onderscheiden van de neuronale soorten in in-vivo -opnamen elektrische activiteiten, want er geen duidelijk verschil in het elektrische spike signaal zelf, met enkele uitzonderingen is. Recente vooruitgang in optogenetics heb een doorbraak1,2. Het gebruik van transgene dieren waarin lichtgevoelige opsin (bijvoorbeeldchannelrhodopsin-2) wordt uitgedrukt in neuronale bepaalde, werd het mogelijk om te onderscheiden van de neuronale typen efficiënt in in vivo opnames3, 4,5,6. Bij deze dieren, de neuronen met lichtgevoelige opsin zijn opgewonden door lichte prikkels te geven tijdens de elektrische opnames, maar andere neuronen zijn niet. De opsin-positieve neuronen, daarom zijn gemakkelijk onderscheiden van andersoortige neuron door hun antwoorden aan het licht.

In optogenetics de experimenten is het van cruciaal belang om het licht op de site van de opname. Als een niet-invasieve methode, is het licht vaak gericht van de hersenen oppervlak. Omdat de sterkte van het licht vermindert als het hersenweefsel doorloopt, is het echter moeilijk te stimuleren de diepe hersengebieden van de hersenen oppervlak. Het is vooral moeilijk voor de stimulatie licht te bereiken de diepe hersengebieden toen de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag, is zoals vaak het geval met opnames van wakker dieren. Elektrofysiologische experimenten hebben vaak verricht voor narcose dieren omdat de lichaamsbeweging ruis in de opnames veroorzaakt. Zoals is goed gedocumenteerd, is anesthesie echter bekend om te veranderen van de neurale reacties7,8,9,10. Het is dus nodig om wakker dieren te bestuderen van neurale reacties zonder de kunstmatige effecten van de narcose. In tegenstelling tot de experimenten met narcose dieren, worden het elektrofysiologische opnamen uitgevoerd na het herstel van een operatie in de experimenten met dieren wakker. Tijdens het interval tussen de operatie en de opnames, het weefsel afgescheiden vaak ophoopt op de hersenen oppervlak en maakt de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag.

Hier beschrijven we een methode voor het opnemen van de single-eenheid opnamen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode. Bij deze methode wordt het licht beschikbaar gesteld via de opname-glaselektrode zodat het is mogelijk om op een betrouwbare manier stimuleren de opgenomen neuron met licht in diepe hersengebieden. Deze op maat gemaakte optrode-systeem bestaat uit toegankelijke en goedkope materialen en is eenvoudig te monteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de leidende beginselen van de fysiologische Society van Japan en met goedkeuring van de Animal Care Comité Kanazawa medische universiteit van.

1. bouw van de glazen Optrode houder

Opmerking: Om te bouwen van een glas optrode houder, is de houder van een commerciële elektrode gebruikt (figuur 1A).

  1. Trek voorzichtig uit de stalen buis voor drukregeling van het vat van de houder.
  2. Door het boren, verbreden het gat van de zijde van de stoel aanpassen in het vat van de houder. Maak het gat 3 mm in diameter en 12 mm in diepte.
  3. Zet een roestvrij stalen pijp (diameter 3 mm 0,5 mm in dikte en 8 mm lengte; Figuur 1A 2) in het gat.
  4. Invoegen van een keramische paring mouw voor ⌀2.5 mm ferrules (figuur 1A1) gesplitst in het gat.
  5. Fix het vat van de elektrode-houder voor een L-vormige felsen met epoxy lijm.
  6. Maak de gaatjes (3 mm diameter) in het felsen en deze koppelen aan een manipulator met schroeven.

2. hoofd Post installatie

  1. Een op maat gemaakte hoofd post maakte van een circuit bord spacer voor te bereiden. Maken van de spacer in kolomvorm printplaat in een cuboidal vorm met een kotter frezen en snijd deze in 2 hoofd posten met een zaag (figuur 1B). De onderkant van de hoofd post met een kotter frezen afvlakken.
  2. De transgene dieren waarin een lichtgevoelige opsin is uitgedrukt in een specifieke neuron-type voor de studie voor te bereiden. In dit werk, wordt de transgene muis (VGAT-ChR2 muizen) waarin de remmende neuronen express channelrhodopsin-2 (ChR2)11 gebruikt.
  3. Anesthetize het dier met een mengsel van 0,3 mg/kg medetomidine, 4,0 mg/kg van midazolam en 5,0 mg/kg Butorfanol door intraperitoneale toediening. Testen om te bevestigen dat het dier volledig verdoofd is, zijn reacties om staart knijpen.
  4. Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een stereotaxic frame op een verwarming pad. Schoon het stereotaxic frame en de verwarming pad met 70% alcohol van tevoren. Plaats de tanden in het gat van de balk beet en licht het scherpen van de klem van de neus. Beide zijden van het hoofd met behulp van oor balken vast te stellen. Wanneer het hoofd goed door de oor-bars opgelost is, draai de neus klem. Toepassing een oogheelkundige zalf op de ogen.
  5. Scheren van de hoofdhuid met een kleine schaar en reinig de hoofdhuid met een wattenstaafje van chloorhexidine gluconaat. Vóór de operatie, steriliseren alle die de chirurgische instrumenten en een hoofd met een autoclaaf (121 ° C, 15 min post).
  6. De hoofdhuid langs de middellijn knippen met een schaar en het terzijde schuiven. Het maken van de incisie aan de achterkant van het hoofd aan de ogen (ongeveer 20 mm). Het beenvlies verwijderen met een wattenstaafje gedoopt in 70% alcohol en droog de schedel.
  7. Bevestig de hoofd post aan de manipulator. Plaats de hoofd post plat op de schedel rond de bregma met behulp van de manipulator.
  8. Meng de monomeer (4 druppels), de katalysator (1 druppel) en het polymeer (1 kleine lepel) van tandheelkundige cement op een kleine schotel die tevoren in de koelkast is gekoeld. Zet de tandheelkundige cement (onder 1 g) op de frontale en pariëtale bot van de schedel te lossen de hoofd post op de schedel.
  9. Nadat de tandheelkundige cement moeilijk wordt, verwijder de muis uit het stereotaxic frame. Een antibiotische zalf zetten op de blootgestelde huid. Injecteer de medetomidine antagonist (0,3 mg/kg) en de antibiotica (oxytetracycline; 20 mg/kg). Plaats en volgen van de muis op het pad van de warmte in een kooi totdat het ontwaakt, en terug te sturen naar een huisvesting kooi.
  10. Het huis van het dier in een kooi van individuele huisvesting met een verrijking apparaat. Het wijzigen van de dierlijke papier beddengoed dagelijks om de kooi schoon te houden en te voorkomen infectie. Zorgvuldig controleren of het dier ongemak vertoont. Toepassing lidocaïne op de wond als eventuele pijn wordt vermoed. Beheren meloxicam of carprofen eenmaal elke 24 h gedurende 48 uur nadat beide het hoofd installatie en craniotomy chirurgie post. De lokale lidocaïne kan bovendien worden gegeven als de NSAID niet voldoende is.

3. acclimatisering

  1. Twee dagen (minimaal) na het herstel van de narcose, acclimatiseren de dieren aan de hoofd-bevestigde staat in de zaal van de opname. Voer de acclimatisatie sessies voor ten minste 5 dagen.
  2. Tijdens de acclimatisatie sessies, plaats het dier in de zaal van de opname met de hoofd post bevestigd aan een custom-built klem. Tijdens de sessie, ter beperking van beweging, dekking het lichaam met een op maat gemaakte hars halve buis (Figuur 1 c), gemaakt met behulp van een 3D-printer.
    Opmerking: Op dag 1 moet de acclimatisatie sessie 5 min lang. Het is vervolgens verhoogd dagelijks tot 10, 20, 40 en 60 min voor dagen 2, 3, 4 en 5, respectievelijk.
  3. Aan het einde van elke sessie, geeft het dier een beloning van voedsel. Als het dier continu tijdens de acclimatisatie worstelt, stoppen de sessie.

4. craniotomy

Opmerking: Na de acclimatisatie, een craniotomy is gemaakt over de regio van de hersenen voor opname. De craniotomy wordt uitgevoerd in het stereotaxic frame onder verdoving, met het hoofd na installatie. De procedure na operatie is hetzelfde als het hoofd installatie post.

  1. Schoon voordat de craniotomy, de schedel met een wattenstaafje met chloorhexidine gluconaat en 70% alcohol.
  2. Zorgvuldig Schraap de schedel over de opname-site met een tandheelkundige boor. Wanneer het bot dun genoeg wordt, snijd het met het topje van de scalpel en verwijderen.
  3. Zet tandheelkundige cement rond het blootgestelde gebied ter versterking van de schedel.
  4. Bestrijken het gebied van de blootgestelde hersenen met siliconen lijm nadat de tandheelkundige cement wordt het moeilijk. De procedure na chirurgie is zoals beschreven in stap 2.8.

5. elektrofysiologische opname

  1. Laat het dier terug te vorderen voor minimaal 1 dag na de craniotomy voordat u de elektrofysiologische opname uitvoert. Plaats het dier in de opname-zaal op dezelfde manier die het werd gedaan tijdens de sessies van de acclimatisering wanneer de opname begint.
  2. Maken van glas pipetten van borosilicaatglas haarvaten (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90.0 mm lang) trok op een trekker van de elektrode. Hun tip diameter is 2-3 µm, en hun weerstand is 4 – 6 MΩ wanneer ze worden gevuld met 10 mM PBS. De lengte van de elektrode is 40 – 50 mm. In sommige opnamen, is 2% neurobiotin toegevoegd aan de 10 mM PBS.
  3. De gevulde glazen pipet hechten aan de houder van de op maat gemaakte optrode.
  4. De Ag-Cl gecoat zilver draad (0.2 mm diameter) gestoken in de glazen pipet. Sluit de zilver draad aan een pin via een dun gecoate elektrische draad. Sluit de pin aan de headstage van de opname-versterker.
  5. Sluit de glasvezel patch kabel (kern = 960 µm, bekleding = 1.000 µm, NB = 0,63) met een Zirkonia verlengstuk (OD = 2,5 mm) naar de split paring mouw op de houder van de optrode. Duw de patch-kabel in de mouw tot het puntje van de verlengstuk contact op met de achterkant van de glazen pipet. De patch-kabel levert het licht (golflengte = 465 nm) van LED. Het LED licht wordt gecontroleerd door een één-kanaals LED-driver.
  6. Verwijder de siliconen lijm over de craniotomy. Put verwarmde zoutoplossing (38 ° C) op het oppervlak van de hersenen regelmatig om te voorkomen dat de hersenen oppervlak drogen tijdens de opnamesessie. Indien nodig, verwijder de dura met scherpe pincet.
  7. De glazen elektrode invoegen in het hersenweefsel met een manipulator. De elektrode weerstand controleren wanneer deze wordt ingevoegd. Vervang de elektrode wanneer de weerstand lager is dan verwacht omdat het puntje van de elektrode kan worden beschadigd. Zoek op de diepte van belang, en de eenheid spikes isoleren door de diepte in stappen van 2 tot en met 5 µm aan te passen.
  8. Nadat de eenheid geïsoleerd is, leveren het LED-licht en observeren de reactie op de lichte stimuli.
  9. Record de neurale activiteiten na de identificatie van de celtypes. De opnames voor 2 – 3 h uitvoeren. Als de opname is gemaakt op opeenvolgende dagen (maximaal 2 dagen), dekking van de craniotomy met siliconen lijm. Wanneer de opname is voltooid, en het dier wordt opgeofferd, ophalen van de post van hoofd en zet het in aceton te wassen en opnieuw gebruiken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In Figuur 2onderzocht wij hebben de effecten van de grootte van de tip en de lengte van de pipetten van glas op de lichte macht op het puntje van de pipetten (figuur 2A-B). De lichte macht werd gemeten door een optische Energiemeter geplaatst 1 mm van het uiteinde. De volledige lengte was ingesteld op 50 ± 2 mm, wanneer de grootte van de tip gevarieerd, terwijl de grootte van de tip was ingesteld op 2,5 µm wannee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetics is een krachtig hulpmiddel in de neurowetenschappen geworden. Het is gebruikt voor het identificeren van specifieke neuron typen in vivo , evenals het manipuleren van de activiteiten van bepaalde neuronale trajecten. De verduidelijking van de neurale activiteiten van verschillende neuronale bevordert het begrip van het mechanisme van de neurale circuits. We toonden hier, een methode om het licht te leveren aan de site van de opname via een glaselektrode in de IC van wakker VGAT-ChR2 muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs werden ondersteund door de Japan-vereniging voor de promotie van wetenschap KAKENHI Grant JP16K11200 en 17H 02223, en de subsidie voor onderzoek van de Kanazawa medische universiteit S2016-8 en C2017-3. Wij danken Yuhichi Kuda voor zijn steun bij het nemen van de foto's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Electrode holderMolecular Device1-HL-Upipettenhouder voor micro-elektrode versterker
Ceramic split mating sleeveThorlabsADAF1f2.5 mm ferrule
Circuit board spacerTeishin DenkiSPA-320f8.0 mm, 20.0 mm lang
Stereotaxic frame voor muizenNarishigeSR-6M-HTStereotaxische instrumenten voor muizen
ManipulatorNarishigeNAHandmatige manipulator
SuperbondSun MedicalM: 204610557Tandheelkundig adhesief harscement
Form2FormlabsNA3D-printer
Kwik-SilWPIKWIK-SILSilicone-adhesief met lage toxiciteit
Borosilicaat glazen capillaireNarishigeGD-1.5OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm lang
Fiber-optic patchcordDoric LensesMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Monofiberoptische patchcord, OD, 2.5 mm, kern = 960 mm, omhulsel = 1000 mm, NA = 0.63
Connectrized LEDDoric LensesLEDC-1B_FCCentrale golflengte = 465 nm, uitgangsvermogen = 45 mW (Kern 960 mm 0.63 NA )
LED driverDoric LensesLEDRV_1CH_10001 ch LED driver, maximale uitgang = 1000 mA
Electrode pullerNarishigePB-7Dubbeltraps glas micropipet puller
Borosilicaat glazen capillairNarishigeGD-1.5Borosilicaat glazen capillair, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm lang
GENTACINMSD CO., Ltd185711173Antibiotische zalf
Terramycin®-LAZoetisG 333Oxytetracycline
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548VGAT-ChR2 muizen
Multiclamp 700BMolecular Devices2500-0157Micro-elektrode versterker

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  2. Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).
  3. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
  4. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757(2016).
  5. Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
  6. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099(2009).
  7. Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
  8. Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
  9. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
  10. Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
  11. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  12. Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
  13. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
  14. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  15. Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
  16. LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
  17. Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
  18. Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuronale identificatieelektrofysiologische registratieglasvezelpatchkabelfixatie van de hoofdklemcraniotomieprocedureVGAT Channelrhodopsin IIspike responregistratie

Gerelateerde artikelen